李愛萍 崔書強 徐金成 高頎 趙杰修

1北京體育大學（北京 100084） 2國家體育總局體育科學研究所

許多研究證明，高溫和運動均可以誘導心肌組織HSP70表達[1-3]。HSP70的高表達有利于機體組織對抗損傷，進而對機體組織的損傷進行一定的修復。心臟既是循環(huán)動力器官同時也是內(nèi)分泌器官，其分泌的心鈉素可以調(diào)節(jié)體液平衡維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。血漿心鈉素的升高是機體的一種保護性代償反應，可以改善組織中血液供應，防止血壓過度升高。運動對血漿心鈉素（ANP）的影響不僅和運動強度有關(guān)，還和訓練程度及運動時間密切相關(guān)。因?qū)嶒灄l件的不同，有關(guān)高溫對血漿心鈉素影響的研究結(jié)果也并不一致[4]。目前有關(guān)高溫環(huán)境下急性力竭運動對機體HSP70和血漿心鈉素影響的研究鮮有報道，因此本研究觀察了在高溫環(huán)境下進行急性力竭運動對大鼠心肌組織HSP70的表達和血漿心鈉素的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley大鼠60只，8周鼠齡，體重230～250克，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量合格證號為SCXK（京）2007-0001，級別:清潔級。在動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)，每籠5只。室溫調(diào)節(jié)為23℃±1℃，相對濕度50%±5%，每日采用燈光照明，12小時晝夜節(jié)律變化。動物滅菌墊料和標準嚙齒類動物維持期標準滅菌飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號SCXK（京）2005-0007。滅菌水飼養(yǎng)，大鼠籠內(nèi)自由飲食飲水，墊料酌情兩天更換一次。

1.2 實驗方法

1.2.1 適應訓練和動物分組

60只大鼠適應性喂養(yǎng)1天后，根據(jù)文獻[5]，均進行6天適應性遞增負荷跑臺訓練。跑臺起始速度為15米/分鐘，訓練30分鐘，第2天速度增加到為20米/分鐘，訓練30分鐘，第3天開始速度每日增加2米/分鐘，訓練時間每日增加5分鐘，到第6天跑臺速度逐漸增加到28米/分鐘，訓練時間增加到60分鐘。

訓練后經(jīng)篩選，挑選符合運動條件的大鼠進行正式實驗。將篩選后符合運動條件的48只大鼠隨機分為6組:安靜對照組（C組，294.3±11.5g）、運動后即刻組（E組，295.2±10.4g）、高溫運動后即刻組（HE 組，292.6±9.9g）、高溫暴露1小時后即刻組（H組，298.8±8.7g）、運動后24小時恢復組（E’組，287.8±14.9g）和高溫運動后 24小時恢復組（HE’組，289.1±14.26g），每組 8只，各組大鼠體重之間無顯著性差異（P>0.05）。

1.2.2 正式實驗方案

第6天訓練后，所有大鼠均休息24小時。于第8天開始進行一次性力竭運動。采用國家體育總局體育科學研究所的高溫高濕低氧環(huán)境實驗房控制實驗環(huán)境溫度和濕度。安靜對照組大鼠于動物房中飼養(yǎng)。E組及E’組大鼠進行跑臺運動，坡度為0，速度為28m/min，周圍環(huán)境溫度為23℃，相對濕度為50%。HE組及HE’組大鼠也進行跑臺運動，坡度為0，速度為 28m/min，周圍環(huán)境溫度為33℃，相對濕度為50%。H組于周圍環(huán)境溫度33℃、相對濕度50%的條件下暴露1小時。力竭標準為大鼠跟不上跑臺跑速，不能堅持原跑速，滯留、俯臥在跑道后格柵處30秒以上，木棍等輕微刺激驅(qū)趕無效。在運動中盡量減少人為以及外界光電等因素對大鼠的刺激。

1.2.3 取材與測試

安靜組、運動后即刻組、高溫運動后即刻組及高溫暴露1小時組均在力竭運動后即刻宰殺。運動后24小時恢復組和高溫運動后24小時恢復組均在室溫下恢復24小時后宰殺。采用數(shù)字溫度計（北京司南儀器廠）測量大鼠運動前后的肛溫，以代表大鼠的核心體溫。記錄大鼠運動到力竭的時間。

2%戊巴比妥鈉按照0.25ml/100g體重劑量進行腹腔麻醉，待大鼠麻醉后，固定好四肢，剖開腹腔，暴露內(nèi)臟，選取腹主動脈取血，其中1ml放入事先放好抑肽酶和EDTA的離心管中，4℃、3800轉(zhuǎn)/分進行離心，留取上清，置于－70℃保存待測心鈉素。其余血液室溫靜置后37℃水浴20分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心25分鐘后分離血清，分裝后置于－70℃保存待測CK-MB。同時在冰盤上取出大鼠心臟，實驗中由同一人分離左右心房與左右心室，錫紙包裹，液氮急凍，分裝后－70℃保存，取左心室待測HSP70。

在每組8個樣本中隨機選取6個樣本，采用Western blotting方法測試大鼠左心室肌 HSP70。一抗為[ABCAM Mouse monoclonal[BRM-22]（ab6535）]、HRP 二抗（ZB-2301，北京中杉）。心鈉素放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，采用放免法測試大鼠血清心鈉素含量。CK-MB購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司，采用速率法測試。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，各指標數(shù)值均以平均數(shù)±標準差（±s）表示。采用析因方差分析方法分析實驗中因素的作用，對有顯著性作用的因素，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 力竭運動時間

運動后即刻組大鼠力竭運動時間為148.6±25.5分鐘，運動后24小時恢復組為130±24.1分鐘，二者之間無顯著性差異（P>0.05）；高溫運動后即刻組為52±14.6分鐘，高溫運動后24小時恢復組為48±10.7分鐘，二者之間無顯著性差異（P>0.05）；運動后即刻組與高溫運動后即刻組力竭時間有顯著性差異（P<0.01）。運動后24小時恢復組與高溫運動后24小時恢復組力竭時間有顯著性差異（P<0.01）。

2.2 溫度和運動對心肌組織HSP70、血漿ANP，血清CK-MB的影響

析因分析（表1）顯示，溫度對心肌組織HSP70表達有顯著影響，運動時程對 HSP70、ANP、CK-MB表達均有顯著影響，但上述兩個因素對三指標的影響無交互作用。

表1 溫度和運動對HSP70、ANP、CK-MB表達的影響

HSP70表達量如圖1和表2所示:與C組相比，E組和 E’組 HSP70表達量顯著升高（P<0.05，P<0.01）；HE’組顯著高于H組（P<0.01）。HE組與H組、HE’組之間，E’組與E組之間均無顯著性差異（P>0.05）。H組顯著高于 C 組（P<0.01）。HE’組顯著高于 E’組（P<0.01）。高溫與運動的聯(lián)合作用有使蛋白表達增加的趨勢，但二者的協(xié)同作用無統(tǒng)計學意義。

表2 各組心肌組織HSP70表達比較

由析因分析可知，溫度對不同組別大鼠血漿心鈉素無顯著影響。單因素方差分析結(jié)果如表3所示，與C組比，E組顯著升高（P<0.01）；HE組顯著高于 H組（P<0.01）；E’組和HE’組分別比 E組和HE組顯著降低（P<0.01）。E’組與C組相比無顯著性差別，HE’組與H組相比無顯著性差別。

表3 各組血漿ANP及血清CK-MB的表達比較

與C組相比，E組血清 CK-MB顯著升高（P<0.01），HE組顯著高于H組（P<0.05）。而溫度對CK-MB無顯著性影響。E’組顯著低于C組（P<0.05）和E組（P<0.01），HE’組顯著低于 HE組（P<0.01）。

3 討論

很多研究表明，誘導型HSP70（HSP72）僅分布在應激細胞中，受到應激時大量表達以對抗各種應激。HSP70是機體內(nèi)源性保護機制，可以對抗多種應激對細胞造成的損傷，被認為是抗損傷蛋白，參與損傷修復過程，而且多種條件都可誘導HSP70[6]。有報道顯示，只有在跑速大于等于24m/min的情況下心肌組織HSP70表達量才顯著升高[1]。而且心肌組織中HSP70的基礎表達與訓練程度呈正相關(guān)[7]。本實驗采用28m/min的跑速運動導致了E組和H組心肌HSP70表達顯著高于C組，提示溫度誘導了熱休克蛋白大量增加，這與其它研究結(jié)果一致[8]。本實驗結(jié)果顯示，HE組HSP70表達雖比E組有所升高，但無顯著差異，HE’組在24小時恢復后顯著高于E’組，提示高溫環(huán)境可能增強了力竭運動引起的HSP70高表達，從而對抗各種應激對細胞造成的損傷。

血漿心鈉素可以調(diào)節(jié)和緩沖運動中血壓的變化，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，擴張血管以增加心肌和運動肌肉中血液供應，促進有氧耐力水平[9－11]，改善心肌功能。研究表明，一次性力竭運動大鼠和耐力訓練后再進行力竭運動大鼠運動后血漿心鈉素均顯著升高，提示力竭運動造成了心肌組織缺血[12]。本實驗未直接觀察心肌組織形態(tài)變化，但血清CK-MB被認為是心肌損傷的標志。Ohba等的研究也表明，血漿心鈉素含量過度增高提示有潛在性心肌受損的可能[13]。本實驗中，E組CK-MB水平顯著增加，E組和HE組心鈉素水平分別顯著高于C組和H組，提示運動造成心鈉素水平顯著增加，故推測這可能可以改善心肌血液供應，但同時也存在心肌受損的潛在可能[14]。HE組心鈉素水平與E組無顯著性差異，提示高溫環(huán)境并未增強力竭運動所致的心鈉素水平的增加，這可能和HE組運動時間較短有關(guān)。24小時后E’組和HE’組心鈉素水平分別顯著低于E組和HE組，推測可能隨著24小時后HSP70表達水平的增加，HSP70參與了損傷修復，緩解了心肌組織受損程度，因而心鈉素水平有所降低。

4 總結(jié)

高溫和運動均會誘導心肌HSP70高表達且24小時后表達最高，高溫環(huán)境增強了力竭運動引起的HSP70高表達，這可能對高溫及運動后造成的心肌損傷有一定的修復作用。力竭運動即刻血漿心鈉素升高，改善了心肌血液供應，但同時也提示心肌有潛在受損的可能，但高溫環(huán)境并未加強力竭運動所致的心鈉素水平的增加。

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