劉曉健 趙玉定 趙松蘭

(江蘇大學附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 江蘇 鎮(zhèn)江 202002)

解脲支原體(UU)是女性生殖器感染的重要致病因子,可導致胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)感染、產(chǎn)褥期感染等。本研究探討UU的致病因素脂質(zhì)相關膜蛋白(LAMPs)刺激絨毛膜產(chǎn)生的hBD-2表達的關系。

1 材料與方法

1.1 凍干Uu3標準株

由中心實驗室提供。

1.2 解脲支原體菌液接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期,傳代2～3次后提取其LAMPs。

1.3 LAMPs提取

按照有關參考文獻的方法進行,對數(shù)期的UU培養(yǎng)液離心后,沉渣置入37℃水浴箱中孵育使其發(fā)生相分離,第二次相分離結束,收集沉淀LAMPs,BCA測定蛋白濃度后備用。

1.4 實驗標本

取自10例健康的因社會因素晚孕引產(chǎn)婦女絨毛膜組織,將其剪碎成糊狀在冰生理鹽水中反復吹洗后稱取組織(濕重)300mg,均勻接種于培養(yǎng)瓶。

1.5 培養(yǎng)液為高糖型條件下培養(yǎng)24h,除去未貼壁細胞并換入新鮮培養(yǎng)液。每日更換培養(yǎng)液,原代的細胞80%匯合后,PBS洗1次,胰蛋白酶消化后,吹打成單細胞,以1.0×105/mL接種于新的培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)。

1.6 LAMPS刺激試驗

絨毛膜細胞于細胞培養(yǎng)板6孔板中密度為5×105/mL,每孔細胞加入不同濃度(0,0.1,1,2,3ug/L)的LAMPS加以刺激,提取細胞總RNA及細胞胞漿蛋白,每個實驗均重復。

1.7 RT-PCR檢測hBD-2 mRMA表達

上皮細胞總RNA的提取采用上海飛捷生物公司的總RNA極速抽提試劑盒,按其說明進行。 引物設計根據(jù)Genbank hBD-2cDNA序列,設計特經(jīng)檢查擴增片段均跨躍內(nèi)含子hBD-2跨內(nèi)含子引物:上游5-CCA GCC ATC AGC CAT GAG GGT-3, 下游5-GGA G CC CTT TCT GAA TCC GCA-3, 產(chǎn)物長255bp,符合內(nèi)參照,擴增片長度為RT-PCR要求,同時用PCR試劑盒里看家基因GAPDH引物為544bp。RT-PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳,紫外線下觀察結果,并攝相。取誘導因素刺激過的細胞提取總蛋白,測定蛋白質(zhì)濃度,電泳hBD-2蛋白,電轉印后Western blotting檢測,出現(xiàn)條帶后觀察、照相。

1.8 統(tǒng)計分析

2 實驗結果

LAMPs能明顯誘導絨毛膜產(chǎn)生hBD-2,HBD-2mRNA表達與LAMPs濃度呈明顯的劑量依賴性。相同濃度的 LAMPS刺激絨毛膜12h,24h后絨毛膜的HBD-2mRNA表達呈現(xiàn)出時間依賴性。用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析表中數(shù)據(jù),LAMPs與細胞內(nèi)sBD-2基因相對表達量的關系,P<0.05顯著差異,添加不同濃度LAMPs,sBD-2基因的相對表達量均有顯著差異,其中添加LAMPs3μg/mL與LAMPs0.1μg/mL之間差異極顯著,而且2個不同培養(yǎng)時間之間略有差異。結果表明在較低的濃度下,LAMPs濃度與sBD-2基因相對表達量變化基本呈正相關。

表1 添加不同濃度LAMPs對絨毛膜sBD-2基因在不同時間表達的影響

3 討論

UU缺乏細胞壁,細胞膜是UU與外界環(huán)境發(fā)生相互作用的唯一結構,細胞膜由脂質(zhì)雙層和膜蛋白組成,一類為膜本體蛋白,另一類外周膜蛋白。膜本體蛋白和外周膜蛋白統(tǒng)稱為脂質(zhì)相關膜蛋白(LAMPS),是暴露在表面與周圍環(huán)境各種成分不斷相互作用因是影響機體免疫系統(tǒng)的一種主要蛋白。該膜蛋是介導支原體黏附宿主細胞表面,進入侵宿主細胞導致細胞受損與死亡的物質(zhì)基礎。因此對支原體LAMPS的研究是了解UU入侵宿主后與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關鍵。孕期UU感染與胎膜早破密切相關[1],而支原體感染者發(fā)生胎膜早破是正常分娩者的8倍[2]。宮內(nèi)感染UU造成絨毛受損,最終導致妊娠終止,其機制可能與Uu產(chǎn)生的磷酯酶A、C促使細胞膜中游離的花生四烯酸釋放,而花生四烯酸是前列腺素的必需前體物質(zhì),能損傷胚胎組織及其附屬物而影響妊娠結局[3]。實驗證實Uu產(chǎn)生的高分子質(zhì)量物質(zhì)能刺激宿主免疫活性細胞產(chǎn)生釋放多種細胞因子而造成絨毛膜的局部免疫損傷,這些都可以導致病理妊娠的發(fā)生。

防御素2在正常女性陰道、子宮頸、子宮內(nèi)膜、輸卵管、卵巢、絨毛膜、絨毛及胎盤組織中廣泛表達[4],提示防御素2的基因表達調(diào)控、生物學活性對于維系正常婦女及孕婦生殖道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、宿主天然抗感染機制中起著重要的作用。宮頸粘液具有強大而廣譜的抗菌活性,防御素在子宮頸組織中固有表達,是子宮頸抗感染作用的重要介質(zhì)[5]。

β-防御素毫摩爾濃度時具有殺傷細菌的能力,納摩爾濃度時就具有趨化活性,具有間接的免疫啟動作用,在較低的分子濃度下,β-防御素能夠與這些細胞表面特異性的趨化因子受CCR6相結合,趨化這些細胞朝著受致病微生物侵襲的皮膚或粘膜病灶部位遷移,從而提高機體抵抗微生物感染的獲得性免疫反應水平。

本實驗發(fā)現(xiàn)β-防御素-2在正常產(chǎn)婦絨毛膜組織中表達量較低,LAMPs能明顯誘導絨毛膜產(chǎn)生hBD-2,HBD-2mRNA表達與LAMPs濃度與刺激時間呈明顯的依賴性。Ganz等在純化的防御素對人及小鼠腫瘤的作用中發(fā)現(xiàn),其活性由微絲、鈣調(diào)節(jié)蛋白和溶酶體調(diào)節(jié),裂解作用呈劑量和時間依賴性。目前在對β-防御素表達分泌量的影響、作用機理研究還不很清楚,有待進一步研究。

[1]林娟,翁云欽,鄭巧玲,等.504例妊娠婦女性傳播感染疾病相關行為分析[J].中國婦幼保健雜志.2005,20(3):3587.

[2]樂杰.婦產(chǎn)科學[M].第5版,北京：人民衛(wèi)生出版社,2000:164.

[3]王敬云,劉杰.支原體感染與妊娠[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2001,17(12):713～715.

[4]馮艷,潘小玲,黃寧,等.女性生殖道人Beta-防御素基因的表達[J].中國病理生理雜志,2003,19(11):1564.

[5]陳新年,黃寧,吳琦,等.β-防御素-2基因在子宮頸的固有表達[J].中國病理生理志,1999,8(6):741.