武靜靜,劉 軍,鄭 偉,潘艷艷,李 瑩,劉力源,姜懿凌,曹雅明,鄭 麗

2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科,沈陽 110016;

3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科,沈陽 110016

瘧疾感染早期,保護性免疫應(yīng)答的建立有賴于CD4+T細(xì)胞的有效活化〔1〕,不同亞群 CD4+T細(xì)胞的活化和抗原提呈細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子密切相關(guān)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)產(chǎn)生IL-12誘導(dǎo)以IFN-γ分泌增加為主的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答,對夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabaudi chabaudiAS,P.c.chabaudiAS)感染的控制和清除至關(guān)重要〔2〕。然而,過強的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答,尤其是IFN-γ參與的炎癥應(yīng)答,與免疫病變的發(fā)生密切相關(guān)〔3〕。同時,有研究顯示,DCs分泌的IL-10和TGF-β明顯抑制肝階段 T細(xì)胞介導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答〔4〕。因此,DCs在瘧疾感染早期可能通過分泌不同種類的細(xì)胞因子參與易感和抵抗小鼠Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)控。

本研究利用成功建立的P.c.chabaudiAS感染的DBA/2和BALB/c小鼠模型,采用磁珠純化的方法分離DCs并進行體外培養(yǎng),ELISA方法檢測DCs培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-12p40、IL-10和TGF-β1的分泌水平,以期探討瘧疾感染早期DCs前炎性和免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的分泌特點,旨在明確DCs對Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 瘧原蟲及實驗動物感染 6-8w齡、雌性DBA/2和BALB/c小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供,許可證編號：SCXK京200420001)經(jīng)腹腔感染1×106P.c.chabaudiAS(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈)寄生的紅細(xì)胞(Parasitized Red Blood Cell,pRBC),感染不同時間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血,制備薄血膜,Giemsa染色,鏡檢計數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2 脾DCs的純化和培養(yǎng) 無菌取出感染前和感染后3d、5d、8d小鼠脾臟,常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液,用0.17mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。按文獻〔5〕方法,從小鼠脾細(xì)胞中純化DCs,培養(yǎng)48h后收集上清,-80℃保存,待細(xì)胞因子IL-12p40 、IL-10 和 TGF-β1檢測 。

1.3 細(xì)胞因子的檢測 用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測 DCs培養(yǎng)上清中 IL-12p40、IL-10和TGF-β1的分泌水平。酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1Ls軟件分析,計算細(xì)胞因子含量(pg/m1)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件,單因素方差分析比較各組均值的顯著性差異,P＜0.05為差異顯著(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié) 果

2.1 兩種小鼠感染后不同時間的蟲體血癥水平及生存率 感染后4d,兩種小鼠外周血中均出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞,且感染后前9d,原蟲血癥水平呈相同的上升趨勢。BALB/c小鼠原蟲血癥水平至感染后9d達峰值后迅速下降,并于感染后21d左右自愈,其生存率100%;相比而言,DBA/2小鼠的紅細(xì)胞感染率至感染后9d達峰值后也迅速下降,70%～80%的小鼠死亡,幸存小鼠不能清除感染,有低水平的蟲體血癥,見圖1。

圖1 DBA/2與BALB/c小鼠感染后不同時間蟲體血癥水平及生存率Fig.1 The parasitemia and survival rate of DBA/2 and BALB/c mice at different time points after infection

2.2 兩種小鼠感染后不同時間DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平 感染后3d-5d,DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平出現(xiàn)顯著升高(P＜0.05或P＜0.01),感染后第 8d達峰值(P＜0.01)。相比,BALB/c小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平從感染后5d出現(xiàn)有意義的升高,8d達峰值(P＜0.05),但在感染后3d-8d其水平均明顯低于DBA/2小鼠(P＜0.05或P＜0.01),見圖2。

2.3 兩種小鼠感染后不同時間DCs培養(yǎng)上清中IL-10的水平 感染后第5d,兩種小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-10的分泌水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),并于感染后第8d達到最高水平(P＜0.05或P＜0.01);在感染后第5d和第 8d,DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-10的分泌水平均明顯低于BALB/c小鼠(P＜0.05),見圖3。

2.4 兩種小鼠感染后不同時間DCs培養(yǎng)上清中TGF-β1的水平 感染后第5d,兩種小鼠DCs培養(yǎng)上清中TGF-β1的分泌水平明顯升高(P＜0.01),并于感染后第8d達到最高水平(P＜0.01);在感染后第 5d和第 8d,DBA/2小鼠 DCs培養(yǎng)上清中TGF-β1的分泌水平均明顯低于BALB/c小鼠(P＜0.05),見圖4。

3 討 論

瘧疾感染早期有效的 Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的建立和維持對于控制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖和宿主的存活至關(guān)重要〔6-7〕,然而過度的 Th1應(yīng)答也會對小鼠造成一定的病理損傷如引發(fā)肝損傷〔8〕。DCs在誘導(dǎo)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著舉足輕重的作用,活化的DCs通過分泌不同種類的細(xì)胞因子來參與調(diào)控Th1/Th2免疫應(yīng)答〔9〕。瘧疾感染過程中,DCs分泌的IL-12是啟動Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子〔2〕。本實驗結(jié)果顯示,感染后第3-8d,DBA/2小鼠與BALB/c小鼠DCs分泌的IL-12水平均呈逐漸增高趨勢,但DBA/2小鼠DCs分泌的IL-12水平顯著高于BALB/c小鼠。以上結(jié)果充分提示,P.c.chabaudiAS感染易感型DBA/2和抵抗型BALB/c小鼠之后,兩種小鼠均成功建立了Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答,并且這種初步建立的Th1免疫應(yīng)答差異明顯依賴于IL-12分泌的數(shù)量。

圖4 DBA/2和BALB/c小鼠感染后不同時間脾臟DCs培養(yǎng)上清中TGF-β 1水平;**P＜0.01表示與正常對照組相比差異顯著,#P＜0.05表示DBA/2與BALB/c小鼠之間的比較Fig.4 The levels of TGF-β1 in DCs supernatants from DBA/2 and BALB/c mice at different time points after infection;**：P＜0.01 indicates the significant difference compared with control mice(non-infected mice,0d),#P＜0.05 indicates the comparison between DBA/2 and BALB/c mice

免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和 TGF-β在多種細(xì)胞內(nèi)病原體(包括瘧原蟲)感染過程中,主要通過免疫抑制作用參與免疫應(yīng)答的調(diào)控。本實驗結(jié)果顯示,感染后3～8d,兩種小鼠DCs分泌的 IL-10和TGF-β1的水平均呈逐漸升高趨勢,感染后5-8d出現(xiàn)有意義升高,并且BALB/c小鼠DCs分泌的IL-10與TGF-β1水平明顯高于DBA/2小鼠。由此提示,BALB/c小鼠正是由于分泌IL-10和TGF-β1的DCs的適度活化,使其Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答能夠維持在適宜水平。DBA/2小鼠DCs不能分泌足夠的抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1,使其Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答過強,從而導(dǎo)致免疫病理損傷。因此,分泌免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1的DCs的活化強度和時相明顯影響著Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平和效應(yīng)強度。

綜上所述,BALB/c小鼠和DBA/2小鼠在DCs細(xì)胞因子的分泌模式上存在顯著差異。而這種差異性也進一步提示,DCs分泌的前炎性細(xì)胞因子IL-12和免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1之間處于動態(tài)平衡模式中,而這一平衡模式明顯決定著Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)控。

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