楊 巍,師長宏,趙佐慶,趙 勇,江 鷹

2.第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院實驗外科,

卡介苗(BCG)是目前唯一用于結(jié)核病(TB)預防的疫苗,但其保護效果不穩(wěn)定。近年來,由于結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥株的流行與HIV的合并感染以及人口流動的增加等因素,進一步加劇MTB對人類健康的威脅,因此迫切需要研制新型有效的TB疫苗。Ag85B是BCG和MTB及其它分枝桿菌最主要的分泌蛋白〔1〕,也是BCG在體內(nèi)發(fā)揮生物學作用的主要成分,能夠誘導機體強烈的Th1免疫反應〔2〕;Hsp16.3是MTB在休眠期間表達量增加最多的蛋白,它與M TB的休眠及潛伏感染密切相關(guān)〔3〕。進一步實驗表明多個保護性抗原聯(lián)合免疫可提高機體免疫應答水平,誘導與BCG相當?shù)谋Ｗo力,提示多價疫苗可能是提高TB疫苗有效性的一種新策略〔4〕。鑒于此,本研究對MTB不同時期表達的兩種重要保護性抗原Ag85B和Hsp16.3進行融合表達,以便進一步研究其在結(jié)核病基因工程疫苗中的應用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌E.coliDH5α,由本中心保存;克隆載體pMD18-T質(zhì)粒購自大連T akara公司;表達載體pProEX H Ta質(zhì)粒購自Invitrogen公司。

1.2 試劑 TaqDNA聚合酶,T4-DNA連接酶,限制性內(nèi)切酶EcoRI、ClaI、HindIII及 DNA 標記物DL 2000均購自大連T akara公司;IPTG購自Sigma公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自百泰克公司;Ag85B多克隆抗體和H sp16.3單克隆抗體購自Abcam公司;HRP標記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和羊抗人IgG購自北京鼎國生物公司;純化Ag85B-Hsp16.3的融合蛋白由本實驗室制備;含有Ni+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒購自Invintrogen公司;其余一般化學試劑均為國產(chǎn)分析純。TB陽性病人血清來自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科。

1.3 目的基因的擴增 重組質(zhì)粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6 由本中心保存〔5〕,其中 Ag85B 、ESAT6的酶切位點分別是EcoRI和ClaI、ClaI和HindIII,鑒定正確;hsp16.3基因以本中心保存的pProEX HT b-Hsp16.3 質(zhì) 粒為 模板〔6〕,根據(jù) Gen-Bank中公布的結(jié)核分枝桿菌hsp16.3基因序列設(shè)計引物。為保證這兩種蛋白融合表達時具有各自的空間構(gòu)象和正確折疊,在hsp16.3基因上游引物引入了48bp的疏水柔性鏈接頭(linker)。引物如下：

P1：5'-GAATCGATGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAG GATCAATGGCCACCACCCT TC-3'含ClaⅠ酶切位點(下劃橫線);

P2：5'-TCAAAGCTT TCAGTTGGTGGACCGGATC-3'含HindIII酶切位點(下劃橫線)。PCR 反應體系為 ：10 ×buffer 5μ L,dN TPs 4μ L(2.5 mmol/L),DNA 模板1μ L,兩對P1、P2引物各1μ L 及Taq酶1μ L,加水至50μ L。PCR 反應條件：94℃變性 3 min,94℃45s,60℃45s,72℃50s,共 30個循環(huán),最后再于72℃延伸5 min,回收PCR產(chǎn)物。

1.4 目的基因的克隆與測序 T4連接酶將PCR產(chǎn)物與 pMD18-T克隆載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。隨機挑取3個菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃震蕩培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒DNA,并用ClaI和HindIII雙酶切進行鑒定,觀察有無目的片段。將篩選出的陽性克隆進行測序(由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測序)。將測序正確已含有l(wèi)inker和hsp16.3基因的pMD18-T克隆載體記作pMD18-T-L-Hsp16.3。

1.5 含目的基因表達載體的構(gòu)建及目的基因的誘導表達 提取測序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-TL-Hsp16.3,經(jīng)ClaI和HindIII雙酶切后,回收目的基因條帶命名為L-Hsp16.3。將本中心保存的測序正確的 pProEX HT a-Ag85B-ESAT6質(zhì)粒經(jīng)ClaI和HindIII雙酶切,回收大片段命名為 pProEX HTa-Ag85B,連接同樣雙酶切的L-Hsp16.3片段,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,隨機挑選3個菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃過夜培養(yǎng)活化,提質(zhì)粒用EcoRI和HindIII進行雙酶切鑒定,陽性克隆命名為 pProEX HTa-Ag85B-Hsp 16.3。將此陽性菌再活化后以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)2～3h,1mmol/L IPTG誘導4 h,離心回收菌體沉淀,分別加入100μ L的去離子水與100μ L還原性2×電泳上樣緩沖液,煮沸10min,離心后取10μ L上清進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,觀察目的蛋白的表達。

1.6 融合蛋白 Ag85B-Hsp16.3的 Western-blot測定 將上述表達產(chǎn)物進行12%SDS-PAGE后,100V恒壓電轉(zhuǎn)1h,用麗春紅染色,觀察蛋白電轉(zhuǎn)是否成功,然后用蒸餾水洗至無色,l0g/L牛血清白蛋白封閉2h,然后分別與兔抗的Ag85B多克隆抗體和鼠抗的Hsp16.3單克隆抗體以及活動期結(jié)核病人血清結(jié)合過夜,TBST搖床震蕩洗滌3次,每次5～10min,分別與加HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠和羊抗人 IgG結(jié)合 1h,TBST搖床震蕩洗滌3次,TBS搖床震蕩洗滌3次,用OPD(鄰苯二胺)顯色液顯色并觀察結(jié)果。

1.7 融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的純化 采用含有Ni+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒純化目的蛋白,將100mL誘導后的菌液離心,制備上柱樣品,按照說明書中的方法進行親和層析純化,收集洗脫液,進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因Hsp16.3的擴增、克隆及酶切鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示Hsp16.3基因的PCR產(chǎn)物大小在 483bp左右(Hsp16.3基因為 435bp,含48bp的linker),與Hsp16.3的基因預期大小相符見圖1。

重組克隆質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小為1 338 bp左右的片段(Ag85B基因為855bp,Hsp16.3基因為 435bp,含 48bp的 linker),證明pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3構(gòu)建成功見圖 1。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的 Ag85BHsp16.3基因一致。

圖1 重組質(zhì)粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3的酶切鑒定1：DNA標記物 DL2000;2：重組質(zhì)粒 pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3以EcoRⅠ 和 HindⅢ 雙酶切;3：重組質(zhì)粒 pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3以ClaⅠ和HindⅢ 雙酶切;4：重組質(zhì)粒 pProEX HTa-Ag85BHsp16.3以EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切Fig.1 Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by endonuclease digestion1：DNA marker DL2000;2：Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by EcoRⅠand HindⅢ digestion;3：Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by ClaⅠ and HindⅢ digestion;4：Recombinantplasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp 16.3 by EcoRⅠ and ClaⅠ digestion

2.2 Ag85B-Hsp16.3基因的誘導表達及純化結(jié)果

重組菌誘導前后表達產(chǎn)物的SDS-PAGE顯示,誘導的重組菌在約49 kDa處有一蛋白條帶,同預計的大小相吻合,而未誘導菌無此條帶。親和層析法純化得到的蛋白濃度為 0.7546mg/mL,經(jīng) SDSPAGE檢測,可見同樣大小的蛋白條帶見圖2。

2.3 表達產(chǎn)物與單抗的Western-blot鑒定 結(jié)果顯示,無論是使用兔抗 Ag85B的多抗還是鼠抗Hsp16.3的單克隆抗體在相對分子量約為49 kDa處均有一條表達帶見圖3,表明Ag85B-Hsp16.3表達產(chǎn)物包含了兔抗Ag85B抗體和鼠抗Hsp16.3抗體的結(jié)合表位。

2.4 表達產(chǎn)物與活動期結(jié)核病人血清的Westernblot鑒定 結(jié)果顯示,在相對分子量約為49 kDa處有一條表達帶見圖3,說明TB病人血清與Ag85BHsp16.3表達產(chǎn)物具有較好的反應性。

2.5 表達產(chǎn)物的可溶性檢測 在重組表達菌液中加入胍裂解液,用超聲波細胞粉碎機進行超聲裂解后,離心,分別取上清和沉淀進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS2PAGE)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達的融合蛋白主要以不可溶狀態(tài)(包涵體)存在,可獲得單一的純化條帶。

3 討 論

近年來,國內(nèi)外學者圍繞新型Tb疫苗方面開展了一系列研究,其中包括亞單位疫苗和DNA疫苗,但這些研究大多是針對M TB單個免疫保護性抗原進行的,其免疫保護效果并不十分理想〔7〕。研究表明包含多個免疫保護性抗原的多價疫苗可能是提高其有效性的一種新策略〔4〕。鑒于此,本研究對MTB兩種重要免疫保護性抗原Ag85B和Hsp16.3進行融合表達,以期誘導廣泛而全面的免疫應答。

Ag85復合物(Ag85A、Ag85B和Ag85C)是牛分枝桿菌、BCG及MTB培養(yǎng)濾液中的主要分泌性蛋白,該復合物屬于分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶,在MTB細胞壁合成的晚期起關(guān)鍵作用〔8〕。其中Ag85B誘導的細胞免疫反應最強,是抗結(jié)核免疫中的重要保護性抗原,其抵抗結(jié)核分枝桿菌再感染的能力優(yōu)于BCG〔9〕?；顒悠诮Y(jié)核患者血清中的Ag85B水平比其他分枝桿菌疾病患者和健康對照者高50～150倍〔10〕。Ag85B還可誘導PPD陽性健康人群外周血單個核細胞分泌高水平的IFN-γ,而活動期肺結(jié)核患者的外周血單個核細胞分泌IFN-γ的水平極低,也進一步表明Ag85B是機體重要的保護性靶抗原〔11〕。

Hsp16.3最初被認為是免疫顯性蛋白,后被確定是MTB重要的膜蛋白,位于結(jié)核休眠菌增厚的膜上,其高度表達與休眠菌的形成和生存息息相關(guān)?；蚯贸龑嶒灐?2〕證明 Hsp16.3是MTB穩(wěn)定存在不可缺少的蛋白,結(jié)果顯示如果沒有該蛋白的表達,MTB無論在骨髓分離的巨噬細胞還是在T HP-1細胞系中都將受損而難以生存,更不可能長期休眠。Aparna Khera等〔13〕用表達 Hsp16.3、ESAT-6 和超氧化物歧化酶A的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠和豚鼠后,用H37Rv進行攻擊,與空質(zhì)粒相比,誘發(fā)了強烈的免疫應答反應和免疫保護力。雖然Hsp16.3誘導的免疫應答及產(chǎn)生的保護力低于超氧化物歧化酶 A,但是高于 ESAT-6?？梢?Hsp16.3有望成為新型結(jié)核疫苗的靶抗原,尤其是針對潛伏感染的新型TB疫苗。

由于Ag85B是MTB活動期分泌的重要蛋白,而Hsp16.3在休眠期高度表達,二者融合產(chǎn)物應該是對活動期結(jié)核和休眠期結(jié)核都具有較好的保護效力。本研究在Ag85B和Hsp16.3兩個基因之間,引入了一段編碼l6個氨基酸的疏水肽段,這段柔性肽的分子極性小,且富含甘氨酸和絲氨酸,易于彎曲,具有一定的彈性,能保證兩種蛋白正確地折疊,從而確保兩種蛋白具有各自獨立的功能。實驗中純化的融合蛋白用兔抗Ag85B多抗和鼠抗Hsp16.3單抗進行免疫鑒定,結(jié)果均呈現(xiàn)清晰的陽性反應條帶,證實純化的蛋白為預期的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。純化的融合蛋白與活動期結(jié)核病人血清具有較好的反應性,為進一步研究該融合蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

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