楊 巍,師長宏,趙佐慶,趙 勇,江 鷹

2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科,

卡介苗(BCG)是目前唯一用于結(jié)核病(TB)預(yù)防的疫苗,但其保護(hù)效果不穩(wěn)定。近年來,由于結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥株的流行與HIV的合并感染以及人口流動(dòng)的增加等因素,進(jìn)一步加劇MTB對人類健康的威脅,因此迫切需要研制新型有效的TB疫苗。Ag85B是BCG和MTB及其它分枝桿菌最主要的分泌蛋白〔1〕,也是BCG在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的主要成分,能夠誘導(dǎo)機(jī)體強(qiáng)烈的Th1免疫反應(yīng)〔2〕;Hsp16.3是MTB在休眠期間表達(dá)量增加最多的蛋白,它與M TB的休眠及潛伏感染密切相關(guān)〔3〕。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明多個(gè)保護(hù)性抗原聯(lián)合免疫可提高機(jī)體免疫應(yīng)答水平,誘導(dǎo)與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)力,提示多價(jià)疫苗可能是提高TB疫苗有效性的一種新策略〔4〕。鑒于此,本研究對MTB不同時(shí)期表達(dá)的兩種重要保護(hù)性抗原Ag85B和Hsp16.3進(jìn)行融合表達(dá),以便進(jìn)一步研究其在結(jié)核病基因工程疫苗中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌E.coliDH5α,由本中心保存;克隆載體pMD18-T質(zhì)粒購自大連T akara公司;表達(dá)載體pProEX H Ta質(zhì)粒購自Invitrogen公司。

1.2 試劑 TaqDNA聚合酶,T4-DNA連接酶,限制性內(nèi)切酶EcoRI、ClaI、HindIII及 DNA 標(biāo)記物DL 2000均購自大連T akara公司;IPTG購自Sigma公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自百泰克公司;Ag85B多克隆抗體和H sp16.3單克隆抗體購自Abcam公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和羊抗人IgG購自北京鼎國生物公司;純化Ag85B-Hsp16.3的融合蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備;含有Ni+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒購自Invintrogen公司;其余一般化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。TB陽性病人血清來自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科。

1.3 目的基因的擴(kuò)增 重組質(zhì)粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6 由本中心保存〔5〕,其中 Ag85B 、ESAT6的酶切位點(diǎn)分別是EcoRI和ClaI、ClaI和HindIII,鑒定正確;hsp16.3基因以本中心保存的pProEX HT b-Hsp16.3 質(zhì) 粒為 模板〔6〕,根據(jù) Gen-Bank中公布的結(jié)核分枝桿菌hsp16.3基因序列設(shè)計(jì)引物。為保證這兩種蛋白融合表達(dá)時(shí)具有各自的空間構(gòu)象和正確折疊,在hsp16.3基因上游引物引入了48bp的疏水柔性鏈接頭(linker)。引物如下：

P1：5'-GAATCGATGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAG GATCAATGGCCACCACCCT TC-3'含ClaⅠ酶切位點(diǎn)(下劃橫線);

P2：5'-TCAAAGCTT TCAGTTGGTGGACCGGATC-3'含HindIII酶切位點(diǎn)(下劃橫線)。PCR 反應(yīng)體系為 ：10 ×buffer 5μ L,dN TPs 4μ L(2.5 mmol/L),DNA 模板1μ L,兩對P1、P2引物各1μ L 及Taq酶1μ L,加水至50μ L。PCR 反應(yīng)條件：94℃變性 3 min,94℃45s,60℃45s,72℃50s,共 30個(gè)循環(huán),最后再于72℃延伸5 min,回收PCR產(chǎn)物。

1.4 目的基因的克隆與測序 T4連接酶將PCR產(chǎn)物與 pMD18-T克隆載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。隨機(jī)挑取3個(gè)菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃震蕩培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒DNA,并用ClaI和HindIII雙酶切進(jìn)行鑒定,觀察有無目的片段。將篩選出的陽性克隆進(jìn)行測序(由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測序)。將測序正確已含有l(wèi)inker和hsp16.3基因的pMD18-T克隆載體記作pMD18-T-L-Hsp16.3。

1.5 含目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建及目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 提取測序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-TL-Hsp16.3,經(jīng)ClaI和HindIII雙酶切后,回收目的基因條帶命名為L-Hsp16.3。將本中心保存的測序正確的 pProEX HT a-Ag85B-ESAT6質(zhì)粒經(jīng)ClaI和HindIII雙酶切,回收大片段命名為 pProEX HTa-Ag85B,連接同樣雙酶切的L-Hsp16.3片段,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑選3個(gè)菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃過夜培養(yǎng)活化,提質(zhì)粒用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定,陽性克隆命名為 pProEX HTa-Ag85B-Hsp 16.3。將此陽性菌再活化后以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)2～3h,1mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h,離心回收菌體沉淀,分別加入100μ L的去離子水與100μ L還原性2×電泳上樣緩沖液,煮沸10min,離心后取10μ L上清進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,觀察目的蛋白的表達(dá)。

1.6 融合蛋白 Ag85B-Hsp16.3的 Western-blot測定 將上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12%SDS-PAGE后,100V恒壓電轉(zhuǎn)1h,用麗春紅染色,觀察蛋白電轉(zhuǎn)是否成功,然后用蒸餾水洗至無色,l0g/L牛血清白蛋白封閉2h,然后分別與兔抗的Ag85B多克隆抗體和鼠抗的Hsp16.3單克隆抗體以及活動(dòng)期結(jié)核病人血清結(jié)合過夜,TBST搖床震蕩洗滌3次,每次5～10min,分別與加HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠和羊抗人 IgG結(jié)合 1h,TBST搖床震蕩洗滌3次,TBS搖床震蕩洗滌3次,用OPD(鄰苯二胺)顯色液顯色并觀察結(jié)果。

1.7 融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的純化 采用含有Ni+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒純化目的蛋白,將100mL誘導(dǎo)后的菌液離心,制備上柱樣品,按照說明書中的方法進(jìn)行親和層析純化,收集洗脫液,進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因Hsp16.3的擴(kuò)增、克隆及酶切鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示Hsp16.3基因的PCR產(chǎn)物大小在 483bp左右(Hsp16.3基因?yàn)?435bp,含48bp的linker),與Hsp16.3的基因預(yù)期大小相符見圖1。

重組克隆質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小為1 338 bp左右的片段(Ag85B基因?yàn)?55bp,Hsp16.3基因?yàn)?435bp,含 48bp的 linker),證明pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3構(gòu)建成功見圖 1。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的 Ag85BHsp16.3基因一致。

圖1 重組質(zhì)粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3的酶切鑒定1：DNA標(biāo)記物 DL2000;2：重組質(zhì)粒 pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3以EcoRⅠ 和 HindⅢ 雙酶切;3：重組質(zhì)粒 pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3以ClaⅠ和HindⅢ 雙酶切;4：重組質(zhì)粒 pProEX HTa-Ag85BHsp16.3以EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切Fig.1 Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by endonuclease digestion1：DNA marker DL2000;2：Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by EcoRⅠand HindⅢ digestion;3：Recombinant plasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3 by ClaⅠ and HindⅢ digestion;4：Recombinantplasmid pProEX HTa-Ag85B-Hsp 16.3 by EcoRⅠ and ClaⅠ digestion

2.2 Ag85B-Hsp16.3基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果

重組菌誘導(dǎo)前后表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE顯示,誘導(dǎo)的重組菌在約49 kDa處有一蛋白條帶,同預(yù)計(jì)的大小相吻合,而未誘導(dǎo)菌無此條帶。親和層析法純化得到的蛋白濃度為 0.7546mg/mL,經(jīng) SDSPAGE檢測,可見同樣大小的蛋白條帶見圖2。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物與單抗的Western-blot鑒定 結(jié)果顯示,無論是使用兔抗 Ag85B的多抗還是鼠抗Hsp16.3的單克隆抗體在相對分子量約為49 kDa處均有一條表達(dá)帶見圖3,表明Ag85B-Hsp16.3表達(dá)產(chǎn)物包含了兔抗Ag85B抗體和鼠抗Hsp16.3抗體的結(jié)合表位。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物與活動(dòng)期結(jié)核病人血清的Westernblot鑒定 結(jié)果顯示,在相對分子量約為49 kDa處有一條表達(dá)帶見圖3,說明TB病人血清與Ag85BHsp16.3表達(dá)產(chǎn)物具有較好的反應(yīng)性。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性檢測 在重組表達(dá)菌液中加入胍裂解液,用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲裂解后,離心,分別取上清和沉淀進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS2PAGE)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)的融合蛋白主要以不可溶狀態(tài)(包涵體)存在,可獲得單一的純化條帶。

3 討 論

近年來,國內(nèi)外學(xué)者圍繞新型Tb疫苗方面開展了一系列研究,其中包括亞單位疫苗和DNA疫苗,但這些研究大多是針對M TB單個(gè)免疫保護(hù)性抗原進(jìn)行的,其免疫保護(hù)效果并不十分理想〔7〕。研究表明包含多個(gè)免疫保護(hù)性抗原的多價(jià)疫苗可能是提高其有效性的一種新策略〔4〕。鑒于此,本研究對MTB兩種重要免疫保護(hù)性抗原Ag85B和Hsp16.3進(jìn)行融合表達(dá),以期誘導(dǎo)廣泛而全面的免疫應(yīng)答。

Ag85復(fù)合物(Ag85A、Ag85B和Ag85C)是牛分枝桿菌、BCG及MTB培養(yǎng)濾液中的主要分泌性蛋白,該復(fù)合物屬于分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶,在MTB細(xì)胞壁合成的晚期起關(guān)鍵作用〔8〕。其中Ag85B誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)最強(qiáng),是抗結(jié)核免疫中的重要保護(hù)性抗原,其抵抗結(jié)核分枝桿菌再感染的能力優(yōu)于BCG〔9〕?；顒?dòng)期結(jié)核患者血清中的Ag85B水平比其他分枝桿菌疾病患者和健康對照者高50～150倍〔10〕。Ag85B還可誘導(dǎo)PPD陽性健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ,而活動(dòng)期肺結(jié)核患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ的水平極低,也進(jìn)一步表明Ag85B是機(jī)體重要的保護(hù)性靶抗原〔11〕。

Hsp16.3最初被認(rèn)為是免疫顯性蛋白,后被確定是MTB重要的膜蛋白,位于結(jié)核休眠菌增厚的膜上,其高度表達(dá)與休眠菌的形成和生存息息相關(guān)?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)〔12〕證明 Hsp16.3是MTB穩(wěn)定存在不可缺少的蛋白,結(jié)果顯示如果沒有該蛋白的表達(dá),MTB無論在骨髓分離的巨噬細(xì)胞還是在T HP-1細(xì)胞系中都將受損而難以生存,更不可能長期休眠。Aparna Khera等〔13〕用表達(dá) Hsp16.3、ESAT-6 和超氧化物歧化酶A的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠和豚鼠后,用H37Rv進(jìn)行攻擊,與空質(zhì)粒相比,誘發(fā)了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)和免疫保護(hù)力。雖然Hsp16.3誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及產(chǎn)生的保護(hù)力低于超氧化物歧化酶 A,但是高于 ESAT-6?？梢?Hsp16.3有望成為新型結(jié)核疫苗的靶抗原,尤其是針對潛伏感染的新型TB疫苗。

由于Ag85B是MTB活動(dòng)期分泌的重要蛋白,而Hsp16.3在休眠期高度表達(dá),二者融合產(chǎn)物應(yīng)該是對活動(dòng)期結(jié)核和休眠期結(jié)核都具有較好的保護(hù)效力。本研究在Ag85B和Hsp16.3兩個(gè)基因之間,引入了一段編碼l6個(gè)氨基酸的疏水肽段,這段柔性肽的分子極性小,且富含甘氨酸和絲氨酸,易于彎曲,具有一定的彈性,能保證兩種蛋白正確地折疊,從而確保兩種蛋白具有各自獨(dú)立的功能。實(shí)驗(yàn)中純化的融合蛋白用兔抗Ag85B多抗和鼠抗Hsp16.3單抗進(jìn)行免疫鑒定,結(jié)果均呈現(xiàn)清晰的陽性反應(yīng)條帶,證實(shí)純化的蛋白為預(yù)期的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。純化的融合蛋白與活動(dòng)期結(jié)核病人血清具有較好的反應(yīng)性,為進(jìn)一步研究該融合蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

〔1〕Harth G,Lee BY,Wang J,et al.Novel insights into the genetics,biochemistry and immunocytochemistry of the 30-kilodalton major extracellular protein ofMycobacterium tuberculosis〔J〕.Infect Immun,1996,64(8)：3038-3047.

〔2〕Lim J,Park J,Jo E,et al.Purification and immunoreactivity of three components from the 30/32-kilodalton antigen 85 complex inMycobacterium tuberculosis〔J〕.Infect Immun,1999,67(11)：6187-6190.

〔3〕Starck J,Kallenius G,Marklund BI,et al.Comparative proteome analy sis ofMycobacterium tuberculosisg rown under aerobic and anaerobic conditions〔J〕.Microbiology,2004,150(Pt11),3821-3829.

〔4〕Britton WJ,Palendira U.Improving vaccines against tuberculosis〔J〕.Immunol cell biol,2003,81(1)：34-35.

〔5〕劉建利,師長宏,靳亞平,等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B與 ESA T6融合蛋白的表達(dá)、純化及抗原活性的初步研究〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(5)：449-452.

〔6〕張廷芬,師長宏,朱德生,等.結(jié)核分枝桿菌 Hsp16.3的表達(dá)、純化和鑒定〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(10)：964-967.

〔7〕M orris S,Kelley C,Howard A,et al.The immunogenicity of single and combination DNA vaccines against tuberculosis〔J〕.Vaccine,2000,18(20)：2155-2163.

〔8〕Belisle JT,Vissa VD,Sievert T,et al.Role of the major antigen ofMycobacterium tuberculosisin cell wall biogenesis〔J〕.Science,1997,276(5317)：1420-1422.

〔9〕Horwitz MZ,Lee BW,Dillon BJ,et al.Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellula proteins ofMy cobacterium tuberculosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(5)：1530-1534.

〔10〕Bentley-Hibbert SI,Quan X,Newman T,et al.Pathophysiology of antigen 85 in patients with active tuberculosis：antigen 85 circulates as complexes with fibronectin and immunoglobulin G〔J〕.Infect Immun,1999,67(2)：581-588.

〔11〕Torres M,Herrera T,Villareal H,et al.Cytokine profiles for peripheral blood lymphocytes from patients with active pulmonary tuberculosis and healthy household contacts in response to the 30-kilodalton antigen ofMycobacterium tuberculosis〔J〕.Infect Immun,1998,66(1)：176-180.

〔12〕Yuan Y,Crane DD,Simpson RM,et al.T he 16-kDa alphacrystallin(Acr)protein of My cobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(16)：9578-9583.

〔13〕Khera A,Singh R,Shakila H,et al.Elicitation of efficient,protective immune responses by using DNA vaccines against tuberculosis〔 J〕.Vaccine,2005,23(48-49)：5655-5665.