王子輝，楚 杰，王君高，劉可春

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353；2.山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南250014）

酶電極法測定海藻糖含量

王子輝1，楚 杰2，*，王君高1，劉可春2

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353；2.山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南250014）

對酶電極法測定海藻糖含量進(jìn)行了研究，實驗中首先探索了硫酸和鹽酸水解海藻糖的條件。結(jié)果表明：海藻糖水解的最佳條件是5%的鹽酸在100℃下水解5h或10%的硫酸在100℃下水解5h。水解后用酶電極法測定葡萄糖含量，并與硫酸-苯酚法比較，酶電極法測定海藻糖含量基本上消除了雜質(zhì)的干擾，重現(xiàn)性及精密性較高，是一種理想的測定方法。

海藻糖，酸，水解，酶電極法，生物傳感器

海藻糖（trehalose）是一種安全的天然糖類，1832年由Wiggers將其從黑麥的麥角菌中首次提取出來。海藻糖是由兩個葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定［1］?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，沙漠植物膜葉卷柏在干旱時幾近枯死，遇水后卻又可以奇跡般復(fù)活；一些昆蟲即使在-80℃下仍然能夠生存，就是它們體內(nèi)的海藻糖創(chuàng)造的生命奇跡［2］。海藻糖因此在科學(xué)界素有“生命之糖”的美譽(yù)［3］。它還是一種新型的食品添加劑，可廣泛地用于食品加工業(yè)，尤其在水果和水產(chǎn)品保鮮方面更有突出的優(yōu)點。在研究酵母的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，海藻糖含量高的酵母菌比含量低的酵母菌具有更強(qiáng)的抗干燥能力，海藻糖含量高的活性干酵母保存期長，海藻糖含量低的活性干酵母保存期短。因此，研究酵母中海藻糖含量的測定具有重要的實踐價值。測定酵母中海藻糖含量的主要方法有蒽酮比色法、硫酸-苯酚法、酶水解法和HPLC法等。蒽酮法與硫酸-苯酚法基于糖和蒽酮的顯色反應(yīng)原理，但在遇到能與其反應(yīng)的其他物質(zhì)時，常使測定值有偏差；有人采用海藻糖酶水解法測定海藻糖含量，但也有一定的限制［4］；采用HPLC方法，不僅需要昂貴的儀器和試劑，而且在測定前，還需對樣品進(jìn)行多步處理，耗時多，操作繁瑣［5］。因此，尋找一種既準(zhǔn)確、又簡便的海藻糖測定方法已成為目前研究工作的當(dāng)務(wù)之急。本實驗首先利用酸將海藻糖水解成葡萄糖，然后用生物傳感分析儀測定水解液中葡萄糖含量，進(jìn)而定量測定海藻糖含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)海藻糖、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、98%濃硫酸、36%濃鹽酸、酒石酸、檸檬酸、苯酚 均為分析純。

SBA-40C型葡萄糖生物傳感器 山東省科學(xué)院生物研究所研制。

1.2 實驗方法［6-8］

1.2.1 酶電極法測定海藻糖含量

1.2.1.1 水解酸種類的選擇 配制5%的鹽酸、5%硫酸、30%檸檬酸、30%酒石酸溶液備用，準(zhǔn)確稱取4份 0.1000g海藻糖，加入4個以各酸名標(biāo)號的小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各個小三角瓶中，完全溶解之后用玻璃紙密封，在100℃下水解5h。水解完畢，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物傳感器測定水解液中葡萄糖含量，計算海藻糖的含量。

1.2.1.2 水解酸濃度的選擇 配制3%、4%、5%、6%的鹽酸和10%、20%、30%、40%的硫酸備用。準(zhǔn)確稱取8份0.1000g海藻糖，加入8個以各酸和濃度標(biāo)號小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各個小三角瓶中，完全溶解之后密封，在100℃下水解5h。水解完畢，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物傳感器測定水解液中葡萄糖含量，計算海藻糖的含量。

1.2.1.3 最適水解時間的選擇 配制5%的鹽酸和10%硫酸溶液備用，準(zhǔn)確稱取8份0.1000g海藻糖，加入8個以各酸和濃度標(biāo)號小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各個小三角瓶中，完全溶解之后密封，在100℃下水解3、4、5、6h。水解完畢，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物傳感器測定水解液中葡萄糖含量，計算海藻糖的含量。

1.2.1.4 最適水解溫度的選擇 配制5%的鹽酸和10%硫酸溶液備用，準(zhǔn)確稱取8份0.1000g海藻糖加入8個以各酸和濃度標(biāo)號小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各個小三角瓶中，完全溶解之后用玻璃紙密封，在70、80、90、100℃下水解5h。水解完畢，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物傳感器測定水解液中葡萄糖含量，計算海藻糖的含量。

1.2.2 與苯酚-硫酸法［9］比較

1.2.3 精密度檢測 準(zhǔn)確稱取5份0.1000g海藻糖加入1～5號的小三角瓶中，加入30mL水，完全溶解之后，用100mL容量瓶定容，用苯酚硫酸法測定溶液中海藻糖含量。

配制5%的鹽酸溶液備用，準(zhǔn)確稱取5份0.1000g海藻糖加入6～10號的小三角瓶中，吸取已配好的5%的鹽酸溶液30mL加入各瓶中，用玻璃紙密封，在100℃下水解5h。水解完畢，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物傳感器測定水解液中葡萄糖含量，計算海藻糖的含量。

1.2.4 重復(fù)性檢測 取1.2.3中的5號管，用苯酚硫酸法測定5次溶液中海藻糖含量；同時取1.2.3中的10號管用生物傳感器測定5次水解液中葡萄糖含量，計算海藻糖的含量。兩種方法進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解酸種類的選擇

實驗中所選的四種酸水解海藻糖的結(jié)果見圖1，由圖1可以明顯看出，檸檬酸和酒石酸兩個弱酸的水解結(jié)果明顯不如鹽酸和硫酸兩個強(qiáng)酸的水解結(jié)果理想。故接下來的實驗中采用鹽酸和硫酸兩個強(qiáng)酸作對比。

2.2 水解酸濃度的選擇

鹽酸和硫酸各濃度水解海藻糖結(jié)果見圖2、圖3，3%～6%鹽酸的水解海藻糖含量先升后降，在5%的鹽酸處達(dá)到最大值，故本實驗選定的鹽酸的最適水解濃度為5%。同樣，5%～30%的硫酸水解結(jié)果也是先升后降，在10%處達(dá)到最大值，故本實驗選定的硫酸的最適水解濃度為10%。

圖1 各酸的實驗結(jié)果

圖2 鹽酸各濃度的實驗結(jié)果

圖3 硫酸各濃度的實驗結(jié)果

2.3 最適水解時間的選擇

5%HCl、10%H2SO4各水解時間的水解海藻糖的結(jié)果見圖4、圖5，顯而易見，從3h到5h時，鹽酸和硫酸對海藻糖的水解率都隨時間的增加而增加，在5h時達(dá)到最大值而后下降，分析原因可能是海藻糖水解的葡萄糖長時間處于酸性環(huán)境中，生成葡萄糖酸的結(jié)果，故本實驗選定的最適水解時間為5h。

圖4 5%HCl水解時間的實驗結(jié)果

2.4 最適水解溫度的選擇

5%HCl、10%H2SO4各水解溫度的水解結(jié)果如圖6、圖7所示，從圖6、圖7中可以看出，從70～100℃，5%HCl、10%H2SO4對海藻糖水解率是持續(xù)增大的，在100℃時基本達(dá)到最大值，故本實驗選定的最適水解溫度為100℃。

表1 苯酚硫酸法精密度測試結(jié)果

表2 生物傳感器精密度測試結(jié)果

表3 重復(fù)性測試結(jié)果

圖5 10%H2SO4水解時間的實驗結(jié)果

圖6 5%HCl水解溫度的實驗結(jié)果

圖7 10%H2SO4水解溫度的實驗結(jié)果

2.5 精密度檢測

精密度是指多次重復(fù)測定同一量時各測定值之間彼此相符合的程度，它表示測量的再現(xiàn)性，通常以算術(shù)平均差來量度。本實驗即用算術(shù)平均差衡量實驗方法的精密度。

精密度測試結(jié)果如表1、表2所示，從表1、表2可以看出，苯酚硫酸法測定結(jié)果的精密度波動較大，而用葡萄糖生物傳感器測定的結(jié)果波動相對平緩，所以生物傳感器法的精密度比較好，故本實驗采用生物傳感器法測定海藻糖。

2.6 重復(fù)性檢測

重復(fù)性是指在相同測量條件下，對同一被測量物質(zhì)進(jìn)行連續(xù)多次測量所得結(jié)果之間的一致性，重復(fù)性常用實驗標(biāo)準(zhǔn)差來量度，本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)差衡量實驗方法的重復(fù)性。

重復(fù)性測試如表3所示，從表3可以看出，苯酚硫酸法測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差比生物傳感器法所測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差高，所以其重復(fù)性比較低，這表明生物傳感器法比較準(zhǔn)確，故本實驗采用生物傳感器測定海藻糖。

3 結(jié)論

3.1 本實驗對酶電極法測定海藻糖含量進(jìn)行了初步研究，因海藻糖是由兩分子葡萄糖組成，本實驗中首先將海藻糖水解成葡萄糖，然后用葡萄糖生物傳感器測定葡萄糖含量，從而推斷出海藻糖的含量；實驗中初步采用了四種酸對海藻糖進(jìn)行了水解，并得到水解海藻糖的最佳條件：鹽酸水解法為5%的鹽酸在100℃下水解5h；硫酸水解法為10%的硫酸在100℃下水解5h。相比較而言，要使硫酸達(dá)到和鹽酸相近的水解效果，所需硫酸的濃度是鹽酸濃度的一倍，從節(jié)約資源的角度考慮，應(yīng)該選鹽酸作為水解酸。

3.2 從準(zhǔn)確性和重復(fù)性檢測兩個指標(biāo)來看，生物傳感器法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性及重復(fù)性要優(yōu)于苯酚硫酸法，它對底物具有高度專一性，僅對溶液中的葡萄糖反應(yīng)，克服了苯酚硫酸法手工測定及非糖類物質(zhì)干擾帶來的誤差，故本實驗擬采用生物傳感器法測定葡萄糖含量，通過換算計算出海藻糖含量。

此外，在后續(xù)的研究過程中，還可以用此方法測定酵母中的海藻糖含量，相信會得到理想的結(jié)果。

［1］蒙健宗，趙文報.海藻糖的性質(zhì)及其在新型食品開發(fā)中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2005，26（6）：281-283.

［2］袁勤生.隱生生物中的典型化合物——海藻糖［J］.中國生化藥物雜志，1999，20（1）：48-50.

［3］Philip Ball.Fresh and dry［N］.Nature News，2000（7）：17.

［4］韓少卿，彭奇均，舒菊霞.HPLC法測定酵母中海藻糖［J］.中國食品添加劑，2005，2（3）：107-109.

［5］王蕾，鄭璞.DNS法定量測定海藻糖的研究［J］.食品科技檢測技術(shù)，2004，82（2）：82-84.

［6］倪煒，常雅寧，等.香蕉皮水解工藝的初步研究［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2009，43（1）：20-24.

［7］ZEITSCH K J.The chemistry and technology of furfural and its many by products［J］.Sugar Series，2000（13）：338-339.

［8］Rebecca A，Silverstein，Ye Chen，et al.comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks［J］.Bioresource Technology，2007，98（16）：3000 -3011.

［9］陳戰(zhàn)國，周利燕，等.苯酚-硫酸法測定太白泡沙參總多糖的含量［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報，2009，37（4）：48-51.

Determination of trehalose content with enzyme electrode mothed

WANG Zi-hui1，CHU Jie2，*，WANG Jun-gao1，LIU Ke-chun2
（1.School of Food&Bioengineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China；2.Biology Research Institute of Shandong Academy of Science，Jinan 250014，China）

The determination of trehalose content was preliminarily studied with enzyme electrode.Two different hydrolysis ways with sulfuric acid or hydrochloride were explored in this experiment.The results showed that the optimal reaction conditions were：hydrochloride hydrolysis at 5% concentration，100℃ and 5h，sulfuric acid hydrolysis at 10%concentration，100℃and 5h.After the hydrolysis，glucose content was determined with enzyme electrode and compared with phenol-sulfuric acid method.Determination of trehalose with enzyme electrode has largely eliminated the interference of impurities.lt is an ideal determination method more repetitively and accurately.

trehalose；acid；hydrolysis；enzyme electrode；biosensor

TS247

A

1002-0306（2010）11-0366-04

2009-12-14 *通訊聯(lián)系人

王子輝（1985-），男，在讀碩士研究生，研究方向：微生態(tài)制劑。