屈艷南，侯玉澤，鄧瑞廣，張改平，*，劉慶堂，職愛民，劉宣兵，李彬彬，柴書軍

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物開放式免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

磺胺喹惡啉人工抗原合成及鑒定

屈艷南1，2，侯玉澤1，鄧瑞廣2，張改平2，*，劉慶堂2，職愛民2，劉宣兵1，2，李彬彬1，2，柴書軍2

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物開放式免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

國(guó)內(nèi)首次用重氮化法將磺胺喹惡啉（SQ）分別與牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，制備免疫抗原SQ-BSA和包被抗原SQ-OVA。紫外掃描法與SDS-PAGE凝膠電泳法鑒定表明偶聯(lián)成功，偶聯(lián)比分別為10.1∶1、9.8∶1。將SQ-BSA免疫BALB/C小鼠，獲得了高效價(jià)、敏感性好的抗SQ血清，表明ELISA方法鑒定偶聯(lián)成功，為進(jìn)一步制備抗SQ單抗奠定了基礎(chǔ)。

磺胺喹惡啉，人工抗原，鑒定

磺胺喹惡啉（SQ）又名磺胺喹沙啉，是一種高效抗蟲劑、抗菌藥，口服后吸收迅速，對(duì)禽類疾病有很好的療效，應(yīng)用廣泛，但有一定毒性，且易在動(dòng)物的可食性組織中殘留［1］。由于SQ的良好藥效，養(yǎng)殖場(chǎng)在飼養(yǎng)動(dòng)物過(guò)程中向飼料或動(dòng)物飲用水中添加SQ，又未完全遵守國(guó)家獸藥典規(guī)定的投藥量、投藥期和休藥期的規(guī)定，導(dǎo)致SQ在動(dòng)物源食品中大量殘留。人食用這些動(dòng)物源食品后，可能發(fā)生變態(tài)、過(guò)敏等反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)產(chǎn)生致畸、致癌作用。因此世界各國(guó)均制定了相對(duì)嚴(yán)格的獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)及歐盟、日本、美國(guó)等西方發(fā)達(dá)國(guó)家制定其殘留標(biāo)準(zhǔn)為100ng/g［2］。SQ結(jié)構(gòu)如圖1所示。關(guān)于SQ的殘留分析，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多，主要是高效液相色譜法（HPLC）［3，6］、微生物學(xué)方法（SST）［4］，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法（LC-MS）［5］。HPLC與LC-MS方法通常需要多個(gè)液—液分配（LLE）和濃縮步驟，操作復(fù)雜，儀器設(shè)備要求高，不便于養(yǎng)殖場(chǎng)用于大規(guī)模篩查自檢，且直接針對(duì)SQ的分析較少［7］；SST又難以實(shí)現(xiàn)超微水平檢測(cè)。試紙條檢測(cè)是一種具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便，直觀等優(yōu)點(diǎn)的新型檢測(cè)手段。本研究旨在合成SQ人工抗原，為制備SQ單抗及開發(fā)SQ殘留檢測(cè)試紙條奠定基礎(chǔ)。

圖1 SQ結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

磺胺喹惡啉（SQ）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA） 美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸去離子水（DDW） 實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鈉等其它試劑

國(guó)內(nèi)市售分析純級(jí)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡雌性Balb/C小鼠，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由河南省動(dòng)物免疫學(xué)開放式重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

U-3000紫外掃描儀（UV） 日本島津；DU-600蛋白核酸分析儀 Beckman公司；3K-18高速冷凍離心機(jī) 德國(guó) SIGMA公司；550型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)、HI9321酸度計(jì) 美國(guó)HANNA公司；超凈工作臺(tái) 美國(guó)Forma Scientific公司；AE260電子天平 德國(guó)METTLER公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；JM-250電泳儀 大連捷邁科貿(mào)有限公司；2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器、93-3定時(shí)恒溫雙向磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SQ人工抗原的制備 SQ為小分子物質(zhì)（MW =300.4），本身并不具有免疫原性，需要將其偶聯(lián)到大分子載體蛋白上形成人工完全抗原才能免疫動(dòng)物。根據(jù)SQ的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，采用重氮化反應(yīng)［8］將它與載體蛋白偶聯(lián)。

免疫抗原（SQ-BSA）制備：稱取 SQ4.0mg，加0.8mL HCl（1mol/L），0～4℃冰浴避光攪拌反應(yīng)5min，逐滴加入單蒸水溶解的NaOH溶液，KI試紙剛剛變藍(lán)時(shí)停止加入。攪拌反應(yīng)5min，加BSA 8mg，調(diào)pH至9，0～4℃冰浴攪拌反應(yīng)過(guò)夜，PBS緩沖液透析7d。偶聯(lián)反應(yīng)路線見圖2。

圖2 SQ偶聯(lián)反應(yīng)式

包被抗原（SQ-OVA）的制備：OVA取6.7mg，具體方法及化學(xué)物質(zhì)用量同上。

1.2.2 人工抗原的鑒定

1.2.2.1 紫外掃描鑒定及偶聯(lián)比估算 人工抗原的紫外掃描鑒定：將人工抗原用PBS稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測(cè)定280nm和260nm的OD值，按下式計(jì)算蛋白的濃度即抗原的濃度［9］：

蛋白濃度（mg/mL）=1.45OD280-0.74OD260

據(jù)此用PBS緩沖液配制SQ和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)SQ與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與SQ-BSA溶液中蛋白質(zhì)的濃度一致，在波長(zhǎng)220～420nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)掃描圖譜進(jìn)行人工抗原鑒定。偶聯(lián)比的估算：將SQ、BSA及SQ-BSA人工抗原配制成一定濃度的溶液，使SQ、BSA溶液濃度與SQ-BSA濃度相同（方法同上），對(duì)它們分別進(jìn)行紫外掃描，得到OD值A(chǔ)SQm、ABSAm（分別為SQ在SQ和BSA最大吸收波長(zhǎng)處的OD值）和BSQm、BBSAm（分別為BSA在SQ和BSA最大吸收波長(zhǎng)處的OD值）；根據(jù)算式：K=OD值/CL（K為克分子消光系數(shù)；C為各物質(zhì)濃度；L為光徑），分別計(jì)算出 KASQm、KABSAm、KBSQm、KBBSAm，分別為 SQ、BSA的兩個(gè)摩爾消光系數(shù)。

定點(diǎn)檢測(cè)SQ在SQ和BSA的最大吸收波長(zhǎng)處的OD值即：ACSQm、ACBSAm。

按下式計(jì)算SQ與BSA在SQ-BSA人工抗原中的克分子濃度比，即偶聯(lián)比［9］：

CSQ/CBSA=ACSQm·KBBSAm-ACBSAm·KBSQ/ACBSAm·KASQm-ACSQm·KABSAm

計(jì)算SQ與OVA在SQ-OVA中的偶聯(lián)比，方法同上。

1.2.2.2 SDS-PAG凝膠電泳鑒定 配制各種電泳溶液，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%［10］，濃縮膠電壓120V，分離膠電壓60V，上樣量為20μL，考馬斯亮藍(lán)染色3～4h，置脫色液中脫色過(guò)夜。

1.2.2.3 動(dòng)物免疫鑒定 用SQ-BSA疫6周齡雌性BALB/C小鼠5只，免疫劑量50μg/只，0.2mL/只，背部皮下分4～6點(diǎn)注射。首免，用無(wú)菌 PBS溶解SQ-BSA，與等量FCA混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用無(wú)菌PBS溶解SQ-BSA，與等量FIA混合，充分乳化，共免4次，每次間隔3周，最后1次免疫后10d斷尾采血分離血清，ELISA方法檢測(cè)抗SQ多克隆抗體（pAb）效價(jià)及敏感性。

pAb效價(jià)測(cè)定：采用間接ELISA測(cè)定pAb效價(jià)。SQ-OVA包被，包被濃度1μg/mL，包被量100μL/孔，37℃溫育2h，PBST洗板4次，每次間隔3min（下同）；用5%豬血清封閉200μL/孔，37℃溫育1h，洗板；加多抗血清（pAb），50μL/孔，用封閉液倍比稀釋，設(shè)陰性對(duì)照（NC）和空白對(duì)照（BC），37℃溫育15min，洗板；加RaMIgG-HRP，1∶1000用封閉液稀釋，50μL/孔，37℃溫育25min，洗板；加酶底物TMB顯色100μL/孔，RT10min；終止反應(yīng)，100μL/孔2mol/L H2SO4，讀OD450nm值；結(jié)果判斷，以待測(cè)孔OD450nm值≥NC OD450nm值的2.1倍（P/N≥2.1），判為陽(yáng)性［11］。

敏感性鑒定：采用阻斷ELISA鑒定其敏感性。SQ-OVA包被，包被濃度1μg/mL，包被量100μL/孔，37℃溫育2h，PBST洗板4次，每次間隔3min（下同）；5%豬血清封閉，200μL/孔，37℃溫育1h，洗板；加OD450nm為1.0的小鼠血清50μL和不同濃度的SQ標(biāo)準(zhǔn)品作抑制劑，設(shè)NC和BC，37℃溫育15min，洗板；加RaMIgG-HRP，1∶1000用封閉液稀釋，每孔50μL，37℃溫育25min，洗板；加酶底物TMB顯色，每孔100μL，室溫反應(yīng)10min；終止顯色反應(yīng)，每孔加入終止液2mol/L H2SO4100μL，用酶標(biāo)儀讀OD450nm值；計(jì)算抑制率（B/B0，B0為SQ0濃度的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值，B為其他SQ不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值）［12］。以B/ B0為縱坐標(biāo)，以SQ濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸上繪制SQ對(duì)SQ pAb的抑制曲線，根據(jù)曲線趨勢(shì)推導(dǎo)回歸方程，計(jì)算SQ pAb對(duì)SQ的50%抑制濃度（50%Inhibitive concentration，IC50），以IC50衡量其敏感度。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結(jié)果

2.1.1 UV鑒定結(jié)果 如圖3。由圖可見，SQ-BSA曲線與BSA曲線形狀差異較大，280nm處的BSA特征吸收峰與253nm處SQ特征吸收峰疊加并位移至261nm處，在253nm SQ特征吸收峰處SQ-BSA吸收峰明顯上升，表明人工抗原偶聯(lián)成功［13］。

表1 間接ELISA測(cè)小鼠抗SQ血清效價(jià)

表2 小鼠抗血清對(duì)SQ的抑制效價(jià)

圖3 BSA、SQ和SQ-BSA的紫外掃描光譜

因此確定SQ已與兩種載體蛋白都偶聯(lián)成功。根據(jù)公式可以算得 SQ-BSA的偶聯(lián)比為10.1∶1，SQ-OVA偶聯(lián)比為9.8∶1。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定結(jié)果 如圖4。由圖可見，BSA的泳動(dòng)速度大于SQ-BSA，說(shuō)明SQ-BSA的分子量大于BSA，證明SQ與BSA已成功偶聯(lián)［14-15］。

圖4 SQ-BSA偶聯(lián)物的SDS-PAGE鑒定

2.1.3 pAb鑒定結(jié)果

2.1.3.1 間接ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見表1。由表可知，免疫的3只小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到了10-3，說(shuō)明獲得了較好的免疫效果，其中2號(hào)小鼠效價(jià)最高為1∶6.4×103。

2.1.3.2 SQ pAb敏感性鑒定 結(jié)果見表2。SQ在10000～156.25μg/mL范圍內(nèi)，3只小鼠均產(chǎn)生了抑制，其中3號(hào)小鼠抑制效果最好，將其OD450nm值轉(zhuǎn)化為B/B0，再對(duì)Lg［SQ/100］進(jìn)行回歸分析，3號(hào)小鼠的線性回歸方程為 y=-0.2319x+1.0346，R2為0.9795，IC50為201.9761ng/mL，見圖5。

3 討論

SQ存在活性基團(tuán)伯氨基，以Landsteiner創(chuàng)立的小分子半抗原與大分子載體交聯(lián)合成完全抗原理論［16］為基礎(chǔ)，對(duì)于帶有氨基的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)一般采用重氮化法和戊二醛（GA）法，本研究對(duì)這兩種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明重氮化法優(yōu)于GA法，進(jìn)一步證實(shí)了重氮化法適用于芳香胺而GA法適合于脂肪胺的報(bào)道［17］。影響人工抗原免疫原性的因素有多種，主要因素包括載體蛋白的性質(zhì)、半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)、間隔臂的長(zhǎng)度和分子結(jié)合比。本研究選用理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易變性，價(jià)廉易得的BSA作載體蛋白，BSA分子內(nèi)含自由氨基多，在較大pH范圍和不同離子強(qiáng)度下均能保持較大的溶解度，更有利于偶聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。間隔臂的介入長(zhǎng)度要合適，過(guò)短則載體蛋白的空間位阻將影響細(xì)胞對(duì)半抗原的識(shí)別，不產(chǎn)生特異性抗體，本研究以-N=N-作間隔臂，長(zhǎng)度適宜，有助于半抗原結(jié)構(gòu)的暴露，有利于特異性抗體的產(chǎn)生，不會(huì)形成新的抗原表位［18］，避免了“橋抗體”的出現(xiàn)，又產(chǎn)生了針對(duì)SQ的特異性抗體。

本研究成功合成了SQ人工抗原，免疫BALB/C小鼠制備出高價(jià)、特異的pAb，為抗SQ單克隆抗體（mAb）的進(jìn)一步研制及其免疫學(xué)分析方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

圖5 SQ pAb對(duì)SQ的阻斷ELISA抑制曲線

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Synthesis and identification of sulfaquinoxaline antificial antigen

QU Yan-nan1，2，HOU Yu-ze1，DENG Rui-guang2，ZHANG Gai-ping2，*，LIU Qing-tang2，ZHI Ai-min2，LIU Xuan-bing1，2，LI Bin-bin1，2，CAI Shu-jun2
（1.Henan University of Scienceand Technology，Luoyang 471003，China；2.Henan Key Laboratory for Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China）

The diazotization was adopted to link SQ to the carrier proteins BSA and OVA to prepare the immunogen SQ-BSA and test coating antigen SQ-OVA.Also，SQ-BSA and SQ-OVA were confirmed by ultraviolet scanning and SDS-PAGE.The conjugationratio of SQ-BSA and SQ-OVA were 10.1∶1 and 9.8∶1，respectively.The polyclonal antibody with high titre and sensitivity were also gained by immunizing the BALB/C mice with SQ-BSA.These results indicated that the hapten SQ was successfully linked to the carrier proteins，which also lay the foundation for further gain monoclonal anti-SQ.

sulfaquinoxaline；artificial antigen；identification

Q939.91

A

1002-0306（2010）11-0178-04

2009-08-17 *通訊聯(lián)系人

屈艷南（1983-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品藥殘快速檢測(cè)。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2006BAK02A21）。