高 博，徐 微，趙新淮

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030）

兩種蛋白水解物的FENTON反應修飾與抗氧化活性變化

高 博，徐 微，趙新淮*

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030）

利用堿性蛋白酶分別水解大豆分離蛋白、酪蛋白，對兩種水解物進行Fenton反應修飾。用紫外吸收及Lowry法評價修飾反應對兩種水解物的影響，結果表明，修飾后產物與原水解物顯著不同，表明修飾反應對水解物組成產生影響?？寡趸钚苑治霭l(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白水解物的修飾產物的IC50從2.92mg/mL降低至1.36～2.28mg/mL，酪蛋白水解物的修飾產物的IC50從2.80mg/mL降低至0.89～2.12mg/mL，表明Fenton反應可提高修飾產物對DPPH自由基的清除能力。

大豆分離蛋白，酪蛋白，水解物，F(xiàn)enton反應，抗氧化活性

蛋白質是重要的食品成分，具有不可替代的作用。通過蛋白酶水解蛋白質來制備具有各種生物活性的水解物（如抗癌肽、抗病毒肽、抗菌肽、抗氧化肽等），是國內外研究的熱點之一。國內外對抗氧化肽的研究工作大多集中在酶水解、分離純化及氨基酸組成分析上。雖然我們對蛋白質水解物的抗氧化機制還不完全清楚，但是已有的研究結果表明，蛋白質水解物的抗氧化活性與其氨基酸組成有關；氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，肽段中幾乎都含有酪氨酸殘基［1-3］。氨基酸側鏈基團的氧化修飾是蛋白質修飾作用的結果之一［4］。利用氧自由基氧化，可以導致芳香族氨基酸側鏈的羥基化［5］。Fenton試劑產生的·OH是最活潑的氧自由基［6］。苯丙氨酸殘基被·OH羥基化可以產生三個產物，分別為對-、間-、鄰-酪氨酸［7］。因此，蛋白質水解物中苯丙氨酸被·OH修飾，將可能改善水解物的抗氧化活性。為此，利用堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG）分別水解大豆分離蛋白和酪蛋白，通過Fenton試劑（H2O2+FeSO4系統(tǒng)）產生·OH來修飾這兩種蛋白水解物；利用紫外法及Lowry法確認修飾產物中發(fā)生的羥基化作用；最后，評價兩種蛋白水解物修飾產物的清除DPPH自由基活性，確認Fenton反應對兩種蛋白水解物抗氧化活性的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大豆蛋白粉 哈爾濱高科技蛋白有限公司；酪蛋白 上海山浦化工有限公司；堿性蛋白酶

Alcalase 2.4L FG，Novo公司，酶活 2.4AU/g，密度1.18g/mL；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） Sigma公司；其他所有試劑 均為分析純。

UV-2401PC型紫外可見分光光度計 島津公司；AL204型分析天平、DELTA 320型精密pH計

梅特勒-托利多儀器中國有限公司；Kjeltec TM2300型自動凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；LGJ-1型空冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；H -1型微型漩渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；YH -4BS型遠紅外恒溫干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備 按照文獻［8］中的方法進行。取250g脫脂大豆粉，加入10倍（W/V）的蒸餾水，用1mol/L NaOH溶液調pH至8.5。攪拌浸提2h，4000r/min離心 20min，棄去不溶性物質。2mol/L HCl調上清液的pH至4.5，靜置1～2h，棄去上清液，下層蛋白質凝乳4000r/min離心20min，棄去上清液。沉淀物加入1.5～2倍（W/V）蒸餾水，攪拌、離心，棄去上清液；重復2次。沉淀物中加入1倍（W/V）蒸餾水，1mol/L NaOH調pH至7.0，冷凍干燥即得大豆分離蛋白。分析結果表明，其蛋白質含量約為96%（干重）。

1.2.2 大豆分離蛋白和酪蛋白的水解物制備 根據(jù)文獻［9-12］中的方法進行。用蒸餾水配制濃度為5%（W/W）的大豆分離蛋白或酪蛋白溶液，調節(jié)pH至8.0，酶添加量為1g蛋白質0.3AU，在50℃恒溫水浴中進行酶解。酶解作用2h后，調節(jié)水解液的pH至4.5。100℃加熱10min使酶滅活，5000r/min離心20min，分離出上清液。測定上清液中蛋白質含量和游離氨基含量，計算水解度。水解液冷凍干燥，固體保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.3 水解物的Fenton反應修飾 采用雙因素實驗，研究反應時間（選擇0.5、1、2、3h）、蛋白水解物中苯丙氨酸殘基摩爾數(shù)與Fenton試劑（FeSO4-EDTA溶液與等濃度的H2O2溶液混合）摩爾數(shù)的比例（以Phe∶H2O2比例表示，選擇1∶0.5、1∶1和1∶2）對修飾產物的影響。固定水解物濃度為1%（W/W），反應體系為pH 3.5的磷酸鹽緩沖體系。

1.2.4 Fenton反應對兩種蛋白水解物的影響

1.2.4.1 對水解物紫外吸收的影響 取稀釋適當倍數(shù)的樣品溶液，倒入1cm石英比色皿中，于280nm處測定吸光度［13］。用蒸餾水或各修飾反應使用試劑（與樣品溶液稀釋倍數(shù)）調零點，平行測定三次。

1.2.4.2 對水解物Lowry法評價的影響 1mL稀釋適當倍數(shù)的樣品溶液中加入5mL試劑甲，混勻后37℃水浴中10min；加入0.5mL試劑乙，混勻后37℃水浴中30min，測定750nm的吸光度［14］。以蒸餾水進行空白實驗，平行測定三次。

試劑甲：將10g Na2CO3、2g NaOH和0.5g酒石酸鉀鈉溶于500mL蒸餾水；將0.5g CuSO4·5H2O溶于100mL蒸餾水，使用前將兩溶液以50∶1混合。試劑乙：將福林酚試劑用標準NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑，稀釋至最終酸濃度為1mol/L。

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白質含量、蛋白質水解度的測定

1.3.1.1 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法［15］。

1.3.1.2 游離氨基含量與蛋白質水解度（DH）測定采用茚三酮法［16］。

大豆分離蛋白水解度計算公式如下：

式中：5.71-大豆蛋白質的換算系數(shù)；N1-大豆蛋白水解物的氮含量，mg/mL；0.35mmol/g-大豆分離蛋白的游離氨基含量（測定所得結果）；7.8mmol/g-大豆蛋白的肽鍵含量。

酪蛋白水解度計算公式如下：

式中：6.38-酪蛋白的換算系數(shù)；N1-酪蛋白水解物的氮含量，mg/mL；0.44mmol/g-酪蛋白的游離氨基含量（測定所得結果）；8.2mmol/g-酪蛋白的肽鍵含量。

1.3.2 抗氧化活性分析 無水乙醇溶解DPPH，使DPPH最終濃度為20μmol/L。取2mL DPPH乙醇溶液與4mL已稀釋適當倍數(shù)的樣品溶液混合，室溫下避光反應30min，測定其在517nm處的吸光度，同時用無水乙醇進行空白實驗，平行測定三次［17-18］。以DPPH自由基的清除率和樣品濃度作標準曲線，求IC50值。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：A517空白-空白樣在 517nm處的吸光度；A517樣品-樣品在517nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示。采用Excel（2003）軟件進行可重復雙因素方差分析。

2 結果與分析

兩種蛋白經(jīng)堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG）水解后，測得大豆分離蛋白、酪蛋白水解物的DH分別為9%、10%，其清除 DPPH自由基的 IC50值分別為

2.1 Fenton反應對兩種蛋白水解物的修飾

2.1.1 對兩種蛋白水解物的紫外吸收的影響 采用分光光度法評價Fenton反應對兩種蛋白水解物的紫外影響，結果如表1、表2。

從數(shù)據(jù)結果中可以看出，隨Phe∶H2O2比例的增加（即反應體系中Fenton試劑添加量的增加），兩種蛋白水解物的修飾產物在280nm處的吸光度均呈明顯增加的趨勢，且隨反應時間的變化不顯著。由于修飾反應中羥自由基進攻肽鏈中的苯環(huán)，使苯丙氨酸殘基轉化為酪氨酸殘基和進一步羥基化的衍生物；羥基是給電子基，當它與苯環(huán)的共軛體系相連時，導致大π鍵電子云流動性增大，分子中電子的躍遷的能級差減少，最大吸收向長波長方向移動，顏色加深，所以修飾產物在280nm處的吸光度會明顯增加。此外，由于羥自由基反應速度極快［19］，在短時間內（例如0.5h）已完全反應，反應時間的延長對修飾產物在280nm處的吸光度就無明顯變化。

表1 Fenton反應修飾對大豆蛋白水解物的紫外吸收影響

表2 Fenton反應修飾對酪蛋白水解物的紫外吸收影響

2.1.2 Fenton反應對水解物Lowry法測定的影響

采用Lowry法評價Fenton反應對兩種蛋白水解物的影響作用，見表3、表4。

表3 Fenton反應修飾對大豆蛋白水解物的Lowry法評價的影響

隨Fenton試劑添加量的增加，Lowry法測得蛋白質水解物修飾產物的吸光度增大，說明Fenton反應修飾使兩種修飾產物中存在的酪氨酸殘基數(shù)量增加，且增加幅度隨Fenton試劑添加量的增加而增加。同樣，在Fenton試劑添加量不變時，隨著時間的延長Lowry法測得的吸光度無明顯變化，原因同前。

表4 Fenton反應修飾對酪蛋白水解物的Lowry法評價的影響

兩種蛋白質水解物的紫外分光光度分析、Lowry法分析結果表明，F(xiàn)enton反應確實對水解物的組成產生了影響，在肽鏈中引入了新的羥基。

2.2 Fenton反應對修飾產物的抗氧化活性的影響

對蛋白水解物、Fenton反應修飾產物的抗氧化活性進行分析，選用常用的DPPH自由基清除活性評價方法，見表5、表6。

表5 Fenton反應修飾的大豆分離蛋白水解物的DPPH自由基清除活性

表6 Fenton反應修飾的酪蛋白水解物的DPPH自由基清除活性

表7 Phe∶H2O2比例和反應時間對Fenton反應修飾的影響的顯著性

從分析結果中看出，F(xiàn)enton反應修飾有效地提高了兩種蛋白質水解物的抗氧化活性。大豆分離蛋白水解物的修飾產物的IC50為1.36～2.28mg/mL，小于大豆分離蛋白水解物的IC50；同樣，酪蛋白水解物的修飾產物的IC50為0.89～2.12mg/mL，也小于酪蛋白水解物的IC50。這些結果表明修飾反應改善了兩個蛋白質水解物對DPPH自由基的清除活性。同時，F(xiàn)enton試劑添加量增加，修飾產物的IC50降低更多，表明其抗氧化活性改善幅度增加，這與肽鏈中羥基的引入水平有關；但在Fenton試劑添加量相同時，反應時間延長對修飾產物的IC50沒有明顯變化，原因還是同前所述。

2.3 Phe∶H2O2比例和反應時間對蛋白水解物Fenton反應修飾的顯著性分析

采用Excel軟件，對Phe：H2O2比例、反應時間兩個因素進行方差分析，結果見表7。

分析結果看出，Phe∶H2O2比例對修飾產物的紫外吸收、Lowry法評價和DPPH自由基清除活性的影響極顯著（P＜0.01），而反應時間影響不顯著。這表明，F(xiàn)enton試劑的添加量是影響兩種蛋白質水解物性質的主要因素，即兩種蛋白質水解物的抗氧化活性可以通過Fenton試劑的添加量而調控。

3 結論

3.1 利用堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG）分別對大豆分離蛋白、酪蛋白進行水解，制備出DH分別為9%、10%的兩個水解產物，其清除DPPH自由基的IC50值分別為2.92、2.80mg/mL。

3.2 利用Fenton反應修飾兩種蛋白質水解物后，發(fā)現(xiàn)Fenton反應導致修飾產物在280nm處的吸光度明顯增大，Lowry法評價修飾產物也表明其在750nm處的吸光度增大，說明Fenton反應修飾對兩種蛋白水解物的組成產生影響。

3.3 對DPPH自由基清除活性評價結果表明，兩種蛋白質水解物修飾產物的IC50從2.92mg/mL或2.80mg/mL降低至1.36～2.28mg/mL或0.89～2.12mg/mL，表明修飾反應可以改善蛋白質水解物的DPPH自由基清除活性。

3.4 方差分析結果表明，Phe∶H2O2比例對修飾產物的性質（包括DPPH自由基清除活性）的影響極顯著（P＜0.01），反應時間的影響不顯著（P＞0.05），表明Fenton試劑添加量是影響兩種蛋白水解物DPPH自由基清除活性的主要因素。

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Modification of two protein hydrolysates by Fenton reaction and change of their antioxidant activity

GAO Bo，XU Wei，ZHAO Xin-huai*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Soy protein isolate hydrolysates or casein hydrolysates were prepared by hydrolysis of soy protein isolate or casein with alcalase 2.4L FG respectively，and then modified by Fenton reaction.Ultraviolet absorption and Lowry assay were applied to estimate the effects of Fenton reaction on the two hydrolysates.The results indicated that the modified hydrolysates were different from the original ones and showed the impacts of Fenton reaction on the compositions of two protein hydrolysates.The antioxidant activities of the modified protein hydrolysates were analyzed for DPPH radical scavenging activity.The analysis results showed that the lC50values of the modified soy protein isolate hydrolysates or casein hydrolysates on DPPH radical were decreased from 2.92 or 2.80mg/mL to 1. 36～2.28 or 0.89～2.12mg/mL，which clearly indicated that modification of two protein hydrolysates by Fenton reaction improved their free radical scavenging activities.

soy protein isolate；casein；hydrolysates；Fenton reaction；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2010）09-0104-04

2009-10-22 *通訊聯(lián)系人

高博（1984-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

國家高技術發(fā)展計劃（863）（2006AA10Z324）。