杜巧燕，鄭璞，*，孫志浩，何毅清

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院和教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.新加坡義安理工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工藝學(xué)學(xué)院，新加坡S599489）

九株谷氨酸生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性研究

杜巧燕1，鄭璞1，*，孫志浩1，何毅清2

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院和教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.新加坡義安理工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工藝學(xué)學(xué)院，新加坡S599489）

【目的】研究九株谷氨酸生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性，為具有廣域pH耐受性的谷氨酸高產(chǎn)菌篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！痉椒ā靠疾炀胖昃牡蚿H生長(zhǎng)、高pH產(chǎn)酸特性；對(duì)磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸和香豆素的耐受性以及發(fā)酵特性?！窘Y(jié)果】Corynebacterium glutamicum S9114、Corynebacterium glutamicum ATCC 13761、Corynebacterium glutamicum T613-85均能在pH3.9下生長(zhǎng)，而在pH10.5時(shí)S9114、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、T613-85依然能夠產(chǎn)酸；抗性平板上具有明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的菌株如下：磺胺胍：S9114；酮基丙二酸：S9114、ATCC 13870；丙二酸：ATCC13761、ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354；香豆素：除 ATCC13761和 Corynebacterium melassecola ATCC 17966，其他耐受程度相似；九株菌中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的是S9114，其次是T613-85?！窘Y(jié)論】以S9114為出發(fā)菌株進(jìn)行改造，確定篩選平板為含磺胺胍2%、酮基丙二酸0.25%、丙二酸1.6%、香豆素0.2%的低pH梯度（pH 3.6～4.0）平板和高pH梯度平板（pH 10.5～11.2）。

谷氨酸生產(chǎn)菌，pH，抗性，產(chǎn)酸

谷氨酸是傳統(tǒng)的大宗發(fā)酵產(chǎn)品，相比國(guó)外，我國(guó)生產(chǎn)指標(biāo)（主要是產(chǎn)酸率和糖酸轉(zhuǎn)化率）普遍偏低［1］，亟需性狀優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。在發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸過程中，需流加氨水控制pH7.0左右，而發(fā)酵結(jié)束時(shí)，亦需向發(fā)酵液中投入大量濃硫酸調(diào)節(jié)pH 3.20～3.25，結(jié)晶谷氨酸［2］，選育耐低pH的谷氨酸生產(chǎn)菌株可以節(jié)約氨水以及濃硫酸用量，降低成本，具有實(shí)際生產(chǎn)意義；發(fā)酵流加氨水時(shí)由于粗放操作造成氨水加入量過大，或者由于攪拌問題造成發(fā)酵液局部pH過高，使菌種產(chǎn)酸降低，所以有必要選育能夠在高pH情況下高產(chǎn)酸的菌株。而對(duì)于菌種廣域pH耐受性至今未見報(bào)道。篩選谷氨酸高產(chǎn)菌過程中，抗性平板的應(yīng)用極其廣泛［3］。分析谷氨酸代謝途徑（圖1），可以選育磺胺胍［4］、酮基丙二酸、丙二酸和香豆素抗性提高的菌株實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)谷氨酸的目的。其中磺胺胍是ADP磷酸化抑制劑，丙二酸是呼吸鏈抑制劑，對(duì)該兩種抑制劑有抗性的突變體，能量代謝得以強(qiáng)化，利于谷氨酸的生產(chǎn)，而為了選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株，可通過選育酮基丙二酸抗性實(shí)現(xiàn)，香豆素是Vp類衍生物，對(duì)其有抗性的菌株細(xì)胞膜通透性較好。

表1 不同低pH下九株谷氨酸生產(chǎn)菌的固態(tài)條件生長(zhǎng)情況

表2 不同低pH下九株谷氨酸生產(chǎn)菌的液態(tài)條件生長(zhǎng)情況

圖1 谷氨酸發(fā)酵的主要代謝途徑

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

Corynebacterium glutamicum S9114（S9114），Corynebacterium glutamicum ATCC 13761（13761），Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870（13870），Corynebacterium glutamicum ATCC 14067（14067），Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354（15354），Corynebacterium melassecola ATCC 17965（17965），Corynebacterium melassecola ATCC 17966（17966），Corynebacterium glutamicum T613-41（T613-41），Corynebacterium glutamicum T613-85（T613-85）；磺胺胍、酮基丙二酸 購(gòu)自sigma公司；基本培養(yǎng)基 葡萄糖10g、NaCl 5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、瓊脂20g，定容至1L，pH7.0；種子培養(yǎng)基葡萄糖25g、K2HPO41.5g、MgSO40.6g、FeSO45mg、MnSO45mg、尿素2.5g、玉米漿30g，定容至1L，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖140g、K2HPO41g、MgSO46g、FeSO45mg、MnSO45mg、硫胺素0.05mg、尿素7g、玉米漿3g，定容至1L，pH7.0；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

752型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SBA-40C型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低pH生長(zhǎng)特性研究 固態(tài)條件：發(fā)酵培養(yǎng)基（含2%瓊脂）滅菌后用無菌飽和谷氨酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.9、3.8，將九株菌以輻射狀劃線于不同pH固體平板，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，觀察生長(zhǎng)情況。

液態(tài)條件：將九株菌分別從斜面接種至不同pH（6.0、5.5、5.0、4.5、4.3、4.0）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，220r/min搖床培養(yǎng)24h，測(cè)定發(fā)酵液的OD660。

1.2.2 高pH產(chǎn)酸特性研究 發(fā)酵培養(yǎng)基（含0.01%溴百里香酚蘭）滅菌后用NaOH調(diào)pH至8.0、9.0、10.0、10.3、10.5、11.0，其他同低pH特性相同，分別研究固液兩種條件下的產(chǎn)酸情況。

1.2.3 抗性特性研究 基本培養(yǎng)基（含2%瓊脂）中加入不同濃度抗性制成抗性平板，將九株菌呈輻射狀劃線，30℃培養(yǎng)3d。各種抗性的濃度如下：磺胺胍0.1%、0.2%、0.4%、1%、2%、4%；酮基丙二酸0.25%、0.5%；丙二酸 0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、6.4%；香 豆 素 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%。

1.2.4 發(fā)酵特性研究 菌株于基本培養(yǎng)基平板活化，接種種子培養(yǎng)基，30℃，220r/min培養(yǎng)8h后，以8%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，220r/min發(fā)酵過程中流加尿素維持pH7.0左右，40h后測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖和谷氨酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 低pH生長(zhǎng)特性研究

不同pH的平板于30℃培養(yǎng)3d后，觀察結(jié)果如表1。同時(shí)計(jì)算九株菌搖瓶培養(yǎng)24h后OD660與0h OD660的差值，評(píng)判生長(zhǎng)與否，結(jié)果見表2。

分析表1和表2，固液兩種條件下九株菌的耐受力基本一致，S9114、13761和T613-85的低pH耐受力較強(qiáng)。

2.2 高pH產(chǎn)酸特性研究

溴百里香酚蘭是堿性pH指示劑，其變色范圍是8.0～9.3（黃～藍(lán)），在菌體的培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生的谷氨酸與NaOH結(jié)合使培養(yǎng)基的pH降低而產(chǎn)生變色圈。根據(jù)變色圈的大小可以大致衡量菌株的產(chǎn)酸能力。九株菌在pH＜11.0時(shí)都能生長(zhǎng)，而在pH＞11.0都不能生長(zhǎng)，九株菌在高pH生長(zhǎng)特性上沒有明顯差別，固體平板上的產(chǎn)酸特性見表3。

表3 不同高pH下九株谷氨酸生產(chǎn)菌的固態(tài)條件產(chǎn)酸情況

表4 不同高pH下九株谷氨酸生產(chǎn)菌的液態(tài)條件產(chǎn)酸情況

表5 九株菌的磺胺胍耐受性比較

表6 九株菌的酮基丙二酸耐受性比較

表7 九株菌的丙二酸耐受性比較

表8 九株菌的香豆素耐受性比較

在搖瓶中，發(fā)酵產(chǎn)酸使發(fā)酵液pH降低，當(dāng)pH低于8.0時(shí)發(fā)酵液呈黃色，8.0＜pH＜9.3時(shí)呈綠色，pH＞9.3呈藍(lán)色。從顏色變化可以基本反映出九株菌在高pH條件下的產(chǎn)酸情況，具體見表4。

固液兩種條件，菌體在高pH下產(chǎn)酸的結(jié)果沒有矛盾，綜合固液兩種結(jié)果，S9114、13870和T613-85表現(xiàn)出了良好的高pH產(chǎn)酸性能。

2.3 抗性特性研究

針對(duì)谷氨酸的代謝途徑，選取的4種抗性磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸和香豆素，不同濃度的抗性平板30℃培養(yǎng)3d后，觀察結(jié)果，如表5。

通過觀察抗性平板上九株菌的生長(zhǎng)情況，得知九株菌對(duì)四種抗性的耐受性能有很大區(qū)別，耐受能力較強(qiáng)的菌株如下，磺胺胍：S9114；酮基丙二酸：S9114、13870；丙二酸：13761、13870、15354；香豆素：S9114、13870、14067、15354、17965、T613-41、T613-85。

2.4 發(fā)酵特性研究

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.01%的中性紅作為pH指示劑，中性紅的變色范圍pH6.8～8.0（紅→黃），發(fā)酵過程中，每2h依據(jù)發(fā)酵液顏色補(bǔ)加適量40%尿素使pH穩(wěn)定在7.0左右。發(fā)酵40h后，將發(fā)酵液稀釋100倍，通過SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖和谷氨酸的含量。結(jié)果每批每株菌的發(fā)酵液殘?zhí)呛烤陀?g/L，可認(rèn)為糖已經(jīng)耗完，產(chǎn)酸結(jié)果見圖2。九株菌中谷氨酸產(chǎn)量最多的是S9114，且平行性很好。

圖2 九株谷氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵產(chǎn)酸量比較

3 結(jié)論

九株菌均為革蘭氏陽性，其菌落形態(tài)相似，顯微鏡下均為桿狀但長(zhǎng)短不一，菌落突起表面光滑，邊緣整齊，但菌落顏色稍有不同。國(guó)外學(xué)者對(duì)該九株谷氨酸生產(chǎn)菌的形態(tài)特征、生長(zhǎng)情況、肽抗性以及可發(fā)酵碳源等有過相關(guān)研究，但對(duì)pH特性研究不夠詳細(xì)，而且未見其考察磺胺胍等抗性［5-13］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株在固態(tài)和液態(tài)條件下的生長(zhǎng)等情況基本一致。在pH實(shí)驗(yàn)中，S9114和T613-85的耐受范圍較廣；在抗性和產(chǎn)酸研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸最高的S9114只有在磺胺胍抗性中占有明顯優(yōu)勢(shì)，猜測(cè)4種抗性物質(zhì)中磺胺胍耐受程度與產(chǎn)酸量之間的關(guān)系較大。

本實(shí)驗(yàn)通過研究發(fā)現(xiàn)S9114的各種特性都略優(yōu)于其他菌株，因此選取S9114作為出發(fā)菌株，進(jìn)行后續(xù)改造實(shí)驗(yàn)，以期能得到更加高產(chǎn)而且具有pH廣域耐受性的優(yōu)良菌株。由于pH耐受機(jī)理不明［14-15］，不能采用定點(diǎn)突變等基因工程手段，本實(shí)驗(yàn)室擬采用X射線誘變以及DES誘變改造S9114，改造后的篩選使用梯度平板［16］以防止漏篩。梯度平板采用發(fā)酵培養(yǎng)基，其具體的濃度設(shè)計(jì)則依據(jù)S9114的pH特性，即低pH方向，pH3.9生長(zhǎng)，pH3.8不長(zhǎng)；高pH方向，pH10.5能夠生長(zhǎng)且產(chǎn)酸，pH11.0不能生長(zhǎng)，設(shè)計(jì)低pH梯度平板的兩層pH分別為4.0和3.6，高pH梯度平板的兩層pH分別為10.5和11.2。因?yàn)楫a(chǎn)量一般與抗性之間有一定聯(lián)系，所以在pH梯度平板中又加入磺胺胍2%、酮基丙二酸0.25%、丙二酸1.6%和香豆素0.2%，這樣可以在保證抗性的基礎(chǔ)上篩選pH特性提高的菌株。該篩選方法對(duì)其他菌的篩選有一定的借鑒作用。

［1］馮志彬，劉進(jìn)杰，王東陽，等.提高L-谷氨酸產(chǎn)量的后期發(fā)酵工藝參數(shù)研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（4）.

［2］于信令.味精工業(yè)手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1995.

［3］王帥.L-谷氨酸發(fā)酵高產(chǎn)菌選育及其發(fā)酵優(yōu)化的研究［D］.江南大學(xué)發(fā)酵工程，2008.

［4］王東陽.谷氨酸高產(chǎn)菌的原生質(zhì)體誘變育種及其發(fā)酵條件研究［D］.天津科技大學(xué)輕工技術(shù)與工程，2005.

［5］Shukuo Kinoshita，Katsunobu Tanaka，Shigezo Udaka，et al. Microbiological production of amino acid by reductive amination［P］.US 3，220，929，1965-11-30.

［6］Hirotoshi Samejima，Hiroshi Teranishi，Takashi Deguchi，et al.Process for extracting proteins from Microorganisms［P］.US 3，585，179，1971-06-15.

［7］Isamu Shiio，Koji Mitsugi，Shinichiro Otsuka，et al.Process for producing L-glutamic acid［P］.US 3，117，915，1964-01-14.

［8］Takayasu Tsuchida，Hatuo Uchibori，Hiroshi Takeuchi，et al. Process for producing L-amino acids by fermentation［P］.US 5，705，370，1998-01-06.

［9］Shinichi Motozaki，Toshinao Tsunoda，Shinji Okumura，et al. Process for producing L-glutamic acid［P］.US 3，096，252，1963 -07-02.

［10］ Kenzo Yokozeki，KojiKubota.Method ofproducing L-carnitine［P］.US 4，650，759，1987-03-17.

［11］Sotoo Yamamoto，Tetsukazu Goto，Takeyoshi Ohsawa，et al. Method for production of L-glutamic acid by microbacteria［P］. US 3，338，793，1967-08-29.

［12］ Takeyoshi Ohsawa， Mitsuru Shibukawa， Hideomi Takahashi，et al.Process for producing L-glutamic acid by using bacteria［P］.US 3，399，114，1968-08-27.

［13］Tetsukazu Goto，Shuichi Nishio，Hiroshige Kojima，et al. Process for producing L-glutamic acid by using Corynebacterium Melassecola［P］.US 3，355，359，1967-11-28.

［14］Terry Ann Krulwich.Alkaliphiles：‘ basic’molecular problems of pH tolerance and bioenergetics［J］.Molecular Microbiology，1995 15（3）：403-410.

［15］Yuhua Wang，Yan Li，Xiaolin Pei，et al.Genome-shuffing improved acid tolerance and l-lactic acid volumetric productivity in Lactobacillus rhamnosus［J］.Journal of Biotechnology，2007，129：510-515.

［16］Ranjan Patnaik，Susan Louie，Vesna Gavrilovic，et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance［J］. Nature Biotechnology，2002，20.

Biological characteristics of nine glutamate acid-producing bacteria

DU Qiao-yan1，ZHENG Pu1，*，SUN Zhi-hao1，HE Yi-qing2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education and School of Biotechnology Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Sciences&Chemical Technology，Ngee Ann Polytechnic，Singapore S599489）

【Objective】Biological characters of 9 strains of glutamic acid bacteria were investigated to provide experimental support for screening of high glutamate acid-producing bacteria with a wide range of pH tolerance.【Method】The acid production and the tolerance of the nine strains to low pH，high pH，sulfaguanidine，diethyl ketomalonate，malonicacid and coumarinwerestudied.【Result】Corynebacterium glutamicum S9114，Corynebacterium glutamicum ATCC 13761 and Corynebacterium glutamicum T613-85 had higher tolerance under low pH（pH3.9）.S9114，Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 and T613-85 could product glutamate acid at pH 10.5.Growth on the resistance plate showed the growth advantage of certain strains as follows：sulfaguanidine：S9114，diethyl ketomalonate：S9114and 13870，malonic acid：Corynebacterium glutamicum ATCC13761，ATCC13870 and Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354，coumarin：all except 13761 and Corynebacterium melassecola ATCC 17966.S9114 had the highest yield of glutamate acid【.Conclusion】Taking S9114 as the original strain to modify followed with the high or low pH，gradient screening plates consist of sulfaguanidine 2%，diethyl ketomalonate 0.25%，malonic acid 1.6%and coumarin 0.2%.

glutamate acid-producing bacteria；pH；resistance；acid production

TS201.2

A

1002-0306（2010）12-0185-04

2009-07-09 *通訊聯(lián)系人

杜巧燕（1987-），女，碩士研究生，研究方向：生物化工。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）重點(diǎn)項(xiàng)目（2006AA020301）。