劉志文，簡(jiǎn) 琛，李昆太，2，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

阿舒假囊酵母搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)核黃素的研究

劉志文1，簡(jiǎn) 琛1，李昆太1，2，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

利用搖瓶分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式考察了補(bǔ)料基質(zhì)對(duì)核黃素合成的影響。首先考察了葡萄糖補(bǔ)加濃度對(duì)阿舒假囊酵母菌體生長(zhǎng)和核黃素合成的影響，結(jié)果表明，葡萄糖的補(bǔ)加對(duì)阿舒假囊酵母的菌體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但是當(dāng)葡萄糖的補(bǔ)加濃度超過0.5g/100mL發(fā)酵液時(shí)，會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生嚴(yán)重的阻遏或抑制效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，考察了補(bǔ)加不同碳源對(duì)核黃素發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示，補(bǔ)加1.0g/100mL發(fā)酵液的蔗糖或麥芽糖雖然均利于菌體生長(zhǎng)，但同樣會(huì)對(duì)核黃素的合成具有負(fù)作用。最后考察氮源的補(bǔ)加對(duì)阿舒假囊酵母發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，補(bǔ)加酵母膏和玉米漿能顯著促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，且二者最終的核黃素合成量分別為1582.1mg/L和1816.77mg/L，均明顯高于不補(bǔ)加任何氮源實(shí)驗(yàn)方案下的1135.48mg/L。

阿舒假囊酵母，核黃素，生物合成，分批補(bǔ)料發(fā)酵

核黃素（riboflavin）又名維生素B2，化學(xué)名稱為6，7-二甲基-9-（1′-D-ribityl）-異咯嗪，其分子式為C17H20N4O6，相對(duì)分子質(zhì)量為376［1-2］。核黃素是維持機(jī)體正常代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)許多酶系統(tǒng)的重要輔基——黃素腺嘌呤二核甘酸（FAD）與黃素單核甘酸（FMN）的組成成分，參與機(jī)體的能量代謝和各種物質(zhì)代謝。目前，核黃素主要用于防治核黃素缺乏癥，如舌炎、口角炎等［3］。近幾年來研究表明，核黃素還具有利尿、降血脂和改善心臟功能等作用。由于化學(xué)合成法較為復(fù)雜且成本高，因此，核黃素主要采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)［4］。目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)核黃素的菌株主要有阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）、棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）。針對(duì)阿舒假囊酵母產(chǎn)核黃素的發(fā)酵工藝已有一些報(bào)道。例如，李嶸等［5］以阿舒假囊酵母為菌株，研究出了搖瓶發(fā)酵核黃素過程中碳源、氮源、微量元素、初始pH、接種量和促生因子等發(fā)酵條件的優(yōu)化配方。為了進(jìn)一步提高核黃素的產(chǎn)量，惠明等［6］提出，適當(dāng)減少EMP途徑的碳架物質(zhì)流而增加HMP途徑的碳架物質(zhì)與能量的代謝流，將有利于核黃素的過量合成。陸文清等［7］對(duì)核黃素的補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行了研究。分批補(bǔ)料發(fā)酵能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在某個(gè)階段維持在一定濃度，既可保證發(fā)酵過程中基質(zhì)的供給，又可有效地消除某些基質(zhì)對(duì)產(chǎn)物合成所產(chǎn)生的阻遏或抑制效應(yīng)，因此更有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成［8］。本論文對(duì)阿舒假囊酵母搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)核黃素進(jìn)行了初步研究。

表1 搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵中葡萄糖的具體補(bǔ)料模式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii） 由本實(shí)驗(yàn)室保存；斜面培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10、蛋白胨10、KH2PO42.0、MgSO41.5、瓊脂20，pH 5.6～6.0；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖 30、蛋白胨 15、玉米漿 5、KH2PO41.0、MgSO40.75，pH 5.6～6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖 50、酵母膏20、玉米漿20、KH2PO42.0、MgSO41.0、NaCl 1.0，pH 6.0～7.5；核黃素標(biāo)準(zhǔn)品上海史瑞可生物科技有限公司；玉米漿、蛋白胨 江西省國(guó)藥有限公司惠贈(zèng)；酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

搖床，可見分光光度計(jì)，電子天平等。

1.2 搖瓶培養(yǎng)方法

1.2.1 斜面培養(yǎng) 從-20℃的冰箱中取出保藏好的甘油管菌種，接種于配制好的斜面，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.2.2 種子培養(yǎng) 以無菌水洗下斜面上的菌體，制成菌懸液。取菌懸液2mL接至裝量為30mL/250mL三角瓶的種子培養(yǎng)基中，28℃在搖床上振蕩（180r/min）培養(yǎng)36h。

1.2.3 搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵 按10%接種量將培養(yǎng)好的種子液接至裝量為30mL/250mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃振蕩（180r/min）培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案在發(fā)酵過程補(bǔ)加一定量的基質(zhì)。定時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)參數(shù)，測(cè)定結(jié)果為三個(gè)平行樣的平均值。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體生物量測(cè)定 采用測(cè)量菌絲干重法（Dry cell weight，DCW）。吸10mL發(fā)酵液至離心管中，5000r/min離心，去上清液，用蒸餾水洗菌體一次，所得菌體80℃烘至恒重后稱量。

1.3.2 葡萄糖測(cè)定 采用DNS法［9］。

1.3.3 核黃素含量的測(cè)定 采用比色法［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵過程葡萄糖補(bǔ)加模式的建立

2.1.1 葡萄糖補(bǔ)加濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及核黃素合成的影響 為了更精確地從搖瓶培養(yǎng)中獲得影響核黃素產(chǎn)量變化的因素，以便從中為阿舒假囊酵母今后工業(yè)化發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供參考，在搖瓶培養(yǎng)過程中采用了分批補(bǔ)料的培養(yǎng)模式。每個(gè)搖瓶分別在第48、72、96h補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基（FM：300g葡萄糖/L），以補(bǔ)充發(fā)酵中后期菌體對(duì)基質(zhì)的需求，使得每次所補(bǔ)加的葡萄糖濃度分別為0、0.25g/100mL發(fā)酵液、0.5g/100mL發(fā)酵液、1.0g/100mL發(fā)酵液、2.0g/100mL發(fā)酵液和3.0 g/100mL發(fā)酵液。表1為具體的補(bǔ)加方案。

以上5種葡萄糖補(bǔ)加方案下，發(fā)酵最終（144h）所得的菌體量以及核黃素產(chǎn)量如圖1所示。

圖1 葡萄糖不同補(bǔ)加濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和核黃素合成的影響

由圖1a可以看出，這5種葡萄糖補(bǔ)加方案下最終所得的菌體量分別為 6.2434、10.2052、9.4844、9.0286、6.9881g/L。由此可見，當(dāng)搖瓶發(fā)酵過程不補(bǔ)加葡萄糖，所得的菌體量在所有方案中最低，這可能是由于隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行因基質(zhì)缺乏所致。但是，當(dāng)葡萄糖的補(bǔ)加濃度由0.5%逐漸升高至3.0%，所得的菌體量卻呈逐漸下降的趨勢(shì)，其中3.0%補(bǔ)加方案下所得的菌體僅為6.9881g/L。

由圖1b可以看出，這5種葡萄糖補(bǔ)加方案下最終所得的核黃素產(chǎn)量分別為 1179.45、1363.52、958.72、904.48、853.38mg/L。值得注意的是，當(dāng)補(bǔ)加的葡萄糖濃度超過0.5%（Run 3、Run 4和Run 5），盡管所得的菌體量均高于發(fā)酵過程不補(bǔ)加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)處理（Run 1），但是其核黃素效價(jià)卻明顯低于Run 1方案，而且隨著葡萄糖補(bǔ)加濃度的增大，最終核黃素產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這表明，在阿舒假囊酵母發(fā)酵產(chǎn)核黃素的過程中，發(fā)酵液中1.0%濃度以上的葡萄糖就可能會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生阻遏或抑制效應(yīng)。另外，0.5%濃度的葡萄糖補(bǔ)加方案下所得的核黃素產(chǎn)量達(dá)1363.52mg/L，明顯高于不補(bǔ)加葡萄糖下的1179.45mg/L，這再次說明通過補(bǔ)加低濃度的葡萄糖，既可保證發(fā)酵過程中基質(zhì)的供給，又可有效地消除高濃度葡萄糖對(duì)核黃素合成產(chǎn)生的阻遏或抑制效應(yīng)，從而在不降低菌體生長(zhǎng)的情況下（圖1a），不會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生負(fù)作用。

綜合以上結(jié)果，在阿舒假囊酵母發(fā)酵過程中補(bǔ)加一定量的葡萄糖，對(duì)阿舒假囊酵母的菌體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但是會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生阻遏或抑制效應(yīng)。因此，如何通過發(fā)酵過程葡萄糖的補(bǔ)加來協(xié)調(diào)菌體生長(zhǎng)與核黃素合成是工藝控制的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

2.1.2 葡萄糖補(bǔ)加濃度對(duì)阿舒假囊酵母發(fā)酵過程的影響 為了進(jìn)一步了解補(bǔ)加葡萄糖對(duì)阿舒假囊酵母發(fā)酵過程所產(chǎn)生的影響，測(cè)定了0%葡萄糖補(bǔ)加濃度（Run 1）、1.0%葡萄糖補(bǔ)加濃度（Run 3）和3.0%葡萄糖補(bǔ)加濃度（Run 5）等方案下，菌體生長(zhǎng)、總糖消耗以及核黃素合成的動(dòng)態(tài)變化情況，如圖2所示。

圖2 葡萄糖補(bǔ)加對(duì)阿舒假囊酵母發(fā)酵的影響

從圖2a可以看出，當(dāng)發(fā)酵過程不補(bǔ)加葡萄糖，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的葡萄糖濃度逐漸降低，到第72h時(shí)降低至0.86g/100mL，第96h時(shí)已接近于零；Run 3和Run 5實(shí)驗(yàn)方案由于在第48、72、96h補(bǔ)加了葡萄糖，因此該培養(yǎng)條件下在第72～144h時(shí)的發(fā)酵液葡萄糖濃度分別能維持在1.2～1.8、4.7～5.5g/100mL。

從圖2b可以看出，當(dāng)發(fā)酵過程不補(bǔ)加葡萄糖（Run 1），菌體生物量在第 96h時(shí)達(dá)到最大值（8.0030g/L），然而由于未補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致菌體因營(yíng)養(yǎng)的缺乏而自溶，表現(xiàn)在第96h以后菌體量因自溶反而開始下降，在發(fā)酵結(jié)束后（144h）菌體干重僅為6.2434g/L。對(duì)于補(bǔ)加1%和3%濃度葡萄糖的實(shí)驗(yàn)方案（Run 3和Run 5），由于及時(shí)補(bǔ)充了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌體量在第72～96h時(shí)略高于不補(bǔ)加葡萄糖的方案（Run 1）。補(bǔ)加1%濃度葡萄糖實(shí)驗(yàn)方案的菌體量在整個(gè)發(fā)酵過程中逐漸增加，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（144h）菌體干重達(dá)到9.48435g/L；然而值得注意的是，補(bǔ)加3%濃度葡萄糖實(shí)驗(yàn)方案的菌體量在第96h明顯小于補(bǔ)加1%濃度葡萄糖實(shí)驗(yàn)方案下的菌體量，且第96h在呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（144h）菌體干重僅為6.9881g/L，考慮到這個(gè)階段發(fā)酵液中的葡萄糖濃度保持在4.7～5.5g/100mL（圖2a），因此可以推斷發(fā)酵中后期高濃度的葡萄糖抑制了菌體的生長(zhǎng)。

由圖2c所示三種方案下的核黃素產(chǎn)量動(dòng)態(tài)變化可以看出，和菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)稍不同的是，雖然Run 3和Run 5在第48、72、96h補(bǔ)加了葡萄糖，但是這二者在第72～144h期間核黃素的合成量均低于不補(bǔ)加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)方案（Run 1），而且Run 5的核黃素合成量低于Run 3同期的核黃素合成量。由此可以再次分析得出，盡管補(bǔ)加1%濃度葡萄糖利于阿舒假囊酵母的菌體生長(zhǎng)，但是該濃度葡萄糖會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生阻遏或抑制作用，而且隨著發(fā)酵液中葡萄糖濃度的進(jìn)一步加大，這種負(fù)效應(yīng)更為明顯。

綜合從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1和圖2）可以推斷，高葡萄糖濃度會(huì)對(duì)核黃素的生物合成產(chǎn)生負(fù)作用，而低葡萄糖濃度又會(huì)由于基質(zhì)的缺乏而影響菌體生長(zhǎng)，因此為了解決生長(zhǎng)與合成之間的矛盾，獲得更高的核黃素產(chǎn)量，葡萄糖的限制性補(bǔ)加是一種較佳的選擇。本實(shí)驗(yàn)所示的0.5%濃度葡萄糖補(bǔ)加方式，即符合這一推論。

2.2 不同碳源的補(bǔ)加對(duì)菌體生長(zhǎng)及核黃素合成的影響

在發(fā)酵生產(chǎn)中，常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖和麥芽糖。為了考察阿舒假囊酵母分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中更適宜的補(bǔ)料碳源，分別選取了葡萄糖、蔗糖和麥芽糖三種常用碳源，在發(fā)酵過程的第48、72、96h分別補(bǔ)加1%濃度的上述碳源物質(zhì)，最終（第144h）所得的結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同碳源的補(bǔ)加對(duì)菌體生長(zhǎng)（a）及核黃素合成（b）的影響

由圖3a可以看出，在發(fā)酵過程的第48、72、96h分別補(bǔ)加1%濃度的葡萄糖、蔗糖和麥芽糖均有利于菌體的生長(zhǎng)，其最終的菌體干重分別為 9.3217、12.1242、10.8636g/L，其中補(bǔ)加蔗糖方案下所得的菌體量最大，而發(fā)酵過程不補(bǔ)加任何碳源最終所得的菌體量?jī)H為6.4152g/L。

由圖3b可以看出，補(bǔ)加葡萄糖的方案所合成的核黃素最少，僅為942.58mg/L。而補(bǔ)加蔗糖和麥芽糖方案下的核黃素產(chǎn)量分別為 1143.97mg/L和1139.96mg/L，還略低于CK（發(fā)酵過程不補(bǔ)加任何碳源）的1184.29mg/L。

綜合以上結(jié)果可以分析，盡管在發(fā)酵過程補(bǔ)加碳源促進(jìn)了阿舒假囊酵母的菌體生長(zhǎng)，但是在1%補(bǔ)加濃度下，仍然會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生一定的抑制作用。這再次說明，為了提高核黃素的產(chǎn)率，發(fā)酵過程總糖濃度的控制是一個(gè)關(guān)鍵工藝參數(shù)。

2.3 氮源的補(bǔ)加對(duì)菌體生長(zhǎng)及核黃素合成的影響

為了考察氮源的補(bǔ)加對(duì)阿舒假囊酵母菌體生長(zhǎng)及核黃素合成的影響，在搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中分別在第48、72、96h補(bǔ)加酵母膏和玉米漿，使得每次補(bǔ)加的酵母膏和玉米漿濃度為0.33g/100mL發(fā)酵液，最終（第144h）的發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。

由圖4a可以看出，在發(fā)酵過程的第48、72、96h分別補(bǔ)加0.33%濃度的酵母膏和玉米漿，其最終的菌體干重分別為10.0261g/L和7.4770g/L，均高于不補(bǔ)加任何氮源的處理，由此可見，補(bǔ)加有機(jī)氮源尤其是酵母膏能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)。與菌體量不同的是，補(bǔ)加酵母膏的實(shí)驗(yàn)方案下所得的核黃素產(chǎn)量反而低于補(bǔ)加玉米漿的方案，二者最終的核黃素合成量分別1582.10mg/L和1816.77mg/L（如圖4b所示），且均明顯高于CK處理下的1135.48mg/L。

圖4 不同氮源的補(bǔ)加對(duì)菌體生長(zhǎng)及核黃素合成的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)氮源對(duì)核黃素的合成具有顯著的促進(jìn)作用。核黃素分子（C17H20N4O6）中含有4個(gè)氮原子，因此隨著發(fā)酵的進(jìn)行，補(bǔ)加一定的氮源，可能有利于產(chǎn)物的形成。

3 結(jié)論

搖瓶分批補(bǔ)料的培養(yǎng)條件和發(fā)酵罐中進(jìn)行的分批補(bǔ)料發(fā)酵有一定的差異，但是相對(duì)于搖瓶分批發(fā)酵而言，搖瓶分批補(bǔ)料培養(yǎng)能更為全面地反映所考察的因素對(duì)菌體代謝的影響，尤其是能為發(fā)酵罐中的工藝調(diào)控提供更為客觀、有效的信息。因此，本論文對(duì)阿舒假囊酵母搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)核黃素進(jìn)行了初步研究。

3.1 考察了葡萄糖補(bǔ)加濃度對(duì)阿舒假囊酵母菌體生長(zhǎng)和核黃素合成的影響，結(jié)果表明，葡萄糖的補(bǔ)加對(duì)阿舒假囊酵母的菌體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但是當(dāng)葡萄糖的補(bǔ)加濃度超過0.5g/100mL發(fā)酵液時(shí)，會(huì)對(duì)核黃素的合成產(chǎn)生嚴(yán)重的阻遏或抑制效應(yīng)。

3.2 考察了補(bǔ)加不同碳源對(duì)核黃素發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示，補(bǔ)加1.0g/100mL發(fā)酵液的蔗糖或麥芽糖雖然均利于菌體生長(zhǎng)，但同樣會(huì)對(duì)核黃素的合成具有負(fù)作用。

3.3 考察氮源的補(bǔ)加對(duì)阿舒假囊酵母菌體生長(zhǎng)及核黃素合成的影響，結(jié)果表明，補(bǔ)加酵母膏和玉米漿能顯著促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，且二者最終的核黃素合成量分別1582.10mg/L和1816.77mg/L，均明顯高于不補(bǔ)加任何氮源實(shí)驗(yàn)方案下的1135.48mg/L。

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Study on the shake-flask fed-batch fermentation of riboflavin by Eremothecium ashbyii

LIU Zhi-wen1，JIAN Chen1，LI Kun-tai1，2，*
（1.College of Biological Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Nanchang Key Laboratory of Applied Fermentation Technology，Nanchang 330045，China）

The components of feeding medium were investigated by the shake-flask fed-batch cultivation of Eremothecium ashbyii.Firstly，the effects of various concentrations of glucose feeding on cell growth and riboflavin biosynthesis were performed.The results showed that glucose feeding could accelerate the cell growth，but the concentration of glucose feeding above 0.5g/100mL would cause lower production of riboflavin.Secondly，the study of various carbon sources on the fermentation of E.ashbyii revealed that，1.0g/100mL of sucrose or maltose had a positive effect on cell growth，and had a negative influence on riboflavin biosynthesis.Finally，the effects of nitrogen sources on the cell growth and riboflavin biosynthesis by E.ashbyii were conducted.The results showed that yeast extract and corn steep liquor could not only stimulate the cell growth，but also had a positive effect on riboflavin biosynthesis.The final riboflavin production under yeast extract or corn steep liquor feeding was 1582.1mg/L and 1816.77mg/L，respectively，which were significantly higher than that obtained without nitrogen feeding（1135.48mg/L）.

Eremothecium ashbyii；riboflavin；biosynthesis；fed-batch cultivation

TS201.2+4

A

1002-0306（2010）12-0214-04

2009-05-07 *通訊聯(lián)系人

劉志文（1967-），女，本科，實(shí)驗(yàn)師，從事微生物研究。