李琳燕,劉少英,李淑平,常 波

(1.景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院體育系,江西景德鎮(zhèn) 333001;2.吉首大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院,湖南吉首 416000; 3.韓山師范學(xué)院體育系,廣東潮州 521041;4.沈陽(yáng)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系,遼寧沈陽(yáng) 110102)

北冬蟲(chóng)夏草對(duì)一次力竭小鼠血淋巴細(xì)胞DNA損傷的影響

李琳燕1,劉少英2,李淑平3,常 波4

(1.景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院體育系,江西景德鎮(zhèn) 333001;2.吉首大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院,湖南吉首 416000; 3.韓山師范學(xué)院體育系,廣東潮州 521041;4.沈陽(yáng)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系,遼寧沈陽(yáng) 110102)

目的:探討北冬蟲(chóng)夏草對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)后機(jī)體自由基代謝的影響和消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)理。方法:昆明種小鼠 64只,隨機(jī)分為四組:正常對(duì)照組(NC組)16只、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(EC組)16只、運(yùn)動(dòng) +北冬蟲(chóng)夏草組(ECM組)16只、運(yùn)動(dòng) +人參組(EP組)16只。采用單細(xì)胞凝膠電泳法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法分別測(cè)定血液淋巴細(xì)胞DNA的損傷、血清MDA的含量、血清 SOD和 GSH-Px的活性。結(jié)果:①與NC組相比,EC組大鼠血清MDA含量顯著增加(P＜0.01),血清 SOD和 GSH-Px活性顯著下降(P＜0.01)。與 EC組相比,ECM組大鼠血清MDA含量顯著下降(P＜0.01),血清 SOD活性明顯增高 (P＜0.05),GSH-Px活性顯著增高 (P＜0.01); EP組大鼠血清MDA含量顯著下降(P＜0.01),血清 SOD和 GSH-Px活性顯著增高 (P＜0.01)。②與 NC組相比, EC組大鼠血液淋巴細(xì)胞尾長(zhǎng)、尾矩及橢圓矩顯著增加 (P＜0.01)。與 EC組相比,ECM組大鼠血液淋巴細(xì)胞尾長(zhǎng)、尾矩及橢圓矩顯著降低 (P＜0.01);EP組大鼠血液淋巴細(xì)胞尾長(zhǎng)、尾矩及橢圓矩顯著降低 (P＜0.01)。結(jié)論:北冬蟲(chóng)夏草可以提高小鼠血清 SOD、GSH-Px的活性,降低血清MDA的含量,自由基對(duì)DNA的直接損傷,對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠血液淋巴細(xì)胞DNA的損傷具有保護(hù)作用,與人參的作用效果相類(lèi)似。

北冬蟲(chóng)夏草;力竭;淋巴細(xì)胞;DNA

近年來(lái),有關(guān)活性氧的產(chǎn)生及其對(duì)生物分子的損傷機(jī)理研究受到各學(xué)科的普遍重視,許多疾病與活性氧的介入有密切關(guān)系,尤其是羥自由基(OH·),作為最活潑的活性氧自由基與任何生物分子都可以以極快的反應(yīng)速率發(fā)生反應(yīng)。雖然OH·對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類(lèi)等均可引起不同程度的損傷,但其對(duì) DNA的氧化損傷及其與疾病的關(guān)系越來(lái)越受到科學(xué)界更廣泛的關(guān)注。已有的研究結(jié)果直接或間接證明了急、慢性運(yùn)動(dòng)可引起氧自由基的增加,從而造成了機(jī)體一系列病理?yè)p傷。通過(guò)給小鼠補(bǔ)充北冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵液,5周后進(jìn)行一次力竭運(yùn)動(dòng),觀察運(yùn)動(dòng)源性自由基對(duì)血淋巴細(xì)胞 DNA的損傷情況以及血清MDA含量、血清 SOD和 GSH-Px活性的變化,探討北冬蟲(chóng)夏草對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)后機(jī)體自由基代謝的影響和消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)理,為北冬蟲(chóng)夏草和遼東楤木在訓(xùn)練、比賽中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)用雄性昆明種小鼠 64只,四周齡,體重 17～28g,由沈陽(yáng)市雙義實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供,合格證號(hào):SCXK(遼)2003 -0012。

常規(guī)分籠飼養(yǎng),環(huán)境溫度為 (23±3)℃,相對(duì)濕度為70%～80%。每天定時(shí)通風(fēng),自由飲水,飼料由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每日記錄飲食量、體重,清洗飲水器,隔日清洗,消毒籠具,更換墊料,每周室內(nèi)消毒兩次[1]。

1.2 藥物

北冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵液,主要成分有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖等,由沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥理教研室提供,給藥前按 2g/kg體重用蒸餾水配成所需溶液。人參莖葉提取物,淺黃色粉末,主要有效成分為皂甙類(lèi)化合物,由沈陽(yáng)藥科大學(xué)神經(jīng)藥理教研室提供,給藥前按 30mg/kg體重用蒸餾水配成所需溶液[1]。小鼠灌胃量為 0.1ml/10g體重,安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組按 0.1ml/10g體重用蒸餾水灌胃。每天一次,持續(xù) 5周。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)隨機(jī)設(shè)計(jì)原則,將實(shí)驗(yàn)小鼠按體重分層,隨機(jī)分為四組,分組情況如下:

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng) +服藥組小鼠于最后一次灌胃后,次日晨進(jìn)行一次力竭游泳運(yùn)動(dòng)。玻璃池規(guī)格:100×60×70cm,水溫(34±2)℃,每天光照 12h,水深 45cm,約為小鼠身長(zhǎng)的3倍[1]。記錄小鼠力竭時(shí)間,力竭判斷的標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠頭下沉 10s不上浮,放在平面上無(wú)法完成翻正反射[2]。

1.4 主要試劑與儀器

1.4.1 主要試劑 ①SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所);②MDA試劑盒 (南京建成生物工程研究所);③GSHPx試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.4.2 主要儀器 VANOX型OLY MPUS熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);載玻片 (1.5×76×26mm±0.5)全磨砂片(秦皇島秦寧玻璃廠);LUC IA Ver 4.71彗星實(shí)驗(yàn)分析軟件系統(tǒng) (捷克 Laboratory Imaging公司);721分光光度計(jì) (上海第三分析儀器廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

力竭游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后,隨機(jī)剔除多余小鼠,取樣。

1.5.1 血清的制備及血清MDA含量、SOD和 GSH-Px活性的測(cè)定 采用眼眶取血方法,把血樣置于無(wú)抗凝劑的離心管中,于 4℃靜置使其充分凝固,以 3 500r/min的轉(zhuǎn)速離心15min,取上清液備用[1,2]。血清MDA含量、SOD和 GSH-Px活性的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明操作。

1.5.2 小鼠血液淋巴細(xì)胞DNA損傷的測(cè)定[4-6]避光條件下,采用眼眶取血法,取 0.2 ml全血放入肝素抗凝管,用不含鈣、鎂的磷酸鹽緩沖液 (PBS)等量稀釋,輕輕混勻后,備用。

1)制片

第一層為正常熔點(diǎn)瓊脂糖 (NMA):將含 100μl 1% NMA的 PBS緩沖液滴在載玻片上,迅速蓋上干凈的 1號(hào)蓋玻片,置 4℃下 10 min使 NMA凝固。第二層為含細(xì)胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖 (LMA):將待測(cè)細(xì)胞液與含 0.5%LMA的 PBS緩沖液 1:1混合,繼之,揭去 1號(hào)蓋玻片,輕輕刮去第一層凝膠,迅速將 100μl含有細(xì)胞的LMA滴到第一層瓊脂糖上,立即蓋上 2號(hào)蓋玻片,置 4℃下 15 min使LMA凝固。

2)細(xì)胞裂解

移去 2號(hào)蓋玻片,將載玻片浸入新配制的預(yù)冷的 4℃細(xì)胞裂解液中 (pH=10,含 2.5 mol/L NaCl,100 mmol/L Na2EDTA,10 mmol/L Tris-HCl,用前加 1%TritonX-100, 10%DMSO)2h。

3)DNA堿解旋

將載玻片取出,置于水平電泳槽的陽(yáng)極端,電泳槽中盛有新配制的堿性電泳緩沖液 (pH=13,1mmol/L Na2EDTA, 300 mmol/L NaOH),約覆過(guò)載玻片膠面 0.25cm左右,于 4℃放置 40min。

4)電泳

在電壓 22～23V、電流 300mA下,電泳 30min。電壓、電流可通過(guò)改變緩沖液的液面高度來(lái)調(diào)節(jié)。

5)中和和染色

電泳后將載玻片取出,用 0.4 mol/L Tris-HCl(pH= 7.5)緩沖液中和三次,每次 5 min。在裂解缸中再緩緩加入無(wú)水乙醇,將載玻片浸埋 1h之后,取出涼干。每張載玻片用0.004%的溴化乙啶 (EB)水溶液 50μl染色,再蓋上 3號(hào)蓋玻片染色至少 1h。

6)閱片

EB染色后的樣本應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察電泳圖像。在熒光顯微鏡下,DNA被染成紅色,若沒(méi)有發(fā)生DNA斷裂,無(wú)DNA斷片,則從頭向陽(yáng)極遷移的細(xì)胞只有一個(gè)圓形的熒光頭;發(fā)生了 DNA斷裂的細(xì)胞則表現(xiàn)為斷片離開(kāi)頭部向陽(yáng)極方向遷移,形成一個(gè)像彗星樣的拖尾。每個(gè)樣本隨機(jī)觀察 40個(gè)細(xì)胞,使用LUC IA軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用 SPSS10.0數(shù)據(jù)軟件包進(jìn)行處理,采用平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示,組間采用單因素方差分析判斷總體顯著性差異,顯著性水平定在 P＜0.05和 P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后各組小鼠血清MDA含量、SOD和 GSH -Px活性的變化

與NC組相比,EC組小鼠血清MDA含量顯著增加(P＜0.01);血清 SOD和 GSH-Px活性顯著下降(P＜0.01)。

與 EC組相比,ECM組小鼠血清MDA含量顯著下降(P＜0.01),血清 SOD活性明顯增高 (P＜0.05),GSH-Px活性顯著增高 (P＜0.01)。EA組小鼠血清MDA含量顯著下降(P＜0.01),血清 SOD和 GSH-Px活性顯著增高 (P＜0.01)。EP組小鼠血清MDA含量顯著下降(P＜0.01),血清SOD和 GSH-Px活性顯著增高(P＜0.01)。

與 EP組相比,ECM和 EA組小鼠血清MDA含量、SOD和 GSH-Px的活性均無(wú)顯著性差異(表 1)。

表1 Changes ofMDA、SOD and GSH-Px inserum of rats in different groups(±s)(n=8)

表1 Changes ofMDA、SOD and GSH-Px inserum of rats in different groups(±s)(n=8)

注:compared with NC group:△△P＜0.01;compared with EC group:＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;1,2,3,4 group represent differently NC,EC,ECM,EP group,below table is the same。

Group MDA (nmol/ml) SOD (U/ml) GSH-Px (U/0.1ml) 1 23.95±3.18 110.98±12.97 453.44±26.81 2 39.77±4.48△△ 68.81±8.11△△ 270.58±23.08△△3 30.60±2.66＊＊ 82.28±10.45＊ 363.61±39.86＊＊4 31.18±2.06＊＊ 89.22±10.68＊＊ 372.22±56.34＊＊

2.2 一次力竭運(yùn)動(dòng)后各組小鼠血液淋巴細(xì)胞DNA損傷的情況

本實(shí)驗(yàn)采用單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)血液中單個(gè)淋巴細(xì)胞DNA的損傷情況,通過(guò)尾長(zhǎng)、尾矩、橢圓矩等指標(biāo)來(lái)反映DNA的損傷情況。

尾長(zhǎng) (Tail length),即沿電泳方向“彗星”尾部最遠(yuǎn)端與頭部中心間的距離,是損傷DNA碎片的遷移長(zhǎng)度,在低損傷劑量范圍內(nèi)與損傷劑量成線性關(guān)系。當(dāng)損傷因素作用劑量大到一定程度時(shí),DNA損傷程度明顯增加而尾長(zhǎng)基本不變。

尾矩(Tailmoment)是指尾部 DNA占總 DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積。

橢圓矩(Olive moment)是以“彗星”頭部中心點(diǎn)為零點(diǎn),沿電泳方向?qū)ⅰ板缧恰卑匆欢ǖ拈g隔分成若干個(gè)區(qū)域 (80個(gè)即可),分別測(cè)定每個(gè)區(qū)域熒光強(qiáng)度 (Di,代表該區(qū)域 DNA量)、該區(qū)域中心距零點(diǎn)的距離 (Xi)、“彗星”總熒光強(qiáng)度(Dt,代表總DNA量),則橢圓矩定義為Σ(Di×Xi)/Dt。由于定義尾矩時(shí),將“彗星”尾部當(dāng)作一個(gè)整體考慮,將頭尾部中心間距當(dāng)作損傷 DNA的平均遷移距離。但事實(shí)上尾部DNA的分布并不均勻,所以橢圓矩與作用劑量間的相關(guān)性比尾矩更密切。

與NC組相比,EC組小鼠血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距顯著增高 (P＜0.01)。

與 EC組相比,ECM組小鼠血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距顯著降低 (P＜0.01)。EP組小鼠血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距顯著降低 (P＜0.01)。

與 EP組相比,ECM組小鼠血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距均無(wú)顯著性差異(表 2)。

表2 Changes of the DNA damage of lymphocyte in rats in different groups(±s)(n=8)

表2 Changes of the DNA damage of lymphocyte in rats in different groups(±s)(n=8)

Group Tail length Tailmoment Olive moment 1 10.131±1.421 0.373±0.110 0.719±0.155 2 34.638±3.825△△ 3.400±0.554△△ 2.261±0.528△△3 11.942±2.485＊＊ 0.585±0.155＊＊ 0.882±0.170＊＊4 14.088±2.194＊＊ 0.547±0.137＊＊ 1.015±0.354＊＊

2.3 小鼠血液各指標(biāo)的相關(guān)分析

血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距與血清MDA含量顯著正相關(guān) (P＜0.01)。血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距與血清 SOD活性顯著負(fù)相關(guān) (P＜0.01)。血液淋巴細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距與血清 GSH-Px活性顯著負(fù)相關(guān) (P＜0.01)(表 3)。

表3 Correlation analyse of the item s

3 分析與討論

3.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠血清自由基代謝、血液淋巴細(xì)胞DNA的影響

3.1.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠血清自由基代謝的影響 自由基 (free radical)是指外層軌道上含有未配對(duì)電子的分子、原子、離子等物質(zhì)。在生物體內(nèi)主要是指氧自由基。在生命活動(dòng)全過(guò)程中,時(shí)時(shí)伴有內(nèi)源性自由基的不斷產(chǎn)生和不斷清除。正常情況下,體內(nèi)的自由基保持在低濃度的動(dòng)態(tài)平衡中,對(duì)機(jī)體不會(huì)造成傷害,但在特殊情況下,如大強(qiáng)度或力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)使體內(nèi)自由基生成增多而抗氧化酶活性相對(duì)不足,結(jié)果導(dǎo)致體內(nèi)大量的自由基堆積并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷作用。自由基的毒性作用主要是直接損傷細(xì)胞膜,使細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)內(nèi)多不飽和脂肪酸(PUFA)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),也使具有膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、線粒體膜等生物膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,導(dǎo)致細(xì)胞的廣泛性損傷[7]。

丙二醛(MDA)是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物,其含量可以間接反映運(yùn)動(dòng)時(shí)自由基的生成。目前對(duì)運(yùn)動(dòng)后血液MDA含量變化的報(bào)道不盡一致。普遍認(rèn)為,血液MDA含量不僅與運(yùn)動(dòng)的模式、強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間有關(guān),還與脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。有報(bào)道一次急性運(yùn)動(dòng)后血漿MDA含量明顯增加;在極量和亞極量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)下血漿MDA的含量均比安靜時(shí)顯著增加,且極量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后,MDA含量也非常明顯高于亞極量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后[8,9]。但也有不同報(bào)道,倪耀華發(fā)現(xiàn)以 30%和 70%最大攝氧量的強(qiáng)度踏車(chē)至力竭時(shí),血漿中MDA含量較安靜時(shí)顯著增加,但以 90%最大攝氧量的強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)卻未發(fā)現(xiàn) MDA含量有顯著變化[9]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次力竭運(yùn)動(dòng)后,與正常對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng)對(duì)照組小鼠血清MDA含量顯著增加,運(yùn)動(dòng)后血液MDA含量增加的原因可能是急性運(yùn)動(dòng)中,線粒體氧利用率增加,為氧的單電子還原提供了可能。另外在氧運(yùn)輸過(guò)程中,血紅蛋白和肌紅蛋白自動(dòng)氧化成高鐵血紅蛋白和高鐵肌紅蛋白過(guò)程中也可以產(chǎn)生自由基。

急性運(yùn)動(dòng)中組織相對(duì)缺氧和無(wú)氧代謝加強(qiáng)也是自由基產(chǎn)生增加的一個(gè)重要原因。在正常生理情況下,嘌呤核昔酸進(jìn)行合成和分解,黃嘌呤脫氫酶催化黃嘌呤與 NAD十結(jié)合生成尿酸和NADH,不產(chǎn)生自由基。缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP分解加劇,AMP劇增,進(jìn)一步使黃嘌呤、次黃嘌呤生成增加。同時(shí)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度增高激活鈣依賴(lài)性蛋白酶,黃嘌呤脫氫酶在此酶的作用下轉(zhuǎn)化成黃嘌呤氧化酶,激活的黃嘌呤氧化酶作用于黃嘌呤、次黃嘌呤便可使 O2還原成 O-2,并從而激發(fā)一系列的自由基反應(yīng)。另外機(jī)體缺氧,乳酸生成增多,并在體內(nèi)堆積。乳酸的還原使胞漿NADH、NADPH濃度下降,體內(nèi)自由基抗氧化酶受破壞,不足以清除生成增加的自由基。

其他組織器官的氧化應(yīng)激產(chǎn)物釋放入血。關(guān)于急性運(yùn)動(dòng)后骨骼肌、肝臟、心肌、腎臟自由基產(chǎn)生已有大量的直接和間接證據(jù),并且已經(jīng)證實(shí),疲勞組織中產(chǎn)生的 OFR可以在細(xì)胞外檢測(cè)到[7-9]。

超氧化物歧化酶 (SOD)是唯一以氧自由基為底物的酶類(lèi),胞漿中的 CuSOD、ZnSOD等可以催化歧化為 H2O2和O2,從而起到清除的作用,而MnSOD可以清除線粒體中80%以上的;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)可以分解過(guò)氧化氫及有機(jī)過(guò)氧化物,將其還原為 H2O和無(wú)毒醇類(lèi)。

運(yùn)動(dòng)對(duì)血液超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的影響,目前的研究結(jié)果尚存在分歧。楊陽(yáng)等報(bào)道小鼠游泳力竭后即刻血液中 SOD、GSH-Px活性顯著下降;吳宏軍等發(fā)現(xiàn)小鼠爬桿力竭運(yùn)動(dòng)后即刻血漿 SOD活性明顯下降;有學(xué)者報(bào)道小鼠游泳力竭后即刻、6小時(shí)及 24小時(shí)后,血清 GSH -Px活性均顯著低于對(duì)照組。但一些報(bào)道認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致血液 SOD,GSH-Px活性增強(qiáng)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度愈高,SOD、GSH -Px活性增高愈明顯,認(rèn)為運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致其活性增高是機(jī)體適應(yīng)的結(jié)果。這些研究結(jié)果的不一致,可能與運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間等有關(guān)[10]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次力竭運(yùn)動(dòng)后,與正常對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng)對(duì)照組小鼠血清 SOD、GSH-Px活性顯著下降。出現(xiàn)這種變化的原因可能是:運(yùn)動(dòng)后血液中的氧自由基顯著增加,血液中的抗氧化酶絕對(duì)或相對(duì)不足,而且氧自由基的還原產(chǎn)物H2O2對(duì) SOD本身也有殺傷作用[11]。

3.1.2 一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠血液淋巴細(xì)胞DNA的影響運(yùn)動(dòng)造成的細(xì)胞 DNA損傷與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)方式等有關(guān)。有學(xué)者[12]選用 12個(gè)健康的受試者做了一次大運(yùn)動(dòng)量的自行車(chē)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)后將淋巴細(xì)胞分離出來(lái)做 DNA鏈斷裂的分析,發(fā)現(xiàn)在高原低氧環(huán)境中 DNA的斷裂程度在運(yùn)動(dòng)后即刻增加;但在海平面的運(yùn)動(dòng)后卻沒(méi)發(fā)現(xiàn)有 DNA斷裂的現(xiàn)象。Hartmann A等研究發(fā)現(xiàn)受試者在功率自行車(chē)上跑步直到力竭,運(yùn)動(dòng)后 24小時(shí)取血樣,在所有的受試者血樣中都可見(jiàn)到明顯的白細(xì)胞DNA鏈斷裂。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次力竭運(yùn)動(dòng)后,運(yùn)動(dòng)對(duì)照組與正常對(duì)照組相比,反映小鼠血液淋巴細(xì)胞 DNA損傷的指標(biāo) (尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距)顯著增加,且與血清MDA含量顯著正相關(guān),與血清 SOD、GSH-Px活性顯著負(fù)相關(guān),這與前人研究結(jié)果相一致[13]。其原因可能是:一次力竭運(yùn)動(dòng)后,機(jī)體自由基大量產(chǎn)生,超過(guò) SOD、GSH-Px的防御能力。雖然不直接作用于DNA,但通過(guò)超氧化物歧化酶 (SOD)的作用可產(chǎn)生H2O2,當(dāng) H2O2不能被及時(shí)清除時(shí),H2O2可進(jìn)一步通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)生活性更高的OH·,OH·中極為活潑的單電子容易與親核性的DNA分子結(jié)合,OH·可與脫氧核糖反應(yīng),產(chǎn)生核糖自由基,后者進(jìn)一步導(dǎo)致堿基從DNA上脫落下來(lái),甚至造成DNA鏈斷裂。脂質(zhì)過(guò)氧化物可以同樣的方式造成 DNA損傷。斷裂的DNA鏈需要不斷進(jìn)行修復(fù),而參與DNA修復(fù)的酶也同時(shí)會(huì)受到自由基的攻擊而影響其功能的發(fā)揮。

3.2 北冬蟲(chóng)夏草和人參莖葉提取物對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)小鼠血清自由基代謝及血液淋巴細(xì)胞DNA損傷的影響

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練或體育健身引起疲勞后,如果不采取有效措施予以消除,不僅會(huì)影響運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和體育健身,還有可能引起病理性變化,使身體健康受到損害。由此可見(jiàn),研究運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的機(jī)制對(duì)于減輕和消除運(yùn)動(dòng)性疲勞、促進(jìn)身體健康是有重要意義的。

隨著自由基研究不斷深入,已明確羥自由基是最活潑的氧自由基之一,可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化,蛋白質(zhì)解聚、聚合、核酸斷裂和多糖裂解等生化過(guò)程,引發(fā)組織細(xì)胞病變而導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。已有的研究結(jié)果直接或間接證明了急、慢性運(yùn)動(dòng)可引起氧自由基的增加,從而造成了機(jī)體一系列病理?yè)p傷[14]。適量補(bǔ)充外源性清除羥自由基藥物,可預(yù)防這類(lèi)損傷和病變的發(fā)生與發(fā)展。北冬蟲(chóng)夏草(CordycepsmilitarisLink)又稱(chēng)北蟲(chóng)草、蛹蟲(chóng)草,是蟲(chóng)草屬真菌侵染到昆蟲(chóng)蛹體上形成的子實(shí)體。與冬蟲(chóng)夏草同屬不同種,具有類(lèi)似冬蟲(chóng)夏草的藥理作用:包括鎮(zhèn)靜、延長(zhǎng)睡眠、抗氧化、抗缺氧作用,可替代冬蟲(chóng)夏草入藥。主要含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖、SOD、蛋白質(zhì)、維生素 10余種、礦質(zhì)元素20余種。據(jù)祖國(guó)醫(yī)著《本草綱目》、《藥性考》以及現(xiàn)代研究表明,它具有保健益腎,止血化痰,秘精益氣,陰陽(yáng)雙補(bǔ),增強(qiáng)免疫力等多種功能[15]。

已有研究結(jié)果顯示:北蟲(chóng)草對(duì)氧自由基和羥自由基具有明顯的清除作用,其清除羥自由基的作用強(qiáng)于羥自由基的特異清除劑甘露醇,表明:北蟲(chóng)草具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[16,17]。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道,蟲(chóng)草菌粉可明顯降低老齡大鼠血漿中MDA水平,以及肝組織中MDA水平;人工蟲(chóng)草菌絲體能明顯降低衰老模型小鼠全血MDA水平;使血中 SOD水平及 GSH-Px活性升高[17]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次力竭運(yùn)動(dòng)后,蟲(chóng)草組小鼠血清MDA含量均顯著下降,血清 SOD活性明顯增高,GSH-Px活性顯著增高;反映血液淋巴細(xì)胞 DNA損傷的指標(biāo):尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距均顯著降低。

蟲(chóng)草素和D-甘露醇可能是蟲(chóng)草中對(duì)自由基具有清除作用的有效成分之一,其中蟲(chóng)草素對(duì)超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的特異性清除作用,對(duì)羥自由基的清除作用較弱,而蟲(chóng)草中含有的D-甘露醇本身就是羥自由基的特異性清除劑,所以可以推測(cè)蟲(chóng)草對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用來(lái)自于蟲(chóng)草素等組分,而對(duì)羥自由基的清除作用是蟲(chóng)草素和D-甘露醇等組分共同作用的結(jié)果。推斷蟲(chóng)草對(duì)自由基的清除作用主要是其主要有效成分蟲(chóng)草素和 D-甘露醇共同作用的結(jié)果[17]。此外,對(duì)蟲(chóng)草素和 DNA作用的紫外熒光光譜的研究表明,蟲(chóng)草素和DNA確實(shí)存在相互作用,通過(guò)磷酸鹽和作Scatchard方程作圖推測(cè)蟲(chóng)草和 DNA作用方式為混合方式,即蟲(chóng)草素可與 DNA的磷酸基團(tuán)作用,蟲(chóng)草素還可以插入DNA雙螺旋的嵌插方式存在,至于是否還存在其他作用方式有待進(jìn)一步研究。

人參莖葉提取物抗自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用已被證實(shí)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次力竭運(yùn)動(dòng)后,與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比,人參組小鼠血清MDA含量顯著下降,血清 SOD和 GSH-Px活性顯著增高,這與有關(guān)的報(bào)道相一致[3]。蟲(chóng)草和遼東楤木組與人參組相比,血清MDA含量、SOD及 GSH-Px活性均沒(méi)有顯著性差異,提示北蟲(chóng)草和遼東楤木具有與人參類(lèi)似的抗氧化作用。

有關(guān)人參莖葉提取物對(duì)遺傳物質(zhì)損傷的保護(hù)作用已有報(bào)道[42],但對(duì)運(yùn)動(dòng)后血液淋巴細(xì)胞 DNA損傷的保護(hù)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了人參莖葉提取物對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠血液淋巴細(xì)胞 DNA損傷的影響,發(fā)現(xiàn)人參組小鼠反映血液淋巴細(xì)胞 DNA損傷的指標(biāo)——尾長(zhǎng)、尾距和橢圓距均顯著降低,說(shuō)明人參莖葉提取物對(duì)此運(yùn)動(dòng)造成的血液淋巴細(xì)胞DNA損傷起到了一定的保護(hù)作用。與人參組相比,蟲(chóng)草組反映DNA損傷的指標(biāo)均沒(méi)有顯著性差異,提示北蟲(chóng)草對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)小鼠血液淋巴細(xì)胞 DNA損傷的保護(hù)作用與人參的作用相類(lèi)似。

4 結(jié)論

1)北冬蟲(chóng)夏草可以提高小鼠血清 SOD、GSH-Px的活性,降低血清MDA的含量,減少了自由基對(duì)DNA的直接損傷。

2)北冬蟲(chóng)夏草對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠血液淋巴細(xì)胞DNA的損傷具有保護(hù)作用,與人參的作用效果相類(lèi)似。

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Effect of CordycepsM ilitarisL on DNA Damage of Lymphocyte in Blood ofM ice After Exhaustive Exercise

L I L inyan1,L IU Shaoying2,L I Shuping3,CHANG B o4
(1.D epar tm ent of Physical Education,Jingdezhen Ceram ic Institute,Jingdezhen333001,Jiangxi,China;
2.Sports Science Institute of Jishou U niversity,Jishou416000,Hu’nan,China;
3.D epartm ent of Physical Education,Hanshan N orm al U niversity,Chaozhou521041,Guangdong,China;
4.D epartm ent of Hum an Exercise Science,Shenyang Sport U niversity,Shenyang110102,L iaoning,China)

O bjective:To provide the experim ental evidences for Cordyceps m ilitaris L staving and el im inating exercise-induced fatigue.M ethods:sixty m ouses w ere divided into4groups at random:norm al contrast group(NC,n=16),exercise contrast group(EC,n=16),exercise and Cordyceps m ilitaris L group(ECM,n=16),exercise and Panax ginseng group (EP,n=16).The authors adopted exhaustive exercise.In order to m ake sure there w ere8rats in every group,the authors el im inated the superabundance rats random ly after the exercise and m easured the DNA dam age of lymphocyte,m alondialdehyde(MDA)content,superoxide dism utase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)activities in serum of rats by SCGE,TBA,XO and D TNB m ethods.Results:(1)Compared w ith NC group,theMDA content increased rem arkably(P＜0.01),the SOD and GSH-Px activities in serum of rats decreased m arkedly in EC group(P＜0.01).Compared w ith EC group,the MDA content decreased rem arkably(P＜0.01),the SOD activities in serum of rats increased in ECM group(P＜0.05),the GSH-Px activities in serum of rats increased m arkedly in ECM group(P＜0.01);the MDA content decreased m arkedly(P＜0.01),the SOD and GSH-Px activities in serum of rats increased rem arkably in EP group rats(P＜0.01).(2)Compared w ith NC group,Tail length,Tailm om ent and O live m om ent of lymphocyte increased observably in EC group rats(P＜0.01).Compared w ith EC group,Tail length,Tail m om ent and O live m om ent in ECM group rats reduced evidently(P＜0.01);there w ere an obvious decrease in Tail length,Tail m om ent and O live m om ent(P＜0.01)in EP group rats.Conclusion:(1)Cordyceps m ilitaris L can elim inate the free radical,enhance the SOD and GSH-Px activities in serum of rats and reduce the dam age of DNA caused by OH·etc.(2)Cordyceps m ilitaris L can attenuate exerciseinduced DNA dam age after exhaustive exercise.The function is sim ilar to that of Panax ginseng.

Cordyceps m ilitaris L;exhaustive exercise;lymphocyte;DNA dam age

常 波(1964-),男,教授,博士,沈陽(yáng)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系,E-mail:changbo8387@163.com,Tel:024-89166366;15949278858。

G804.7

A

1004-0560(2010)05-0048-05

2010-08-12;

2010-09-09

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目:不同中藥提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練鼠腦組織代謝和調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究,項(xiàng)目編號(hào)為 2009A670。

李琳燕(1977-),女,講師,碩士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué)。

責(zé)任編輯:喬艷春

?體育人文社會(huì)學(xué)