汪林 儲(chǔ)冰峰 王成龍 劉洪臣 邵寧生 楊光 董潔 劉玉

IPTG誘導(dǎo)變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶可溶性表達(dá)及活性初步測(cè)定*

汪林 儲(chǔ)冰峰 王成龍 劉洪臣 邵寧生 楊光 董潔 劉玉

目的：提取變形鏈球菌GS5葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF(glucosy ltransferase)催化活性區(qū)(CAT)的基因，利用IPTG誘導(dǎo)后獲得可溶性表達(dá)，并檢測(cè)活性。方法：利用PCR技術(shù)克隆CAT的基因片段，通過(guò)蛋白重組融合表達(dá)技術(shù)使其在大腸桿菌BL21中表達(dá)，利用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)含有質(zhì)粒pET32-NusA-CAT的大腸桿菌，SDS－PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)；采用蒽酮硫酸法驗(yàn)證活性。結(jié)果：成功將CAT基因連入大腸桿菌BL21，獲得可溶性的融合蛋白表達(dá)；并且融合蛋白具有生物學(xué)活性。結(jié)論：IPTG成功誘導(dǎo)克隆的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性區(qū)基因并獲得可溶性融合蛋白的表達(dá)，具有生物學(xué)活性。

變形鏈球菌;葡糖基轉(zhuǎn)移酶;大腸桿菌

葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosy ltransferase，GTF)是變形鏈球菌合成的重要致齲因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在內(nèi)的多種胞外多糖[1]，包含催化活性區(qū)(Cataly tic,CAT)和葡聚糖結(jié)合區(qū)(Glucan binding, GB或GLU)兩個(gè)功能區(qū)段[2]，催化活性區(qū)具有催化蔗糖水解的活性，能夠催化蔗糖產(chǎn)生葡聚糖[3]。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑可與阻遏物結(jié)合促進(jìn)基因的表達(dá)，但是IPTG對(duì)人體具有潛在的毒性[4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)PCR方法獲得CAT區(qū)的基因片段，并將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32-NusA中，摸索IPTG合適的誘導(dǎo)條件，使大腸桿菌BL21高表達(dá)其融合蛋白，為后續(xù)篩選GTF的拮抗劑打下基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及細(xì)胞株變形鏈球菌GS5購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；大腸桿菌BL21和pET-32a由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所保存。

1.1.2 主要試劑DNA純化回收試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ,H indⅢ均購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自法特捷公司；Taq DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶均購(gòu)自天為時(shí)代公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GTF的CAT基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定質(zhì)粒pET-32a和PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行H indⅢ和XhoⅠ雙酶切及切膠回收,連接后轉(zhuǎn)化E. coliBL21。雙酶切pET－32-NusA載體(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所保存)體系：pET－32-NusA載體3μl，H indⅢ1μl，XhoⅠ1μl，Buffer M 2μl，ddH2O13μl,總體積20μl。挑單克隆提取質(zhì)粒做PCR和雙酶切鑒定。

1.2.2 GTF融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)鑒定將測(cè)序鑒定后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21,挑取單克隆過(guò)夜培養(yǎng)。將10μL連接產(chǎn)物加入200μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中(體積不超過(guò)感受態(tài)體積的5%)，轉(zhuǎn)入1m lM.S.A培養(yǎng)基，37℃搖床180r/m in培養(yǎng)約45m in。用原先釣取基因時(shí)合成的引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將該克隆測(cè)序。

1.2.3 重組GTF的誘導(dǎo)表達(dá)將重組菌培養(yǎng)擴(kuò)增后加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L誘導(dǎo)后進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。超聲破碎菌體，分別收取上清及沉淀，12%SDS-PAGE電泳。

1.2.4 重組GTF蛋白的可溶性鑒定收集誘導(dǎo)后菌液1m l,冰水浴中超聲處理,之后4℃離心分別收集上清和沉淀,12%SDS-PAGE分析。將獲得的上清液透析凍干并進(jìn)行Western-Blot鑒定，天然的變形鏈球菌菌液處理方法相同。

1.2.5 重組GTF蛋白的生物活性初步測(cè)定采用蒽酮硫酸法對(duì)重組GTF蛋白進(jìn)行生物活性測(cè)定，加入不同濃度的蔗糖與重組GTF蛋白孵育后進(jìn)行OD630數(shù)值讀取。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析采用spss13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果以提取的變形鏈球菌GS5基因組DNA為模板，以合成的CAT-C基因上下游引物進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用H indⅢ,XholⅠ酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收。

2.2 pET-32-NusA-CAT表達(dá)載體的構(gòu)建及PCR鑒定將目的片段與表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖1)。

圖1 重組菌菌落PCR鑒定

2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果及同源性分析結(jié)果顯示所得到的序列與已公布的序列的同源性為98%。所得序列與網(wǎng)上公布序列比對(duì)結(jié)果：Score= 2054 bits(1068),Expect=0.0 Identities= 1108/1128(98%),Gaps=0/1128(0%)Strand= Plus/Plus。

2.4 重組GTF的誘導(dǎo)表達(dá)重組GTF在上清中表達(dá)量明顯高于在沉淀中的表達(dá)，說(shuō)明重組GTF是可溶性蛋白。

圖2 重組GTF的誘導(dǎo)表達(dá)

2.5 W esrtern-blot結(jié)果將含有重組GTF的菌超聲碎菌后上清透析凍干，與多抗抗體發(fā)生反應(yīng)天然的變形鏈球菌同法處理，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 W esrtern-blot結(jié)果A：重組GTF B：天然菌中提取GTF

2.6 蒽酮硫酸法初步測(cè)定重組GTF生物學(xué)活性隨著參與反應(yīng)的蔗糖濃度從糖濃度1到糖濃度3降低，OD630數(shù)值隨之降低，見(jiàn)圖4。

圖4 蒽酮硫酸法初步測(cè)定重組GTF生物學(xué)活性經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)P＜0.05證實(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

3.討論

在變形鏈球菌中，水解蔗糖并催化合成葡聚糖的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)已被廣大學(xué)者公認(rèn)為重要的致齲因子之一[5]，由它產(chǎn)生的水不溶性葡聚糖能夠促進(jìn)細(xì)菌與牙表面及細(xì)菌之間的粘附，從而形成菌斑。GTF在不同血清型的變形鏈球菌中有著不同的種類，在C型中主要分為三種，分別是：GTF－I，GTF－S，GTF－SI，分別對(duì)應(yīng)著基因gtfB，gtfD和gtfC[6,7]。GTF－I催化合成水不溶性葡聚糖(W IG)，GTF－S合成水溶性葡聚糖(WSG)，GTF－SI合成水不溶性和水溶性葡聚糖的混合物，其中g(shù)tfC編碼的GTF-SI對(duì)致齲尤為重要[8]。Hanada和Kuram itsu等[6]已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，變形鏈球菌GS5gtfC基因缺失的突變體喪失了在光滑牙面的蔗糖依附性。

由于GTF種類比較多,并且在變形鏈球菌細(xì)胞胞漿內(nèi)、細(xì)胞壁上以及細(xì)胞間質(zhì)中均有分布,因此想獲得GTF的步驟也比較紛繁復(fù)雜。一般采用硫酸銨鹽析法即對(duì)細(xì)胞裂解物或發(fā)酵液進(jìn)行沉淀,然后再用各種層析方法主要是羥磷灰石填充柱和PBE94聚焦色譜柱進(jìn)行，但是此方法步驟多,酶量和酶活性損失大；親和層析法即通過(guò)GTF與葡聚糖或右旋糖苷結(jié)合特異的親和性來(lái)富集、分離和純化各種GTF[9]。在1999年Jespersgaard等[10]用Sephadex G-100和Sephadex G-150層析柱進(jìn)行親和層析發(fā)酵液,洗脫,而得到富集GTF的組分。Yamashita等[11]依次利用DEAE-纖維素離子交換層析、右旋糖苷瓊脂親和(dex tran-agarose affinity)層析、TSK-gel Phey l-5PW高效液相(high performance liquidch romatography,HPLC)法分離純化了GTF-SI、GTF-I、GTF-S等組分。相對(duì)于傳統(tǒng)的層析方法來(lái)說(shuō),親和層析特異性強(qiáng),濃縮效率高并且反應(yīng)條件溫和,酶活性不易損失,純化步驟也大大簡(jiǎn)化,但要得到大量的單一的GTF組分還是比較困難的。因此很多學(xué)者也嘗試用基因工程的方法來(lái)表達(dá)其編碼基因并獲得純的GTF[12,13]。

Hanada等(1988)研究表明，gtfC基因緊靠gtfB基因下游，與gtfB有高度同源性。用Southern印跡法分析證實(shí)多數(shù)同源基因含有7.3kb的Pst I片段，也由3個(gè)ORF組成。gtfC序列中A+T含量高達(dá)78%。GTF-SI蛋白質(zhì)由1375個(gè)氨基酸殘基組成，該序列中也同gtfB一樣幾乎不含半胱氨酸。GTF-SI整體呈親水性，但在信號(hào)序列、一段肽內(nèi)序列和3'端約50個(gè)氨基酸殘基這3個(gè)區(qū)段呈疏水性[6]。

GTF中的催化活性區(qū)(CAT)是它的重要功能區(qū)段，具有催化蔗糖水解的活性。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在探索了誘導(dǎo)物濃度對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響后發(fā)現(xiàn)并不是IPTG誘導(dǎo)物濃度越大蛋白質(zhì)表達(dá)量越多，在IPTG誘導(dǎo)重組GTF可溶性表達(dá)中，我們反復(fù)摸索條件，后來(lái)發(fā)現(xiàn)IPTG在終濃度為0.1mmol/L、誘導(dǎo)溫度為30℃是上清中重組GTF含量最高，即能大量獲得可溶性的重組GTF。由此我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中可以簡(jiǎn)便高效的獲得目的蛋白，通過(guò)蒽酮硫酸法進(jìn)行活性檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中采用蒽酮硫酸法只是對(duì)重組GTF的生物學(xué)活性進(jìn)行初步測(cè)定，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還將進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)的目的在于利用IPTG誘導(dǎo)后完成GTF中催化活性區(qū)(CAT)在大腸桿菌BL21上的可溶性的表達(dá)，并對(duì)于重組GTF進(jìn)行了生物活性初步測(cè)定，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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全國(guó)口腔頜面-頭頸腫瘤綜合序列治療學(xué)術(shù)研討會(huì)暨口腔頜面－頭頸腫瘤綜合治療高級(jí)研修班第一輪會(huì)議通知

由中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔頜面外科專業(yè)委員會(huì)批準(zhǔn)，口腔頜面-頭頸腫瘤內(nèi)科協(xié)作組主辦、解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心承辦的“第五次全國(guó)口腔頜面-頭頸腫瘤內(nèi)科學(xué)術(shù)會(huì)議”暨“國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育項(xiàng)目[項(xiàng)目編號(hào)：2010-08-02-020(國(guó))]——口腔頜面頭頸腫瘤的綜合治療高級(jí)研修班”將于2010年10月14日至17日將在北京舉行，會(huì)議地點(diǎn)設(shè)在解放軍總醫(yī)院。屆時(shí)將邀請(qǐng)口腔頜面外科專業(yè)委員會(huì)名譽(yù)主任委員、中國(guó)工程院院士邱蔚六教授、華西口腔醫(yī)院王大章教授、第四軍醫(yī)大學(xué)劉寶林教授等知名專家將到會(huì)。參會(huì)人員將獲得I類繼續(xù)教育10學(xué)分。

1.征文內(nèi)容：口腔頜面-頭頸腫瘤的化療、放療、生物治療、熱療、冷凍等綜合治療的相關(guān)臨床治療新方法、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)以及基礎(chǔ)研究的新技術(shù)、新進(jìn)展。

2.稿件要求：來(lái)稿請(qǐng)寄中文題目、作者單位和作者姓名，500字以內(nèi)四段式結(jié)構(gòu)中文摘要(包括目的、方法、結(jié)果和結(jié)論)各一份。請(qǐng)?jiān)敿?xì)注明通訊地址、郵政編碼和聯(lián)系電話。

3.截稿日期：2010年9月20日(郵戳為準(zhǔn))。

4.會(huì)務(wù)費(fèi)：每人1000元(包括工作午餐、講義等)，統(tǒng)一安排食宿，交通、住宿費(fèi)自理。

5.會(huì)議地址：北京解放軍總醫(yī)院

6.聯(lián)系方式：上海市制造局路639號(hào)，上海第九人民醫(yī)院口腔頜面外科郵編200011聯(lián)系人：任國(guó)欣電話：021-50398070 E-mail：renguoxincn@hotmail.com北京市海淀區(qū)復(fù)興路28號(hào)，解放軍總醫(yī)院口腔外科一病區(qū)郵編100853聯(lián)系人：席慶電話：13552706909 E-mail：xqsg@sina.com.cn

全國(guó)口腔頜面-頭頸腫瘤內(nèi)科協(xié)作組

解放軍總醫(yī)院

IPTG induction of the soluble catalytic region of S.mutansexpression and activity assay

WANG Lin,CHU Bing-feng,WANG Cheng-long,LIU Hong-chen,SHAO Ning-sheng,YANG Guang,DONG Jie,LIU Yu.（Institute ofStomatology,GeneralHospitalofChinese PLA,Beijing 100853,China）

Objective:To clone the catalytic region of Glucosyltransferase from StreptococcusmutansGS5 and express it in Escherichia coliBL21 by IPTG induction,obtain the soluble rGTFand activity assay.M ethod:PCR and construction of fusion protein technique,IPTG induction,anthrone-sulfuric acid assay.Result:The CAT genewascloned correctly and its fusion protein was expressed in E.coli by IPTG induction.The SDS-PAGE results showed that the rGTF is soluble,and anthrone-sulfuric acid assay demonstrated itsbiologicalactivity.Conclusion:The aimed gene and its fusion proteinwere gained successfully,and to be demonstrated itsbiologicalactivitywhich providesa base to the further research.

S.mutans;Glucosyltransferase;Escherichia coli

R780.1

A

1672-2973(2010)02-0094-04

2009-12-10)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)30440059)

汪林解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所博士生北京100853

儲(chǔ)冰峰解放軍總醫(yī)院老年口腔病科主任醫(yī)師北京100853

王成龍解放軍總醫(yī)院口腔內(nèi)科副主任醫(yī)師北京100853

劉洪臣通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所所長(zhǎng)主任醫(yī)師教授北京100853

邵寧生軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所研究員北京100850

楊光軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所副研究員北京100850

董潔軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所助理研究員北京100850

劉玉軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所博士生北京100850