霍文艷 顏 興 郝龍英 韓培彥

頭頸部惡性腫瘤患者大部分要接受放射治療[1]。但放射線對(duì)正常涎腺組織也造成一定程度的損害。目前研究證實(shí)唾液分泌減少與腺泡細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、微血管密度減低有關(guān)[2-4]。因此在放射治療過程中保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少涎腺微血管密度降低幅度是可能的治療方向之一。已有研究證實(shí)VEGF能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，提高毛細(xì)血管密度[5，6]。并且VEGF不論對(duì)發(fā)育過程中還是放射性損傷中的微血管均有生發(fā)功能[7]。本研究旨在探討放療前腮腺局部注射VEGF對(duì)放療后腮腺微血管密度的影響。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用健康雄性6-10個(gè)月大五指山雜交小型豬9只，體重50-55公斤，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前環(huán)境適應(yīng)至少兩周，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、單純放療組、VEGF+放療組。

1.2 給藥方法 采用聯(lián)合麻醉，肌注氯胺酮(6mg/kg)，速眠新(0.6mg/kg)麻醉后，將小型豬仰臥，每側(cè)耳后肌注1.5mg硫酸阿托品。開口器撐開動(dòng)物口裂，將帶芯軟管伸入小型豬腮腺導(dǎo)管。VEGF+放療組給予VEGF處理：采用雙側(cè)腮腺導(dǎo)管逆行注射法給藥，濃度為0.25ug/ml，每一小時(shí)給藥2ml，共兩次，總計(jì)量4ml(1μg)。單純放療組及空白對(duì)照組同時(shí)給予雙側(cè)腮腺導(dǎo)管逆行注射4ml生理鹽水。

1.3 小型豬放療損傷建立 給藥11天實(shí)驗(yàn)給藥組及對(duì)照放療組小型豬實(shí)施放療，體位為俯臥位，麻醉后固定，放射線從豬的后背側(cè)單后野垂直照射一側(cè)腮腺組織，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小型豬均給予20Gy雙側(cè)腮腺投照。照射源采用電子直線加速器(美國瓦里安公司Clinac 600C)，射線平均能量6mv，劑量率3.2Gy/min。照射野10cm×12cm，照射距離100cm。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組麻醉后給予0Gy射線。

1.4 腮腺組織樣本采集及免疫組織化學(xué)染色 放射治療4小時(shí)麻醉固定動(dòng)物后，分別取雙側(cè)腮腺上方、中方、下方標(biāo)本，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，并行3um厚連續(xù)切片，采用SP二步法，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)，兔抗豬VEGF單克隆抗體標(biāo)記 VEGF；羊抗豬 CD31、兔抗人AQP1單克隆抗體標(biāo)記腮腺微脈管，使用山羊超敏二部法、兔二部法檢測試劑盒檢測，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡觀察。

1.5 結(jié)果判斷 微血管密度檢測：高倍鏡(200×)視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)視野的免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)，并取其平均值作為該例微血管數(shù)目。以鏡下胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。單個(gè)或成叢的內(nèi)皮細(xì)胞，不管成腔與否均視為單個(gè)微血管，凡管徑大于3mm血管(即200×鏡下15um)不予計(jì)數(shù)(圖1)。

圖1 腮腺微血管與大血管比較(×200)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)用表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用Newman-Keuls方法。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSS10.0完成統(tǒng)計(jì)工作。

2.結(jié)果

2.1 VEGF染色結(jié)果觀察 VEGF免疫組化染色切片在100倍及200倍顯微鏡下觀察：VEGF+放療組在逆行注射11天時(shí)腺體導(dǎo)管細(xì)胞有大量VEGF表達(dá)，在腺泡細(xì)胞內(nèi)也有大量VEGF表達(dá)，而空白對(duì)照組和單純放療組僅導(dǎo)管細(xì)胞內(nèi)有VEGF表達(dá)，腺泡細(xì)胞內(nèi)缺乏VEGF表達(dá)(圖2)。

圖2 A空白對(duì)照組,B單純放療組,C VEGF+放療組VEGF免疫組化(×100)

2.2 HE染色結(jié)果觀察：HE染色結(jié)果100倍光鏡下觀察顯示空白對(duì)照組、VEGF+放療組、單純放療組之間腮腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)無明顯差異。(圖3)

2.3 免疫組化染色結(jié)果觀察

2.3.1 CD31染色陽性計(jì)數(shù)比較 (圖4)CD31染色陽性計(jì)數(shù)比較：空白對(duì)照組、VEGF+放療組及單純放療組腮腺CD31陽性染色顆粒數(shù)有顯著差異(F=47.727，P＜0.05)。且均數(shù)兩兩之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖3 空白對(duì)照組、單純放療組、VEGF+放療組小型豬腮腺微組織結(jié)構(gòu)(HE)(×100)

圖4 空白對(duì)照組、單純放療組、VEGF+放療組小型豬腮腺微血管密度(免疫組化CD31染色)(×100)

表1 空白對(duì)照組，VEGF+放療組和放療組腮腺CD31的比較()

表1 空白對(duì)照組，VEGF+放療組和放療組腮腺CD31的比較()

注：*P＜0.05 vs空白對(duì)照組，#P＜0.05 vs VEGF+放療組

2.3.2 AQP1染色陽性計(jì)數(shù)比較 (圖5)AQP1染色陽性計(jì)數(shù)比較：空白對(duì)照組、VEGF+放療組及單純放療組腮腺AQP1陽性染色顆粒數(shù)有顯著差異(F=18.707，P＜0.05)?？瞻讓?duì)照組與VEGF+放療組、單純放療組AQP1比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但VEGF+放療組與單純放療組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

圖5 空白對(duì)照組、單純放療組、VEGF+放療組小型豬腮腺微血管密度(免疫組化AQP1染色)(×100)

表2 空白對(duì)照組、VEGF+放療組、單純放療組腮腺AQP1的比較()

表2 空白對(duì)照組、VEGF+放療組、單純放療組腮腺AQP1的比較()

注：*P＜0.05 vs空白對(duì)照組，#P＞0.05 vs VEGF+放療組

3.討論

在腮腺放射性損傷機(jī)制的研究中，腺泡細(xì)胞的損傷和腮腺微血管的改變被認(rèn)為是放射性損傷的關(guān)鍵因素。目前研究中，保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞是防止射線損傷的主要目標(biāo)之一。涎腺放射性損傷中，腺體實(shí)質(zhì)損傷的同時(shí)涎腺微血管密度明顯下降。Cotrim[2]等研究VEGF對(duì)小鼠涎腺血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，將腺病毒介導(dǎo)的VEGF載體投遞入涎腺組織，放療后涎腺微血管密度較對(duì)照組有明顯提高。由于基因治療目前尚有轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制未完全清楚、載體安全性等理論問題，所以還較難向臨床推廣使用。VEGF是目前研究較為成熟的細(xì)胞因子之一，本研究旨在探討應(yīng)用臨床常用的腮腺導(dǎo)管逆行注入給藥方式，VEGF對(duì)腮腺放射損傷的保護(hù)意義。以往對(duì)預(yù)防涎腺放射損傷的研究主要是在小鼠上得到證實(shí)，如果應(yīng)用于臨床則需要在更接近人類生物學(xué)性能的大型動(dòng)物上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。張昕等在比較四種動(dòng)物與人類的涎腺差異后發(fā)現(xiàn)：在重量、大小及造影表現(xiàn)上，小型豬涎腺較嚙齒類動(dòng)物更接近于人類[8]。本研究選用小型豬腮腺為研究模型更接近臨床應(yīng)用。

在對(duì)小型豬腮腺損傷的動(dòng)物模型研究中，多采用單次照射研究。當(dāng)放射劑量達(dá)到15Gy時(shí)腮腺唾液流率表現(xiàn)下降，高于25Gy腮腺將發(fā)生永久的不可逆的結(jié)構(gòu)破壞[9]，涎腺功能難以恢復(fù)[10，11]。相對(duì)于臨床應(yīng)用的分割劑量照射，本實(shí)驗(yàn)照射劑量為單次20Gy，相當(dāng)于分次照射43次，每次2Gy，與臨床常規(guī)應(yīng)用的放射劑量接近。有研究表明涎腺的放射性損傷的組織學(xué)改變于腺體接受射線的早期即可發(fā)生，光鏡下觀察腮腺放療后2小時(shí)即可見到腺泡不同程度的組織學(xué)改變[12]。腺體微血管密度的研究則發(fā)現(xiàn)大量的唾液腺微血管密度喪失發(fā)生于放療后4小時(shí)，即唾液腺微血管密度減低45%。本研究目的主要在于觀察VEGF對(duì)腮腺放射后早期損傷及腺體微血管密度的影響，即選擇放射后腺體微血管密度下降最為明顯4小時(shí)為觀察點(diǎn)。VEGF可促進(jìn)局部組織新生血管形成已得到證實(shí)，其促血管生成方式有3種：血管新生、動(dòng)脈生成、血管發(fā)生。血管新生指在原先存在的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)上通過出芽方式萌生新的毛細(xì)血管，即毛細(xì)血管芽生。血管發(fā)生曾一直被認(rèn)為僅限于胚胎發(fā)育期，直到最近，人們才接受出生后血管發(fā)生的存在。動(dòng)脈生成是指側(cè)支微動(dòng)脈的成熟或新生過程，經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管重塑形成管徑和面積更大的，血管造影可見的動(dòng)脈。上述的三個(gè)過程中，都有VEGF的參與。VEGF依據(jù)其濃度不同發(fā)揮作用也不同，低濃度時(shí)血管新生占優(yōu)勢(shì)，高濃度時(shí)血管發(fā)生占優(yōu)勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)在正常腮腺組織中VEGF僅在導(dǎo)管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在腺泡細(xì)胞內(nèi)缺乏表達(dá)。探討應(yīng)用導(dǎo)管逆行注射法將外源性VEGF導(dǎo)入腮腺腺泡細(xì)胞的可行性，研究結(jié)果顯示注射后導(dǎo)管細(xì)胞與腺泡細(xì)胞內(nèi)均有外源性VEGF表達(dá)，證明該方法是提高放射區(qū)腮腺組織中VEGF水平的有效手段。研究外源性VEGF對(duì)自體組織血管再生時(shí)間效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)[13]：應(yīng)用VEGF后1-7天組織結(jié)構(gòu)特征沒有明顯改變；7-14天后可見自體組織微血管再生呈明顯趨勢(shì)，組織學(xué)表現(xiàn)為新生組織和微血管數(shù)量明顯增多。本研究中于放療前11天采用雙側(cè)腮腺導(dǎo)管逆行注射法給予VEGF，目的是保證VEGF促微血管形成的高峰期與腮腺放射后微血管密度的急劇下降期相重合，以發(fā)揮VEGF促進(jìn)血管再生的最大效果，以及觀察其是否對(duì)腮腺放射早期的微血管損傷有益。本研究結(jié)果顯示VEGF給藥后放療組、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組與單純?nèi)俜暖熃M的腮腺組織切片CD31陽性染色顆粒數(shù)有顯著差異，即VEGF給藥放療組比單純放療組腮腺CD31陽性染色顆粒數(shù)明顯增高。結(jié)果證明放射前腮腺局部給予VEGF可以明顯提高腮腺放射后4小時(shí)的局部微血管密度與活性。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一組分子量較小的疏水性細(xì)胞膜整合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)調(diào)控水的進(jìn)出。水通道蛋白1(AQP1)在涎腺組織中主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞。在小鼠模型上研究發(fā)現(xiàn)放療前給予VEGF可提高頜下腺放射后AQP1的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組腮腺AQP1陽性染色顆粒數(shù)與VEGF給藥放射組及單純放射組有顯著差異，VEGF放療組與單純放療組間無明顯差異。我們認(rèn)為原因可能是AQP1在小鼠頜下腺與小型豬腮腺中的分布比率不同，以及AQP1特異性著色細(xì)胞包括部分導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。

本研究結(jié)果證明放射前腮腺導(dǎo)管逆行注射外源性VEGF后，可使放射后腺體內(nèi)微血管密度升高，改善腮腺局部血流狀況。通過腮腺導(dǎo)管逆行注射的方式給藥，簡便易操作，安全可靠，易于臨床應(yīng)用。本研究為保護(hù)腮腺放射后微血管密度的降低提供了初步的大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

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