李 娜,袁利玲,張瑋瑩,李書祥,袁永澤,楊江科,閆云君,劉德立

（1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430079;2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430074）

黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在畢赤酵母中的表達(dá)

李 娜1,袁利玲1,張瑋瑩1,李書祥1,袁永澤1,楊江科2,閆云君2,劉德立1

（1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430079;2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430074）

黑曲霉脂肪酶是重要的工業(yè)用酶,在食品、制藥、前體化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有廣泛的用途。獲得高效表達(dá)黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是該酶工業(yè)化生產(chǎn)的前提。根據(jù)黑曲霉脂肪酶L IP的氨基酸序列及畢赤酵母密碼子的偏愛性,設(shè)計(jì)合成26條相互重疊20 bp的引物,通過組裝PCR分別合成lip基因的4個(gè)片段lipA 1（300 bp）、lipA 2（237 bp）、lipA 3（234 bp）和 lipA 4（210 bp）。再以基因頭 lip1 和基因尾 lip26 為引物 ,以 lipA 1、lipA 2、lipA 3 和lipA 4混合物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,得到的產(chǎn)物經(jīng)加A處理后,連接到載體pMD182T上,挑取重組子測(cè)序。通過PCR擴(kuò)增對(duì)人工合成的基因進(jìn)行校正,得到完全正確的lip基因。將優(yōu)化后的基因克隆到表達(dá)載體p PIC9K上,獲得的重組質(zhì)粒p PIC9K2lip經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115菌株,構(gòu)建分泌型表達(dá)L IP的酵母工程菌,G418梯度篩選,得到高拷貝穩(wěn)定整合菌株。為重組黑曲霉脂肪酶的規(guī)?；苽涞於嘶A(chǔ)。

黑曲霉;脂肪酶;全基因合成;畢赤酵母;表達(dá)

脂肪酶（EC3.1.1.3）是一類水解油脂的酶類,可催化油水界面的甘油三酯水解生成甘油及長(zhǎng)鏈脂肪酸[1],是一種重要的工業(yè)用酶,廣泛應(yīng)用于油脂化學(xué)、食品加工、精細(xì)化工、去污劑添加劑、手性化合物拆分、生物柴油合成等諸多工業(yè)領(lǐng)域[2]。黑曲霉脂肪酶因其良好的生物安全性,可作為傳統(tǒng)食品加工中重要的食品添加劑[3];同時(shí),在前體物的合成和手性化合物的拆分等領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用前景。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)外源蛋白,具有外源蛋白表達(dá)量高且易于純化、營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、適于高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn),因而廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)[4],但由于畢赤酵母和黑曲霉在密碼子使用頻率上的差異,使原有密碼子在畢赤酵母中整體表達(dá)頻率較低。

作者在此采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),將黑曲霉脂肪酶基因lip按畢赤酵母密碼子的偏愛性進(jìn)行改造,并人工合成后克隆至分泌型表達(dá)載體p PIC9K中,構(gòu)建了畢赤酵母分泌型重組表達(dá)載體p PIC9K2lip,轉(zhuǎn)化GS115獲得高效表達(dá)L IP的酵母工程菌株,經(jīng) G418篩選獲得高拷貝穩(wěn)定整合菌株,為大規(guī)模制備黑曲霉脂肪酶奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母 GS115、質(zhì)粒p PIC9K,自行保存;PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（EcoRI、N otI）,TaKaRa公司;SalI,寶生物工程（大連）有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒,A xygen公司;電泳儀、電轉(zhuǎn)儀,BioRad公司。

引物合成和測(cè)序委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。

培養(yǎng)基 YPD、MD、MM、BM GY、BMM Y 按 In2 vitrogen公司操作手冊(cè)推薦方法配制。

1.2 方法

1.2.1lip基因遺傳密碼的優(yōu)化、引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)黑曲霉脂肪酶lip基因的核苷酸序列（Gen2 Bank Accession No.DQ647700）,在Bioedit軟件的輔助下推導(dǎo)出該基因的核苷酸序列;將起始密碼子A TG和終止密碼子 TAA分別添加于lip序列的5′端和3′端;在DNAWorks[5]在線軟件的輔助下,以畢赤酵母密碼子使用頻率為基準(zhǔn),對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)26條相互重疊20 bp的引物,分別記為lip1～lip26;引物lip1和lip26分別引入EcoRI和N otI酶切位點(diǎn)。引物合成片段經(jīng)過脫鹽、PAGE純化后備用。

1.2.2 全基因序列的人工合成及校正[6]

將設(shè)計(jì)的相互重疊的引物分為4組,分別進(jìn)行PCR反應(yīng),其 PCR產(chǎn)物分別命名為lipA 1、lipA 2、li2 p A 3和lipA 4。再以lip A 1、lip A 2、lipA 3和lipA 4為模板,以lip1和lip26為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,合成黑曲霉脂肪酶lip′。合成后的全基因片段經(jīng)測(cè)序分析,結(jié)果顯示合成的片段有堿基缺失、增加、突變的錯(cuò)誤,再以合成的基因lip′為模板,通過PCR擴(kuò)增對(duì)合成基因進(jìn)行校正,校正后的黑曲霉脂肪酶全基因lip克隆至pMD182T載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后篩選獲得陽(yáng)性克隆子,PCR檢測(cè)后,送上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行序列分析。

1.2.3 黑曲霉脂肪酶成熟肽基因的獲得

以合成的全基因序列為模板,以lip227（5′2GGTTC2 CGGAATTC TCTGTTTCTACTTCTACTTTGGATG 2 AATTG23′,下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)）和 lip26（5′2 GGTTCCGCGGCCGCTTACAACAAACATTCAGAA 2 ATAGC 23′,下劃線處為NotI酶切位點(diǎn)）為引物擴(kuò)增得到黑曲霉脂肪酶的成熟肽基因lip227。

1.2.4 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227的構(gòu)建

以 lip1（5′2GGTTCCGAA TTCA TGTTTTCTG2 GTAGA TTTGGTGTTTTGTTGACTGC23′,下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)）和lip26為引物擴(kuò)增全長(zhǎng)脂肪酶基因,以lip227和lip26為引物擴(kuò)增成熟肽脂肪酶基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和N otI酶切后,插入經(jīng)相同酶切的p PIC9K載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227[7]。

1.2.5 重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

采用質(zhì)粒制備試劑盒提取p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227約5μg,并用SalI將其線性化。酶切產(chǎn)物經(jīng)沉淀、洗滌、干燥后,用10μL水溶解備用。電擊轉(zhuǎn)化線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227,并整合到畢赤酵母 GS115細(xì)胞基因組中。轉(zhuǎn)化涂布MD平板,30℃培養(yǎng)2～4 d,觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)。將陽(yáng)性克隆子依次轉(zhuǎn)接至含 G418的MD平板,篩選高濃度 G418正常生長(zhǎng)的菌落為高拷貝整合菌株[8]。

1.2.6 高拷貝整合菌株的篩選和PCR鑒定

利用煮 -凍 -煮方法[9]提取有 p PIC9K2lip、p PIC9K2lip227和p PIC9K的重組酵母基因組DNA,分別以lip1、lip227和lip26為引物,檢測(cè)外源基因的整合情況,PCR擴(kuò)增條件：94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃10 min[10]。瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.7 重組轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)

將重組轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌株接種于50 mL BM GY培養(yǎng)液中,30℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16～20 h至OD600為2～6,離心收集菌體,加BMM Y培養(yǎng)基稀釋至OD600為1.0。每隔24 h補(bǔ)加甲醇,使其終濃度為0.5%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取1 m L發(fā)酵液于4℃離心10 min,然后取上清液10μL上樣,進(jìn)行12%SDS2PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)R250染色,分析檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平和分子量[11]。

1.2.8 重組脂肪酶的酶活測(cè)定

采用以橄欖油為反應(yīng)底物的NaOH滴定法[12]和p2NPP法[13]測(cè)定發(fā)酵上清液中脂肪酶的活力。

酶活單位（U）定義為：每分鐘水解底物生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 lip基因片段的獲得

黑曲霉脂肪酶全基因lip的人工合成過程如圖1所示。

第一步是小核苷酸片段的合成與組裝,PCR反應(yīng)體系包括：lip1/（9）/（15）/（21）,1μL;lip8/（14）/（20）/（26）,1μL;模板 lip227/（10214）/（16219）/（212 25）,各 1μL;5×PrimeSTARTMbuffer,10μL;dN TP,4μL;PrimeSTARTMHSDNA聚合酶,0.5μL;H2O,21.5μL。PCR條件為：98℃變性10 s,53℃退火15 s,72℃延伸 45 s,共 25個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到4個(gè)大小分別為 300 bp、237 bp、234 bp 和 210 bp 的片段 lipA 1、li2 pA 2、lipA 3和lipA 4。

第二步是脂肪酶全基因的合成。PCR反應(yīng)體系為：lip1,1μL;lip26,1μL;lipA 1、lipA 2、lipA 3、lipA 4,各1μL;5×PrimeSTARTMbuffer,10μL;dN TP,4 μL,PrimeSTARTMHS DNA聚合酶,0.5μL;H2O,29.5μL。PCR條件同第一步,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到大小925 bp左右的片段,和理論大小919 bp相符（圖2）。

圖1 黑曲霉脂肪酶全基因lip的人工合成示意圖Fig.1 The synthesis of Aspergillus niger lipase lip

圖2 人工合成黑曲霉脂肪酶全基因lip的PCR擴(kuò)增Fig.2 The PCR of synthesized Aspergillus niger lipase lip

合成的全長(zhǎng)基因在 Taq DNA聚合酶的作用下進(jìn)行末端加A處理后,將其連接到載體pMD182T上,并對(duì)陽(yáng)性克隆子的插入片段進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明,所獲得的插入片段序列與預(yù)期設(shè)計(jì)的相一致（合成基因的序列見圖3）。

2.2 重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和N otI雙酶切,將得到的片段與同樣經(jīng)過EcoRI和N otI雙酶切的p PIC9K質(zhì)粒連接,構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體p PIC9K2lip（圖4）。

圖3 人工合成改造后的黑曲霉脂肪酶全基因lip序列Fig.3 lip Gene sequence of modif ied Aspergillus niger lipase

轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,提取質(zhì)粒,多個(gè)克隆的DNA測(cè)序結(jié)果表明,通過人工全基因合成方法所獲得的黑曲霉脂肪酶基因與設(shè)計(jì)序列完全一致,序列正確的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和N otI雙酶切鑒定,分別得到919 bp的目的片段和約9.3 kb的載體片段。

2.3 GS115的轉(zhuǎn)化及高拷貝整合菌株的篩選

通過電激法將經(jīng)SalI線性化的p PIC9K2lip質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞。在MD平板上培養(yǎng)4 d,共得到389個(gè) His+轉(zhuǎn)化菌落。將重組質(zhì)粒p PIC9K2lip轉(zhuǎn)化的 His+菌落、質(zhì)粒p PIC9K轉(zhuǎn)化菌及宿主菌 GS115逐個(gè)點(diǎn)至MD平板（含 G418濃度分別為 1 mg·m L-1、2 mg·m L-1、3 mg·mL-1、4 mg·m L-1和5 mg·m L-1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在 G418濃度為1 mg·mL-1、2 mg·mL-1的平板上所有 His+菌生長(zhǎng)無顯著差異;而當(dāng) G418濃度為3 mg·mL-1、4 mg·mL-1時(shí),GS115生長(zhǎng)緩慢;當(dāng) G418濃度為5 mg·m L-1時(shí),只有極少數(shù) GS115 His+菌生長(zhǎng),即得到高拷貝的整合菌株。挑選在5 mg·m L-1G418平板上生長(zhǎng)良好的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR鑒定,分析表明90%以上的轉(zhuǎn)化子染色體中整合了lip基因。

圖4 表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖Fig.4 Construction of the recombination plasm id

2.4 重組蛋白的表達(dá)（圖5）

M.Low molecular weight p rotein marker 1.GS115 Transformedw ith p PIC9K cultured 24 h 2～6.GS115 Transfo rmed w ithp PIC9K2lip cultured 24 h,48 h,72 h,96 h,128 h圖5 重組酵母上清的SDS2PAGEFig.5 The SDS2PAGEanalysis of fermentation

SDS2PAGE分析結(jié)果表明,重組酵母分泌了約39 kDa左右的重組蛋白質(zhì)進(jìn)入培養(yǎng)液。表明lip基因在畢赤酵母 GS115中實(shí)現(xiàn)了分泌性表達(dá)。

2.5 討論

在異源宿主中表達(dá)效率的主要影響因素是不同宿主間密碼子的使用頻率的差異,故通過對(duì)基因的重新設(shè)計(jì)和合成可以優(yōu)化基因的表達(dá),用宿主偏愛的密碼子來消除利用率低的或稀有的密碼子。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)黑曲霉脂肪酶基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和合成來優(yōu)化其表達(dá)。在保證高正確率的前提下,為降低成本,將合成鏈長(zhǎng)控制在60個(gè)核苷酸以下;為了使合成的基因在畢赤酵母中高效表達(dá),選擇使用了畢赤酵母偏愛的密碼子;為了互補(bǔ)寡聚核苷酸退火后基因片段之間能很好連接,將相鄰核苷酸片段的連接粘端設(shè)計(jì)成互補(bǔ)堿基;為便于克隆表達(dá),在基因兩端設(shè)計(jì)了必要的酶切位點(diǎn)EcoRI和N otI。在此基礎(chǔ)上合成了919 bp大小的黑曲霉脂肪酶全基因,測(cè)序結(jié)果表明人工合成的基因序列正確。這說明,通過PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)優(yōu)化基因的合成。運(yùn)用此策略,可以設(shè)計(jì)合成優(yōu)化的任何基因序列,為研究工作提供更多的材料。

巴斯德畢赤酵母是20世紀(jì)80～90年代發(fā)展起來的極具潛力的酵母表達(dá)系統(tǒng),由于其在蛋白質(zhì)表達(dá)方面具有其它系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)而得到越來越廣泛的應(yīng)用[14]。重組畢赤酵母由于具有精確調(diào)控的乙醇氧化酶（AOX1）強(qiáng)啟動(dòng)子并在合成培養(yǎng)基中易于高密度大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)已成為近年來公認(rèn)的最有效的外源表達(dá)系統(tǒng)之一[15]。畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)性酵母,在缺乏抑制性碳源時(shí),由于AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子受甲醇的嚴(yán)格誘導(dǎo)表達(dá),使畢赤酵母能利用甲醇為唯一碳源。p PIC9K表達(dá)載體采用了AOX1高效表達(dá)啟動(dòng)子[16],本研究將人工合成的具有酵母密碼子偏愛性的目的基因插入到p PIC9K表達(dá)載體,SalI線性化后通過同源重組的方式整合到酵母染色體中而實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。

舒正玉等[17]實(shí)現(xiàn)了黑曲霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的分泌性表達(dá),但其重組脂肪酶水解橄欖油的比活力低于原始野生菌株脂肪酶的比活力。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)并人工合成了由畢赤酵母偏愛密碼子組成的lip基因序列,合成了優(yōu)化的黑曲霉脂肪酶基因lip,成功構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)載體p PIC9K2lip,經(jīng) G418抗性篩選獲得了高拷貝的菌株,搖瓶發(fā)酵液上清酶活提高了5倍。為脂肪酶的大規(guī)模表達(dá)純化奠定了基礎(chǔ)。

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The Total Gene Synthesis of Aspergillus N iger L ipase and the Construction Expression in Pcihia Pastoris

L INa1,YUAN L i2ling1,ZHANGWei2ying1,L IShu2xiang1,YUAN Yong2ze1,YANG Jiang2ke2,YAN Yun2jun2,L IUDe2li1
（1.L aboratory of Genetic Regulation and Integrative B iology,College of L ife Science,
Central China N orm al University,W uhan430079,China;2.College of L ife Science and Technology,H uazhong University of Science and Technology,W uhan430074,China）

Aspergillus nigerlipases are impo rtant biocatalysts w idely used in industries fo r food p rocessing and pharmaceutical p reparation.High2level exp ression recombinants can lead to cost effective lipase large scale p roduction.Total gene synthesis is an efficientmethod to enhance the exp ression level of the gene.According to themature pep tide sequence ofAspergillus nigerlipase and codonsof p reference inPichia pastoris,26 p rim2 ersw ith 20 bp overlaps at both 5′and 3′ends between adjacent oligonucleotideswere designed and synthesized.Fragments lipA 1（300 bp）,lipA 2（237 bp）,lipA 3（234 bp）and lipA 4（210 bp）were separately synthesized by as2 sembly PCR,and then they were used as the temp late to get the full length gene.The synthetic gene was se2 quenced and p roved to be the same as the designed.Thelipgene w as cloned into p PIC9K secreto ry exp ression vector.The construct was linearized w ithSalIand transfo rmed intoP.pastorisstrain GS115,and stablemul2 ticopy integrantswere screened in medium containing different concentrationsof G418.Thisoffers efficient re2 combinantP.pastorisstrains for mass p roduction of lipase.

Aspergillus niger;lipase;total gene synthesis;Pichia pastoris;exp ression

Q 786

A

1672-5425（2010）06-0045-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30771429）,科技部“863”資助項(xiàng)目（2007AA 05Z417）,教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（20060511002）,湖北省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2007AA 201C50,2007AA 301C26）

2010-03-29

李娜（1981-）,女,湖北巴東人,碩士研究生,研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué);通訊作者：劉德立,教授。E2mail：deli2 liu2002@yahoo.com.cn。