康瑋麗，唐軍虎，敬思群

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊，830046)

酶解核桃蛋白制備抗氧化肽工藝條件優(yōu)化*

康瑋麗，唐軍虎，敬思群

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊，830046)

采用單因素試驗和響應面分析，以對DPPH自由基的清除率為響應值，研究了酶與底物的比值(［E］/［S］)、pH值和酶解溫度對制備抗氧化肽工藝的影響。確定了采用堿性蛋白酶制備核桃抗氧化肽的最佳酶解條件為:［E］/［S］為2.6%，pH值9，酶解溫度為49℃，［S］為2%，酶解時間為2h，在此條件下制備的核桃抗氧化肽對DPPH自由基的清除率達69.85%。

核桃蛋白，抗氧化肽，酶解，響應面分析法，優(yōu)化

核桃是胡桃科核桃屬多年生落葉喬木的堅果，學名Juglans regia L.又名為胡桃、羌桃、合桃等，是四大干果之一，也是世界上栽培最廣，經濟價值最高的木本油料、干果和用材樹種之一［1］。

核桃中除了含有高達65%～83%的核桃油脂以外，還含有大量的核桃蛋白。核桃蛋白由清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白所構成［2］。研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白質中18種氨基酸齊全，特別是人體必需的8種氨基酸含量合理，不但是很好的蛋白源，還是優(yōu)良的制備多肽的原料［3］。

隨著自由基生命科學研究的不斷發(fā)展，氧化應激損傷和抗氧化保護作用的理論備受關注，衰老、癌癥及心血管等疾病被公認為與氧化應激損傷及自由基代謝失調相關，因而篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學、醫(yī)學和食品科學研究的新趨勢［4－5］。

本研究探討了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白制備抗氧化肽的工藝參數，并研究了酶解液對自由基的清除作用，為核桃蛋白的深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

核桃，新疆和田產薄皮核桃，由新疆阿布丹食品開發(fā)有限公司提供;核桃蛋白，實驗室自制;Alcalase2.4L堿性蛋白酶，AS1398中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，均購于杰能科酶制劑有限公司;其它試劑均為分析純。

BS210S型分析天平(感量0.0001g)，福建科立龍電子有限公司;RE－52型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;FD－1－50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;JXL型沉淀離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠;電子精密pH指示計，上海精密科學儀器有限公司;數濕恒溫磁力攪拌器，上海滬西分析儀器廠;紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;HH－S型水浴鍋，鞏義市英峪于華儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 核桃抗氧化肽的制備工藝

1.2.1.1 脫脂核桃粉制備工藝

去殼核桃仁在65℃下，用1.5%NaOH溶液浸泡30 min后去皮，然后放置于超低溫速凍冰箱中，在－50℃下速凍20 min。取出的核桃仁冷凍干燥24 h后進行粉碎，按1∶6的料液比在65℃下用正己烷回流提取4 h，然后經4 000 r/min離心20 min，去上清液后所得的殘渣，再經冷凍干燥24 h后，得到脫脂核桃粉。

1.2.1.2 脫脂核桃蛋白制備工藝［6］

脫脂核桃粉粉碎后過40目篩，在45℃下，按1∶20的料液比加水攪拌，然后用1.0mol/L NaOH調節(jié)pH到9，并用超聲波在25 kHz、300 W下攪拌1 h，再經4 000 r/min離心20 min。去油層和下層沉淀后所得蛋白上清液加入活性炭進行脫色，過濾后的濾液用1mol/L HCl溶液調pH至5.0，再經4 000 r/min離心20 min，用去離子水洗滌沉淀3次后調pH值至7.0，冷凍干燥得到脫脂核桃蛋白粉。

1.2.1.3 核桃抗氧化肽制備工藝［7］

將脫脂核桃蛋白粉放入酶反應器中，并加入去離子水攪拌均勻，50℃下恒溫水浴溶解30 min，用1.0mol/L NaOH調pH至酶的最適值后加酶，采用pH－stat法控制反應體系的pH值在設定pH的±0.03之間，反應結束后，90℃滅酶10 min，添加1.0mol/L HCl調pH值至7.0，8 000 r/min離心20 min，上清液經大孔吸附樹脂脫鹽，再經真空濃縮，冷凍干燥后得到核桃抗氧化肽。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 水解度(DH)測定

采用 pH-stat法［8］。

1.2.2.2 核桃抗氧化肽體外抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除能力的測定［9］:準確稱取DPPH標準品2.56 mg，用無水甲醇定容到100mL容量瓶中，使終濃度為6.5×10－5mol/L。精確稱取一定量的核桃抗氧化肽，溶解于蒸餾水，使終濃度為4mg/mL。各取0.5mL待測樣依次與2.5mL 6.5×10－5mol/L DPPH溶液室溫避光反應30min，同時以無水甲醇調0、蒸餾水為空白做對照，于517nm波長測定吸光值，計算DPPH清除率。

式中:A0，空白吸光值;A1，樣品吸光值。

(2)酶解物還原力的測定［10］:取酶解液2.5mL，加0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.6)2.5mL和1%的鐵氰化鉀(赤血鹽)溶液2.5mL，然后將混合物放入50℃水浴保溫20min;加入質量濃度為10%的三氯醋酸2.5mL混合，取5mL混合液于25mL比色管中，加入5mL去離子水和0.1%的氯化鐵1mL，混合均勻，定容至25mL，在680 nm下測定吸光度，吸光度越高，說明還原力越高，即抗氧化性越強。

2 結果與分析

2.1 影響堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的因素

2.1.1 酶源的確定

由于酶與底物的反應表現(xiàn)出一定的特異性，不同蛋白酶對同一種蛋白質底物的作用結果并不相同，蛋白質水解物中多肽的長度及結構也不同，因此酶的種類和酶水解蛋白的能力對酶解產物的抗氧化能力具有很大的影響［11］。核桃分離蛋白在pH值接近5.0時，表現(xiàn)出較差的溶解性，這是因為此pH值接近核桃蛋白的等電點。溶液pH值高于或低于等電點都有利于蛋白質溶解性的增加，這是因為在等電點兩側蛋白質與水分子的相互作用較強，另外蛋白質分子間的相互排斥作用也較強［12］。因此實驗中選用Alcalase 2.4L堿性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶及木瓜蛋白酶對其進行酶解。水解情況見圖1。

圖1 不同種類蛋白酶對核桃蛋白水解度的影響

由圖1可知，實驗用3種酶對核桃蛋白的水解能力有較大的差別，其水解能力由大到小依次為:Alcalase 2.4L堿性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。選擇Alcalase 2.4L堿性蛋白酶為實驗用酶。此外，從A1calase 2.4L堿性蛋白酶對核桃蛋白的水解度曲線可以看出，反應前2h，DH增加較快，后2h增加趨于緩慢，綜合考慮成本和效率，在實驗中選擇反應時間為2 h。

在酶種確定的前提下，影響蛋白質酶解的因素主要有底物濃度、酶濃度、反應溫度、反應pH值等，因而采用單因素試驗分別討論上述因素對酶解效果的影響。

2.1.2 底物濃度［S］對核桃蛋白水解度及抗氧化活性的影響

選用 Alcalase2.4L 在pH值9.0，50℃，［E］/［S］為2.5%的條件下水解2 h，研究底物濃度［S］對核桃蛋白水解度和抗氧化活性的影響，結果分別見圖2和圖3。

圖2 底物濃度對水解度及還原能力的影響

底物濃度過低會導致底物分子與酶分子結合的幾率降低，最終影響酶促反應的速率，使反應速度降低;底物濃度過高，酶的活性部位已全部被底物分子占據，反應速度趨于極限，達到零級反應［13］。由圖2可知，隨著底物濃度的增加，酶解物的還原能力和水解度都逐漸增強。當底物濃度達到2%后，還原能力的增長趨勢變緩;底物濃度達到5%后，水解度開始下降。

由圖3可知，當底物濃度達到2%時，酶解物對DPPH自由基的清除能力最強。當底物濃度達到5%時，酶解物的水解度達到最大值。

圖3 底物濃度對水解度及DPPH自由基清除率的影響

圖2和圖3的結果表明，隨著底物濃度的增加，水解度和酶解物的抗氧化性并不具有明顯的相關性，并不是水解度越大，所得酶解物的抗氧化效果就越好，而是在特定的水解度下，酶解物才具有最大的抗氧化能力，因此選擇底物濃度范圍為1%～3%。

2.1.3 加酶量與底物濃度比［E］/［S］對核桃蛋白水解度及抗氧化活性的影響

選用 Alcalase2.4L 在pH值9.0，50℃，［S］為2%的條件下水解2 h，研究加酶量與底物濃度比［E］/［S］對核桃蛋白水解度和抗氧化活性的影響，結果分別見圖4和圖5。

圖4 ［E］/［S］對水解度及還原能力的影響

從圖4可以看出，隨著酶量的增加，水解度和還原能力也不斷增強。揭示在底物分子過飽和的情況下，酶用量增加可以大大提高酶與底物的結合效率，從而加快底物轉化為產物的反應速率。當酶量增加到一定值后，酶分子趨向飽和，曲線的上升趨緩，此時繼續(xù)增大加酶量將對反應速率貢獻不大。在加酶量達到2.5%之后，加酶量對酶解物的還原能力的影響不大，而水解度在加酶量達到1.0%之后變化不大。

從圖5可以看出，酶解產物清除DPPH自由基的能力并不與水解度成線性關系，當［E］/［S］達到2.5%的時候，酶解產物表現(xiàn)出最高的清除DPPH自由基的活力。圖4和圖5的結果表明隨著加酶量的增加，水解度和酶解物的抗氧化性都逐漸增加，但并不是簡單的線性關系。綜合考慮，［E］/［S］為2%～3%為適宜范圍。

圖5 ［E］/［S］對水解度及DPPH自由基清除率的影響

2.1.4 溫度對核桃蛋白水解度及抗氧化活性的影響

選用 Alcalase2.4L在 pH 值 9.0，［S］為 2%，［E］/［S］為2.5%的條件下水解2 h，研究溫度對水解度和抗氧化活性的影響，結果分別見圖6和圖7。

圖6 溫度對水解度及還原能力的影響

溫度對酶催化反應的影響是多方面的，溫度提高會影響酶的穩(wěn)定性和底物轉化為產物的速度，在一定范圍內，溫度的提高可加快反應速度使得水解度升高以及酶解物還原能力的增強［13］。由圖6可知，在55℃時，酶解的水解度最大。當溫度達60℃時，水解度反而呈下降趨勢。這可能是因為溫度升高，使得酶蛋白的結構發(fā)生改變，造成酶活性降低。隨著溫度的升高，酶解物的還原能力逐漸增強，50℃以后還原能力增長趨于緩慢。從圖7可知，溫度對酶解產物的活性的影響較大，在50℃時表現(xiàn)出最強的DPPH自由基清除能力，因此選擇溫度范圍為45～55℃。從圖6和圖7也可進一步證實，水解度與酶解物的抗氧化活性并不成線性關系。

圖7 溫度對水解度及DPPH自由基清除率的影響

2.1.5 pH值對水解度及抗氧化活性的影響

選用 Alcalase2.4L 在［S］為 2%，［E］/［S］為2.5%，溫度為50℃的條件下水解2h，研究pH值對水解度和抗氧化活性的影響，結果分別見圖8和圖9。

圖8 pH值對水解度及還原能力的影響

圖9 pH值對水解度及DPPH自由基清除率的影響

pH值通過影響酶蛋白的構象和酶分子及底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶的穩(wěn)定性、酶與底物的結合以及酶催化底物轉變?yōu)楫a物，進而影響酶的催化效果［13］。由圖8可見，在 pH 值7.5～10，水解度和還原能力隨pH值的增加而增加。由圖9可知，當pH值為9時，酶解產物對DPPH自由基清除能力最強。當pH值為10時，雖然其水解度最大，卻表現(xiàn)出最低的DPPH自由基清除能力，可能是由于過度水解將活性片斷進一步切斷。由此也可見，水解度與抗氧化活性并不表現(xiàn)為線性關系。因此，pH值8.5～9.5為適宜范圍。

2.2 酶解工藝參數優(yōu)化［14－15］

為了獲得高活性的核桃抗氧化肽，在單因素試驗的基礎上，固定［S］為2%，酶解時間為2 h，以［E］/［S］、酶解溫度及pH值3個因素為自變量(分別以X1，X2，X3表示)，以DPPH自由基清除率為響應值設計了3因素3水平共15個實驗點的響應面分析實驗，15個實驗點分為12個析因點和3個0點，每個試驗因素水平選取如表1所示。

表1 三因素三水平響應面分析試驗設計表

實驗以隨機次序進行，將實驗所得的DPPH自由基清除率用Minitab15.0程序進行分析，并得出響應面分析圖、回歸擬合方程以及方差分析表。響應面實驗設計與結果見表2。

表2 核桃抗氧化肽酶解條件優(yōu)化試驗設計及結果

利用Minitab軟件對實驗數據進行分析，由表3得出擬合二次多項式方程為:

表3 三因素三水平中心組合參數估計

表4 方差分析

由表3知，對方程影響顯著程度由大到小依次為酶解溫度、［E］/［S］、pH，酶解溫度和［E］/［S］對方程影響最顯著，說明這二者直接關系到DPPH自由基的清除率，而pH值的影響在一定范圍內并不是最顯著，并且得知方程一次項、二次項的影響都是顯著的，各因素之間不是簡單的線性關系，而是二次關系。

由表4知模型的回歸極顯著，交互作用較顯著，說明3因素之間存在相互影響;失擬項F檢驗不顯著，表明用方程Y擬合3個參數與DPPH自由基清除率之間的關系是可行的;實驗誤差小，故可用回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

同時做出中心組合設計試驗所得的三組響應面曲面圖(圖10)。響應面圖形是特定的響應值Y對應的因素X1、X2、X3構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應值的影響。圖中可看到擬合曲面有最大值，對擬合方程求偏導，可得出模型最大值，即為最優(yōu)的試驗方案。

圖10 因素交互作用對DPPH自由基清除率的響應面分析

為了進一步確證最佳點的值，利用上述分析進行最優(yōu)工藝的推導，對回歸方程取一階偏導數為0，并整理得:

3.461 2－14.68X1+1.462 5X2+4.355X3=0

－5.775+1.462 5X1－24.575X2+0.532 5X3=0

－2.493 8+4.355X1+0.532 5X2－27.67X3=0

聯(lián)立上述3個方程求解，得到X1=0.194 4，X2=－0.225 2，X3=－0.063 8。換算后得到最佳工藝條件是［E］/［S］為2.597 2%、酶解溫度為 48.87 4℃、pH為8.968 1。由回歸方程預測對DPPH自由基的理論清除率為70.11%。

2.3 驗證實驗

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件再重復實驗3次，考慮到實際操作的便利，將工藝參數修正為:［E］/［S］2.6%，酶解溫度49℃，pH值9，在上述優(yōu)化條件下實際對DPPH自由基的清除率為69.85%，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.37%，說明了回歸方程的預測值與試驗值之間具有較好的擬合度。

3 結論

(1)水解核桃蛋白的蛋白酶選用Alcalase2.4L堿性蛋白酶。

(2)核桃抗氧化肽的最佳酶解條件為:［S］2%、［E］/［S］2.6%、pH9、49℃、2h，在此條件下制備的核桃抗氧化肽對DPPH自由基的清除率達69.85%。

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Optimization of the Preparation of Antioxidative Peptide from Walnut Protein with Enzymolysis Technology

Kang Wei-li，Tang Jun-hu，Jing Si-qun
(College of Life Sciences ＆ Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Single－factor experiments and response surface analysis were adopted to study the effect of［E］/［S］，pH value and enzymolysis temperature on preparation of antioxidant peptide，with the DPPH radical scavenging rate as the response value.According to the above results，the optimum enzymatic hydrolysis conditions for preparation of antioxidant peptides from Walnut protein using alkaline protease enzyme was obtained as follows:［E］/［S］2.6%，pH 9，enzymolysis temperature 49℃，［S］2%，enzymolysis time 2h.Under these conditions，the scavenging rate of DPPH radical is up to 69.85%.

walnut protein，antioxidant peptide，enzymatic hydrolysis，response surface methodology(RSM)，optimization

碩士研究生(敬思群為通訊作者)。

*新疆維吾爾自治區(qū)科技人員服務企業(yè)行動項目資助(No.2009GJG40043)

2010－07－23，改回日期:2010－09－16