王海兵，吳曉英，洪秀云

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)

代謝調(diào)控物對(duì)紅酵母累積番茄紅素的影響

王海兵，吳曉英，洪秀云

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)

黏紅酵母是一種可以生產(chǎn)類胡蘿卜素的單細(xì)胞真菌，番茄紅素是一種未環(huán)化類胡蘿卜素，可以運(yùn)用代謝控制手段，調(diào)控和阻遏某些相關(guān)的反應(yīng)，使其累積番茄紅素。作者基于紅酵母中類胡蘿卜素的合成途徑，對(duì)環(huán)化抑制劑煙堿、麥角固醇合成抑制劑酮康唑、MoG還原酶激活劑青霉素、氧化劑過氧化氫等代謝調(diào)節(jié)物的調(diào)控條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)添加一定量的上述代謝調(diào)控物質(zhì)確實(shí)可以促進(jìn)黏紅酵母中番茄紅素的累積。試驗(yàn)中采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化了代謝調(diào)控的條件，研究結(jié)果表明，分別在發(fā)酵的24 h加入煙堿2.5mL/L和青霉素4 mg/L，36h時(shí)添加雙氧水1.2mL/L，60h時(shí)添加酮康唑400 mg/L，可以使番茄紅素累積量達(dá)到176.97 mg/L，是未用代謝調(diào)控時(shí)番茄紅素產(chǎn)量4.10 mg/L的43.2倍。

紅酵母，番茄紅素，代謝調(diào)控

番茄紅素是一種具有11個(gè)共軛雙鍵的不飽和碳?xì)浠衔铮瑸轭惡}卜素的一種，是很重要的生物活性物質(zhì)，在預(yù)防和治療前列腺癌、乳腺癌等癌癥，增強(qiáng)人體免疫功能以及心血管疾病方面有著巨大的潛力［1－3］。

目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用的番茄紅素的來源主要有2方面:植物提取法和微生物發(fā)酵法。用植物提取法制取番茄紅素，雖然原料來源廣泛易得，但是含量較低、副產(chǎn)物較多，原料供應(yīng)受到氣候與季節(jié)的影響較大，使得生產(chǎn)成本較高;與此相比，微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)菌可通過基因改造而大幅提高產(chǎn)量，易于放大和工業(yè)化生產(chǎn)。目前，生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的主要菌種有三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和紅酵母(Rhodotorular)。雖然與三孢布拉氏霉相比，紅酵母的單位產(chǎn)量比較低，但由于其具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短及菌體營(yíng)養(yǎng)豐富等許多優(yōu)點(diǎn)，具有很高的實(shí)用價(jià)值和很好的工業(yè)開發(fā)前景。

一般情況下，微生物合成的主要類胡蘿卜素，是番茄紅素經(jīng)過環(huán)化和氧化等之后的衍生物，如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等［4］。因此，針對(duì)類胡蘿卜素這樣的一個(gè)合成途徑［5］，可以從3方面提高番茄紅素的累積:1是要加強(qiáng)和促進(jìn)類胡蘿卜素合成途徑，2是要控制番茄紅素后續(xù)反應(yīng)的過程，阻止其環(huán)化反應(yīng)，3是阻遏其他的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，使其代謝向有利于合成番茄紅素的方向進(jìn)行。本文就不同代謝調(diào)節(jié)物對(duì)番茄紅素合成的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的1株產(chǎn)番茄紅素的黏紅酵母2.27。

1.2 主要儀器和試劑

番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，上海融和醫(yī)藥公司;煙堿(95%)，西安天則生物技術(shù)有限責(zé)任公司;雙氧水(含體積分?jǐn)?shù)30%H2O2的水溶液)，廣州化學(xué)試劑廠;酮康唑，廣州迪越化工有限公司;青霉素，廣州美津生物技術(shù)有限公司。

SHP－450D型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SKYB2112B型恒溫?fù)u床，廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司;LD5－2A低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;2802S型紫外分光光度計(jì)，尤尼科(上海)儀器有限公司;Waters高效液相色譜儀1525，Waters紫外分光檢測(cè)器2487。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

斜面活化培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，瓊脂20g/L，自然pH。

液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，自然pH。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖50g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，初始pH 5，核黃素 0.5 mg/L，吐溫－80 1.5%。

種子斜面活化培養(yǎng):挑黏紅酵母1環(huán)，接入斜面活化培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h。

液體種子培養(yǎng):從活化了的斜面種子中挑取培養(yǎng)2環(huán)，接于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶?jī)?nèi)，28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

液體發(fā)酵培養(yǎng):以5%的接種量，將液體種子接入到裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在光照條件下，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)96 h。

1.4 生物量的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，取10mL液體發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀水洗后再次離心，得酵母泥，于55℃下過夜烘干，稱干質(zhì)量

1.5 番茄紅素的提取

發(fā)酵結(jié)束后，參照文獻(xiàn)采用熱酸法破壁［8］，丙酮浸提:取發(fā)酵液10mL轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，沉淀水洗后得酵母泥;加入3mol/L的HCl溶液5mL，混合均勻后浸泡1.5 h，然后再沸水浴4 min，迅速冷卻，再4 000 r/min離心10 min，得沉淀水洗2次，離心得到菌體殘片;加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4 000 r/min下離心10 min，得到色素丙酮浸提液。

1.6 番茄紅素含量測(cè)定方法

將色素提取液用0.22μm的微孔濾膜過濾后，以高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定提取液中番茄紅素的含量。同時(shí)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在相同條件下測(cè)定，根據(jù)峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

Waters－1525高效液相色譜儀;色譜柱為:Agilent HC C－18柱(5μm，250 mm ×4.6 mm);Binary高效泵;檢測(cè)器為:Waters－2487，Double λ Absorbance Detector;數(shù)據(jù)分析軟件:Breeze。

高效液相色譜條件:流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=10∶90，檢測(cè)波長(zhǎng)為472 nm，流速為1.0mL/min，柱溫為 28℃，進(jìn)樣量為 10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量2.5 mg的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，質(zhì)量濃度為250μg/mL。再分別稀釋成 50、100、150、200、250μg/mL的質(zhì)量濃度梯度，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后HPLC檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理，得到峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線為:y=10.892x，R2=0.998 4。

2.2 煙堿加入的不同時(shí)間對(duì)番茄紅素累積的影響

在開始液態(tài)發(fā)酵后，分別在 6、12、18、24、30 h，以2.5mL/L的添加量加入煙堿，結(jié)果如圖1所示。

圖1 煙堿的加入時(shí)間對(duì)番茄紅素合成的影響

從圖1可以看出，隨著時(shí)間的推移，加入煙堿后番茄紅素的產(chǎn)量先高后低，在24 h加入時(shí)達(dá)到最大值11.51 mg/L;生物量一直隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在30 h加入時(shí)達(dá)到最大值21.44g/L?？赡苁怯捎跓焿A對(duì)酵母菌細(xì)胞有一定的毒害作用，在發(fā)酵的早期加入會(huì)對(duì)黏紅酵母生長(zhǎng)不利，因而生物量較低。綜合考慮，添加代謝調(diào)節(jié)物煙堿的時(shí)間為24 h。

2.3 酮康唑加入的不同時(shí)間對(duì)番茄紅素累積的影響

液態(tài)發(fā)酵至24 h，添加2.5mL/L的煙堿后，再分別在發(fā)酵的 48、54、60、66、72 h，以 400 mg/L 的量加入酮康唑，對(duì)黏紅酵母合成番茄紅素的影響如圖2所示。

圖2 酮康唑的加入時(shí)間對(duì)番茄紅素合成的影響

根據(jù)圖2可知，隨著酮康唑加入時(shí)間的推移，黏紅酵母的生物量和番茄紅素產(chǎn)量都先增大后減小，在發(fā)酵至60 h時(shí)加入酮康唑時(shí)兩者都達(dá)到了最大值，分別為22.04g/L和87.27 mg/L。由于酮康唑可以抑制真菌細(xì)胞膜中麥角固醇的合成，使得更多的前體物質(zhì)法尼基雙磷酸酯(FPP)用于合成番茄紅素，但過早的加入酮康唑，對(duì)酵母細(xì)胞的增殖會(huì)有一定的抑制作用，因此要在發(fā)酵達(dá)到穩(wěn)定期再加入，故最適宜加入時(shí)間為60 h。

2.4 青霉素加入時(shí)間對(duì)番茄紅素累積的影響

在發(fā)酵至24h時(shí)加入2.5mL/L煙堿，60h時(shí)加入酮康唑400 mg/L，然后分別在發(fā)酵的12、18、24、30和36 h，加入青霉素1 mg/L，對(duì)黏紅酵母合成番茄紅素的影響如圖3所示。

圖3 青霉素的加入時(shí)間對(duì)番茄紅素合成的影響

從圖3可以看出，在發(fā)酵前期添加青霉素，黏紅酵母的番茄紅素產(chǎn)量先增大后減小，24h時(shí)達(dá)到最大值103.33 mg/L。因此，作為MoG還原酶的激活劑的青霉素，最適宜加入時(shí)間為發(fā)酵至24h時(shí)。

2.5 雙氧水加入時(shí)間對(duì)番茄紅素累積的影響

在發(fā)酵至24h時(shí)加入2.5mL/L煙堿和1 mg/L青霉素，60h時(shí)加入酮康唑400 mg/L，然后分別在發(fā)酵的 24、30、36、42、48 h，加入雙氧水量 1.6mL/L，對(duì)紅酵母累積番茄紅素影響如圖4所示。

從圖4可以看到，隨著雙氧水加入時(shí)間的向后推移，黏紅酵母的生物量和番茄紅素產(chǎn)量都是先增大后減小，42 h加入雙氧水，生物量達(dá)到最大值25.98g/L;36h加入雙氧水，產(chǎn)量達(dá)到最大值160.96 mg/L。由于酵母細(xì)胞對(duì)于雙氧水的氧化刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而促進(jìn)了番茄紅素的合成，但如果過早的加入，此時(shí)細(xì)胞濃度較低，對(duì)其繼續(xù)增殖不利，加入時(shí)間太晚，又會(huì)消耗掉一些已經(jīng)生成的番茄紅素，因此，雙氧水的最佳加入時(shí)間是黏紅酵母發(fā)酵至36 h時(shí)。

圖4 雙氧水的加入時(shí)間對(duì)番茄紅素合成的影響

2.6 各種代謝調(diào)控物質(zhì)添加量的優(yōu)化

從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到幾種代謝調(diào)節(jié)物的最佳加入時(shí)間點(diǎn)為:煙堿在發(fā)酵至24 h時(shí)加入，酮康唑在60 h時(shí)加入，青霉素在24 h時(shí)加入，雙氧水在36 h時(shí)加入。為了進(jìn)一步提高其代謝調(diào)控的水平，用均勻試驗(yàn)的方法對(duì)各種調(diào)節(jié)物的添加量進(jìn)行了優(yōu)化，各因素及水平的選取見表1。

表1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)各因素及其水平

由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如表2所示。

表2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

從表2可以看出，運(yùn)用組合N1可以得到黏紅酵母生物量和番茄紅素產(chǎn)量的最大值，即煙堿2.5mL/L，酮康唑600 mg/L，青霉素4 mg/L，雙氧水1.2mL/L的添加量時(shí)，可以得到番茄紅素的最大產(chǎn)量176.97 mg/L

3 結(jié)論與討論

本文研究了紅酵母在發(fā)酵產(chǎn)生番茄紅素過程中，添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑、麥角固醇抑制劑、青霉素和氧化劑對(duì)番茄紅素生物合成的影響。實(shí)驗(yàn)中以煙堿作為環(huán)化酶抑制劑的添加，可以阻遏類胡蘿卜合成中番茄紅素的環(huán)化［6］，使得番茄紅素得以累積;由于麥角固醇和番茄紅素的合成有共同的前體物質(zhì)法尼基雙磷酸酯(FPP)［7］，因此酮康唑的加入抑制了麥角固醇的合成，使得更多的FPP用來合成番茄紅素［8－9］，其產(chǎn)量必然增加;青霉素作為MoG還原酶的激活劑，可以增加前體物質(zhì)IDP的合成，促進(jìn)番茄紅素的合成［10］;雙氧水為氧化劑，對(duì)黏紅酵母的刺激增強(qiáng)了番茄紅素的合成代謝流，才得以使番茄紅素大量積累［11］。

采用均勻試驗(yàn)對(duì)幾種調(diào)節(jié)物的添加量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合單因素確定的最佳添加時(shí)間，得到各調(diào)節(jié)物的添加方式為:24h時(shí)加入煙堿2.5mL/L，60h時(shí)加入酮康唑600 mg/L，24h時(shí)添加青霉素4 mg/L，36h時(shí)加入雙氧水1.2mL/L，可使番茄紅素得到大量的積累，達(dá)到176.97 mg/L，是不加效應(yīng)物時(shí)番茄紅素產(chǎn)量4.10 mg/L的43.2倍。

［1］Clinto S K.Lycopene:chemistry，biology，and implication for human health and disease［J］.Nutr Rev，1998，56(2):35－51.

［2］BramLey P M.Is lycopene beneficial to human health［J］.Phytochemistry，2000，54(3):233－236.

［3］Pohar K S，Gong M C，Bahnson R，et al.Tomatoes，lycopene and prostate cancer:a clinician＇s guide for counseling those at risk for prostate cancer［J］.World J Urol，2003，21(1):9－14.

［4］徐志強(qiáng)，余曉斌，鄭亞平.類胡蘿卜素代謝工程［J］.天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)，2003，15(1):259－263.

［5］惠伯棣主編.類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:41－48.

［6］徐娜，鄭珩，許激揚(yáng).環(huán)化酶抑制劑對(duì)三孢布拉霉產(chǎn)生番茄紅素的影響［J］.中國(guó)抗生素雜志，2006，31(6):372－375.

［7］何秀萍，張博潤(rùn).微生物麥角固醇的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1998，25(3):166－169.

［8］王振文，趙亞軍，郝超焰.麥角固醇生物合成抑制劑——發(fā)展歷史及其對(duì)農(nóng)業(yè)的貢獻(xiàn)［J］.農(nóng)藥，1985，18(2):38.

［9］孫淑娟，婁紅祥，孫樂群.真菌感染與抗真菌藥物［J］.食品與藥，2005，7(2):1.

［10］解書懷，余曉斌，顧秋亞.代謝途徑酶活促進(jìn)劑對(duì)番茄紅素發(fā)酵的影響［J］.生物加工過程，2008，6(2):17－21.

［11］楊建明，楊安全，許激揚(yáng).效應(yīng)物促進(jìn)紅酵母累積番茄紅素的工藝研究［J］.藥物生物技術(shù)，2008，15(3):204－207.

［12］郭秒.類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的鑒定及培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7):73－77.

Effect of Metabolism Regulating Agents on Biosynthesis of Lycopene in Rhodotorula

Wang Hai-bing，Wu Xiao-ying，Hong Xiu-yun
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Techology，Guangzhou 510006，China)

Rhodotorula glutinis，a kind of caroteniod producing unicellular epiphyte，is widespread in nature.As lycopene is a carotenoid without cyclization，metabolic control means can be used to control and deter some of the related response to accumulate lycopene.On the basis of biosynthesis path of caroteniod in Rhodotorula，experiments were carried out to stduy the regulation conditions of the conditioners，such as cyclase inhibitor nicotine，ergosterol synthesis inhibitor ketoconazole，MoG reductase activator penicillin and oxidant hydrogen peroxide.We identified that lycopene was accumulated with adding this regulator above.The results revealed that the highest lycopene concentration was obtained when 2.50 ml/L nicotine，4mg/L penicillin，1.2mL/L aquae hydrogenii dioxide(30%Hydrogen peroxide)and 400mg/L ketoconazole were added respectively at 24h，24h，36h and 60h following Rhodotorula inoculation.It reached to 176.97mg/L，43.2 times of initial lycopene yield 4.10 mg/L.

Rhodotorula，lycopene，metabolic regulation

碩士研究生(吳曉英副教授為通訊作者)。

2010－08－05，改回日期:2010－06－25