徐占利，張紅印，黃星奕

（江蘇大學食品科學與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江202013）

膠紅酵母的急性毒性及遺傳毒性研究

徐占利，張紅印*，黃星奕

（江蘇大學食品科學與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江202013）

背景與目的：研究膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）急性毒性及遺傳毒性，為膠紅酵母在水果采后病害生物防治應用中的安全性提供科學的實驗依據(jù)。材料與方法：采用急性經(jīng)口毒性實驗、Ames實驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗及小鼠精子畸形實驗對膠紅酵母進行安全性評價。結(jié)果：膠紅酵母制劑的小鼠經(jīng)口LD50＞21.5g/kg；3項遺傳毒性實驗結(jié)果均為陰性。結(jié)論：在本實驗條件下，膠紅酵母經(jīng)口毒性實驗屬無毒級別，并且未見遺傳毒性作用。

膠紅酵母，急性毒性，遺傳毒性

水果在采摘、運銷以及儲藏過程中因腐爛造成的損失是巨大的。在發(fā)達國家有10%～30%的新鮮產(chǎn)品由于采后病害導致腐爛，而在缺乏貯運冷鏈設備的發(fā)展中國家，采后腐爛率則高達40%～50%［1］。我國水果采后腐爛率一般在20%～30%，高者達50%。腐爛的主要原因歸因于病原微生物的致病作用［2］。目前最常用的有效控制方法是低溫和化學殺菌劑處理。近年來雖然冷藏技術(shù)在我國得到了廣泛的發(fā)展，但是在低溫貯藏情況下，仍有相當數(shù)量的病原菌可以在水果上面生長，從而引起腐爛?；瘜W殺菌劑處理，雖然效果顯著，但是在殺死病原菌的同時也殺死了有益微生物，且藥物殘留對人體健康和環(huán)境的危害很大。據(jù)美國科學院報告顯示，用于處理食品的殺菌劑中，60%有致癌的危險性。多種殺菌劑（如Captan、Benomyl等）已被美國環(huán)保局明令禁止使用或限制使用［3］。為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全，各國科學家都在積極探索能代替化學殺菌劑的病害防治新技術(shù)，美國、意大利等發(fā)達國家生物防治研究取得了階段性的成果，使得生物防治成為可能取代化學殺菌劑的有效方法。目前，已研究可作為水果采后病害生物防治的微生物有細菌、霉菌和酵母菌［4］等?，F(xiàn)己報道的酵母菌約有20多種。近來，本實驗室篩選分離到一株拮抗酵母，經(jīng)系統(tǒng)分類鑒定，是膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。研究表明，膠紅酵母對梨灰霉?。ㄓ葿otrytis cinerea引起）、桃果青霉?。ㄓ蒔enicillium expansum引起）都表現(xiàn)出顯著的拮抗效果。為了使其能夠在生物防治中得到應用，本文對其安全性進行了急性經(jīng)口毒性實驗和遺傳毒性實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）凍干粉制劑制備方法參考文獻［1］，實驗前用蒸餾水配制成500mg/mL混懸液；清潔級昆明種小鼠 由江蘇大學動物實驗中心提供；2，4，7－三硝基－9－芴酮（9－fluorenone）、1，8 二 羥 基 蒽 醌（1，8 －dihydroxyanthraquinone）、2－氨基芴（2－AF）、疊氮鈉（NaN3） Sigma公司；大鼠肝微粒體酶復合物（S9）江蘇省疾控中心；環(huán)磷酰胺（CP） 江蘇普瑞制藥有限公司；敵克松（Dexon） 伊紅國藥集團；Giemsa染液 國藥集團；小牛血清 四季青公司。

1.2 實驗方法［5-10］

1.2.1 小鼠急性毒性實驗 采用霍恩氏（Horn）法，小鼠體重為18～22g共30只，雌雄各半。實驗前，動物隔夜空腹（不限制飲水），隨機分成三組，每組10只（雌、雄各半）按21.5、10、4.64g/kg三組不同的劑量一次給予受試物。連續(xù)觀察14d，記錄中毒時間，中毒表現(xiàn)及死亡情況等。

表2 艾姆氏實驗結(jié)果

1.2.2 Ames實驗 采用四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。實驗前進行菌種特性鑒定，性能應與Ames實驗標準相符。方法采用平板摻法，分加與不加S9混合液兩種。受試物加熱滅活后，共設4個劑量組，分別為每平皿2150、1000、464、215!g。同時設立空白對照、陽性對照（9－fluorenone、1，8－dihydroxyanthraquinone、2－AF、Dexon、NaN3），每一組做三個平行。在37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，記錄每皿回變菌落數(shù)，重復實驗1次，求出每個劑量組的平均菌落數(shù)。以直接計數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌菌落數(shù)的多少而定，如在背景生長良好條件下，受試物組回變菌菌落數(shù)增加一倍以上，并有劑量反應關(guān)系或者至少某一測試點有可重復的并有統(tǒng)計學意義的陽性反應，即可認為該受試物誘變實驗陽性。

1.2.3 小鼠骨髓微核實驗 選用7～12周齡，體重25～30g的小鼠50只，雌、雄各25只。隨機分為五組，每組10只（雌雄各5只），劑量分別為21.5、10、4.64g/kg，同時設溶劑（無菌蒸餾水）對照組和陽性對照組（陽性對照物為環(huán)磷酰胺50mg/kg）。經(jīng)口灌胃，用30h給受試物法。兩次經(jīng)口給予受試物時間間隔24h，第二次給予受試物后6h，頸椎脫臼處死動物，取股骨制備骨髓涂片，Giemsa染液染色后鏡檢閱片計數(shù)嗜多染紅細胞中的微核發(fā)生率。計算公式如下：

1.2.4 小鼠精子畸形實驗 選用成年的雄性6～8周齡，體重25～35g的小鼠25只，隨機分成五組，每組5只，劑量分別為21.5、10、4.64g/kg，同時設溶劑（無菌蒸餾水）對照組和陽性對照組（陽性對照物為環(huán)磷酰胺50mg/kg）。經(jīng)口灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)5d。于首次給予受試物后的第35d頸椎脫臼處死動物，取出兩側(cè)附睪，放入盛有適量生理鹽水平皿中，制備精子懸液，涂片，甲醇固定，伊紅染色，高倍鏡下檢查每只動物的精子形態(tài)。計數(shù)完整的精子1000個，記錄畸形的精子數(shù)目，計算精子畸形率。計算公式如下：

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行分析，以x±s描述、假設檢驗采用 t檢驗及方差分析［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗

按照實驗設計的劑量對小鼠一次性給予最大劑量法進行灌胃，連續(xù)觀察14d，未見小鼠有中毒情況，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。實驗結(jié)果見表1。

表1 不同劑量酵母懸液的LD50

根據(jù)上表中結(jié)果，不同灌胃劑量膠紅酵母，給小鼠的經(jīng)口 LD50＞21.5g/kg。根據(jù)中華人們共和國GB15193.3－2003附錄急性毒性（LD50）劑量分級表的規(guī)定，膠紅酵母屬無毒級。

2.2 Ames實驗

膠紅酵母的Ames實驗結(jié)果見表2。

由表2可知，膠紅酵母制劑的4個測試濃度在加S9和不加S9活化的情況下，對TA97、TA98、TA100和TA102 4個菌株的回復突變菌落數(shù)未超過陰性對照（無菌室組）自發(fā)回復突變菌落數(shù)的2倍，也無劑量－效應關(guān)系差異，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與陽性對照比較差異有統(tǒng)計學意義（*P＜0.01）。說明菌株在215～2150!g/皿的劑量內(nèi)，它們對測試菌株無致突變性。

2.3 膠紅酵母菌懸液對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率的影響

膠紅酵母菌懸液對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率的實驗結(jié)果見下表3。

由表3可知，膠紅酵母菌不同劑量的菌懸液，21.5、10、4.64g/kg三個劑量組微核發(fā)生率均在正常范圍之內(nèi)，經(jīng)統(tǒng)計學處理與陰性對照組（無菌水組）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陽性對照組（環(huán)磷酰胺組）與陰性對照組比較差異顯著（P＜0.01），說明在21.5g/kg以下的劑量沒有致突變作用。

2.4 膠紅酵母菌懸液對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

膠紅酵母菌懸液對小鼠精子畸形發(fā)生率的實驗結(jié)果見表4。

表3 不同劑量膠紅酵母菌懸液對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率的影響

表4 酵母菌懸液對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

由表4可以看出，膠紅酵母菌菌懸液的不同劑量組的精子畸形率均在正常的范圍內(nèi)，經(jīng)統(tǒng)計學處理與陰性對照組（無菌水組）比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陽性對照組（環(huán)磷酰胺組）與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明膠紅酵母對小鼠精子細胞無致突變作用。

3 討論

近年來美國、意大利等發(fā)達國家生物防治研究已經(jīng)取得了階段性的成果，生物防治的應用潛力巨大，使得它可能成為取代化學殺菌劑的有效方法，酵母菌由于拮抗效果好，不產(chǎn)生毒素、可以和化學殺菌劑共同使用等優(yōu)點而成為水果采后病害生物防治研究的主要菌種［12］。本研究以實驗室自己篩選的生防效果明顯的膠紅酵母菌株，采用急性經(jīng)口毒性實驗、Ames實驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗及小鼠精子畸形實驗對膠紅酵母進行安全性評價。膠紅酵母經(jīng)口急性毒性的LD50＞21.5g/kg，根據(jù)GB15193.3－2003附錄急性毒性（LD50）劑量分級表的規(guī)定，膠紅酵母屬無毒級；無論加不加S9活化物，膠紅酵母的不同劑量組對鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102的回復突變數(shù)均在正常突變范圍，也無劑量－效應關(guān)系差異，說明膠紅酵母酵母對測試菌株無致突變性；膠紅酵母菌不同劑量的菌懸液的微核發(fā)生率均在正常范圍之內(nèi)，說明在小于21.5g/kg的劑量下沒有致突變作用；不同劑量組的精子畸形率均在正常的范圍內(nèi)，說明膠紅酵母對小鼠精子細胞無致突變作用。以上實驗結(jié)果表明，膠紅酵母做為生物防治菌屬于安全無毒級，并且未見遺傳毒性。

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Study on acute and genetic toxicities of Rhodotorula mucilaginosa

XU Zhan－li，ZHANG Hong－yin*，HUANG Xing－yi
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 202013，China）

Background and purpose：The acute and genetic toxicities of Rhodotorula mucilaginosa were studied，and scientific experimental data for biocontrol microbe’s safety was provided.Materials and methods：Acute oral toxicity test，Ames test，micronucleus test of mice bone marrow polychromatic erythrocytes，mice sperm shape abnormality test were used.Results：The acute oral LD50of Rhodotorula mucilaginosa was more than 21.5g/kg in mice.The results of genetic toxicity tests all showed negative.Conclusion：The genetic toxicity of Rhodotorula mucilaginosa was not found，and it was classified as non－toxic agent.

Rhodotorula mucilaginosa；acute toxicity；genetic toxicity

TS201.6

A

1002－0306（2010）12－0303－03

2009－10－09 *通訊聯(lián)系人

徐占利（1982－），男，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

中國博士后科學基金（200801362）；江蘇省自然科學基金（BK2009214）；江蘇大學拔尖人才工程基金（1211360002）。