孫國政，甘伯中，3，*，張衛(wèi)兵，李曉鵬

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅蘭州730070；3.甘肅省干酪素工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000）

天祝牧區(qū)牦牛乳酥油中產(chǎn)脂肪酶菌株篩選及產(chǎn)酶條件的研究

孫國政1，2，甘伯中1，2，3，*，張衛(wèi)兵1，2，李曉鵬1，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅蘭州730070；3.甘肅省干酪素工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000）

從甘肅省天祝牧區(qū)牦牛乳酥油中分離篩選產(chǎn)脂肪酶微生物。經(jīng)初篩、復(fù)篩后得菌株S122產(chǎn)脂肪酶活力較高；形態(tài)學(xué)觀察和26S rDNA序列比對分析表明該菌為Geotrichum sp.S122。對菌株Geotrichum sp.S122發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究表明，其最適的發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分（%）：蔗糖1.0、蛋白胨2.0、硫酸鎂0.1、磷酸氫二鉀1.0、橄欖油乳化液1.0；最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件：培養(yǎng)基初始pH8.0，培養(yǎng)溫度28℃，接種量4%，裝液量60mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵周期96h，優(yōu)化后脂肪酶活力最高達(dá)59U/mL。

牦牛乳酥油，脂肪酶，分離篩選，產(chǎn)酶條件

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）全稱甘油三酯水解酶，是一類重要的甘油酯鍵水解酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，能夠在油水界面催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油、甘油一酯及甘油二酯，也可催化合成脂類化合物及完成酯交換［1－2］。因此，脂肪酶在食品、醫(yī)藥、生物化工、洗滌劑、制革、水產(chǎn)、飼料、造紙、油脂、環(huán)保等許多工業(yè)領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用［3－6］。脂肪酶來源非常廣泛，在許多動植物和微生物中都存在［7］。目前對微生物脂肪酶的研究已有報道［8－11］，其均為從土壤中分離篩選產(chǎn)脂肪酶微生物，從牦牛乳酥油中分離篩選產(chǎn)脂肪酶微生物的報道目前尚未出現(xiàn)。甘肅天祝藏族自治縣的牧民將牦牛乳經(jīng)過離心脫脂制成酥油，牧民在長期貯藏酥油過程中酥油的品質(zhì)發(fā)生劣變，一方面由于在貯藏過程中酥油自身發(fā)生油脂氧化反應(yīng)；另一方面酥油在粗放型環(huán)境中制作，外界微生物侵染，在后續(xù)貯藏過程中由于酥油豐富的營養(yǎng)使微生物大量生長繁殖釋放胞外脂肪酶催化酥油裂解成游離脂肪酸導(dǎo)致酥油品質(zhì)變化。天祝牧區(qū)地處高原，常年氣溫低下［12］，酥油在貯藏過程中油脂自身發(fā)生氧化反應(yīng)幾率相對小，因此推斷酥油發(fā)生品質(zhì)變化的主要原因是微生物分泌胞外脂肪酶催化所致，所以天祝牦牛乳酥油是分離篩選產(chǎn)脂肪酶微生物很好的來源。本研究對從甘肅省天祝牧區(qū)牦牛乳酥油中篩選分離的菌株進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶性能研究并對其鑒定，同時研究了該菌株的生長產(chǎn)酶條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用脂肪酶資源提供依據(jù)。

表1 不同菌株在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵酶活力

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳酥油 采集甘肅省天祝牧區(qū)；富集培養(yǎng)基 酵母膏2g/L、磷酸氫二鈉3.5g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉0.5g/L、橄欖油乳化液10mL/L，pH7.0；平板分離培養(yǎng)基 酵母膏1g/L、牛肉膏1g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂20g/L、橄欖油乳化液20mL/L，pH7.0；種子培養(yǎng)基 蛋白胨25g/L、蔗糖10g/L、硫酸銨5g/L、硫酸鎂0.5g/L、酵母膏2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、橄欖油乳化液10mL/L，pH自然；搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基［13］蛋白胨20g/L、蔗糖10g/L、硫酸銨 1g/L、硫酸鎂 0.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、橄欖油乳化液10mL/L，pH8.0；橄欖油乳化液制備 橄欖油與體積分?jǐn)?shù)4%的聚乙烯醇（PVA）以1∶3（V/V）的比例混合，10000r/min攪拌乳化5min即為橄欖油乳化液。

SW－CJ－2FD超凈工作臺 蘇州凈化；YX－280A高壓滅菌鍋 上海三申；HG303－4電熱恒溫培養(yǎng)箱

南京實驗儀器廠；PB203－N電子天平 上海；pHS－25數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器廠；XSP－18S顯微鏡。

1.2 菌種分離

1.2.1 富集培養(yǎng) 準(zhǔn)確稱取1.00g樣品于滅菌的100mL三角瓶中，每瓶中含30mL生理鹽水，10粒玻璃珠，室溫下120r/min振蕩10min；吸取樣品懸液5mL于裝有50mL富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接2mL渾濁的樣品懸液到新鮮的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集培養(yǎng)3次。

1.2.2 初篩 吸取富集培養(yǎng)液1mL于9mL無菌生理鹽水中，采用梯度稀釋法稀釋至10－5，取10－3、10－4、10－5三個稀釋度菌懸液200!L涂布到平板分離培養(yǎng)基。28℃培養(yǎng)24h以獲得產(chǎn)脂肪酶的菌株。觀察培養(yǎng)基上是否有透明圈，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值的大小，選取比值較大的菌株于PDA培養(yǎng)基4℃保存，以備進(jìn)一步復(fù)篩。

1.2.3 復(fù)篩 初篩分離后的菌株轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，10000r/min離心10min，取上清液測定酶活。

1.3 脂肪酶活力的測定

脂肪酶活力為在40℃，pH8.0條件下，每1min催化底物（橄欖油）產(chǎn)1!mol脂肪酸所需的酶量定義為1個活力單位（IU）［14］。

脂肪酶活測定方法采用堿滴定法測定酶活［15］。50mL的三角瓶中加入4mL pH8.0的甘氨酸－NaOH緩沖液，5mL聚乙烯醇橄欖油乳化液，將其放置40℃水浴預(yù)熱 5min，然后精確加入 1mL酶液，保溫10min，立即加入15mL乙醇終止反應(yīng)，加入酚酞指示劑2滴，用0.05mol/L NaOH滴定至紅色為終點。

其中：V1—樣品溶液滴定值（mL）；V2—對照滴定值（mL）。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 分離純化后的菌株在28℃馬鈴薯瓊脂營養(yǎng)平板培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)及其在顯微鏡下的菌絲形態(tài)。

1.4.2 26S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌體于10!L滅菌水中99℃變性10min，離心取上清液作為模板。使用 TaKaRa Fungi Identification PCR Kit（Code No.D317）進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段（正向引物：5′－GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG－3′；反向引物：5′－GGTCCGTGTTTCAAGA CGG－3′），反應(yīng)體系共50!L，94℃預(yù)變性5min，94℃變性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃保溫5min。取5!L進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收目的片段進(jìn)行26S rDNA測序，測序由寶生物（大連）公司完成。將測定的26S rDNA序列與GenBank中核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，并基于相關(guān)屬菌株的26S rDNA序列，利用軟件MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 菌株產(chǎn)酶條件的研究

以搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別改變其中的碳源、氮源、無機(jī)鹽、橄欖油添加量研究其對脂肪酶產(chǎn)生的影響，其他條件均為培養(yǎng)基初始pH8.0、培養(yǎng)溫度 28℃、接種量 5%、搖床轉(zhuǎn)速180r/min、培養(yǎng)時間48h。在獲得的優(yōu)化培養(yǎng)基上進(jìn)一步研究培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間、裝液量、接種量等對脂肪酶產(chǎn)生的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌種的分離和篩選菌株

利用油脂平板分離法，從牦牛乳酥油中富集培養(yǎng)得到的微生物中初篩產(chǎn)脂肪酶菌株，根據(jù)水解透明圈直徑的大小挑選出10株形態(tài)各異的產(chǎn)脂肪酶單菌落菌株作為復(fù)篩對象。將分離得到的菌株轉(zhuǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基搖瓶中，28℃、200r/min培養(yǎng)48h，發(fā)酵液10000r/min離心20min，取上清液測定脂肪酶酶活性。結(jié)果見表1。

由表1可知，10株產(chǎn)脂肪酶菌株在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48h后，菌株S122的酶活最高38.9U/mL，故將產(chǎn)脂肪酶株菌S122進(jìn)行鑒定并對其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株S122在28℃馬鈴薯瓊脂營養(yǎng)平板上培養(yǎng)48h后，菌落呈圓形平面擴(kuò)散，乳白色，短絨狀或近于粉狀；顯微鏡下觀察，菌體具有分支的菌絲體，形成單個或成鏈的節(jié)孢子，節(jié)孢子呈長筒形或方形，也有橢圓或圓形（圖1）。根據(jù)魏景超［16］《真菌鑒定手冊》鑒定菌株 S122為半知菌類（Fungi imperfecti）、叢梗孢目（Moniliales）、叢梗孢科（Moniliaceae）、卵形孢霉菌（Oosporeae）、地霉屬（Geotrichum LK.）。

圖1 菌株S122的菌落及菌體形態(tài)

2.2.2 26S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 測序得到菌株S122的26S rDNA核酸序列去載體、拼接處理后得26S rDNA目的核酸序列，其長度為522bp；將得到26S rDNA目的核酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列同源性比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，菌株S122與Geotrichum silvicola M17系統(tǒng)位置最近，同源性為 100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定為Geotrichum sp.S122。

圖2 根據(jù)26S rDNA序列同源性構(gòu)建的S122與相關(guān)菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 菌株S122產(chǎn)酶條件的研究

2.3.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1%葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉和蔗糖，均接入5%的種子液，28℃搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)48h，測定酶活，確定產(chǎn)脂肪酶微生物Geotrichum sp.S122的最適碳源。由圖3可知，菌株Geotrichum sp.S122利用不同碳源產(chǎn)脂肪酶差異較大，當(dāng)以蔗糖為碳源時發(fā)酵液酶活最高為31U/mL。

2.3.2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添2%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、黃豆粉和0.5%的硫酸銨、尿素、氯化銨和硝酸銨，均接入5%的種子液，在28℃搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)48h，測定酶活，確定產(chǎn)脂肪酶微生物Geotrichum sp.S122的最適氮源。由圖 4可知，不同氮源對Geotrichum sp.S122產(chǎn)脂肪酶的影響顯著，有機(jī)氮源蛋白胨對發(fā)酵產(chǎn)酶影響最顯著，無機(jī)氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶影響不顯著。

圖3 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.3 無機(jī)鹽對產(chǎn)酶的影響 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.1%的硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈣、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸錳和1%磷酸氫二鉀，均接入5%的種子液，28℃搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)48h，測定酶活，確定不同無機(jī)鹽離子對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖5可以看出，在培養(yǎng)基中添加Mg2+、K+、Zn2+、Fe2+和Mn2+對發(fā)酵產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其中Mg2+的效果更顯著；K2HPO4在培養(yǎng)基中主要起酸堿緩沖作用；Na+對發(fā)酵產(chǎn)酶具有抑制作用。

圖5 無機(jī)鹽離子對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.4 不同橄欖油含量對產(chǎn)酶的影響 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同量的橄欖油乳化液，均接入5%的種子液，28℃搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)48h，測定酶活，確定不同橄欖油含量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖6可知，培養(yǎng)基中添加不同量橄欖油對產(chǎn)酶有顯著影響，當(dāng)培養(yǎng)基中不含橄欖油時，發(fā)酵液酶活較低；當(dāng)橄欖油含量為1%時，酶活最高36U/mL。

圖6 不同橄欖油含量對產(chǎn)酶的影響

經(jīng)過以上實驗對產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基組分優(yōu)化，確定Geotrichum sp.S122的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為1%蔗糖、2%蛋白胨、0.1%硫酸鎂、磷酸氫二鉀1%、橄欖油乳化液1%。

2.3.5 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 溫度影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，直接影響到菌株的生長速度，因此在培養(yǎng)過程中必須保證穩(wěn)定和合適的溫度。250mL的三角瓶中分別裝100mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，接入5%的種子液分別置于25、28、30、35和40℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，以離心后的粗酶液酶活為指標(biāo)，考察溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖7可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酶活逐漸增大，在28℃時發(fā)酵液酶活達(dá)到最高為30U/mL；溫度高于28℃時，發(fā)酵液酶活逐漸降低。故選擇培養(yǎng)溫度為28℃。

圖7 溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.6 培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 pH是影響微生物發(fā)酵的一個重要因素，不同微生物生長繁殖的最適pH不同。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，接入5%的種子液28℃搖床培養(yǎng)48h，以離心后的粗酶液酶活為指標(biāo)，考察pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖8可知，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基pH為4～7時，菌株S122發(fā)酵液酶活變化幅度不大；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為8.0時，發(fā)酵液酶活最高為32U/mL；pH為9.0時，發(fā)酵液酶活明顯降低。故選擇培養(yǎng)基初始pH為8.0。

圖8 培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.7 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵時間主要影響發(fā)酵過程中酶的產(chǎn)量，發(fā)酵時間過短，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)沒有完全被菌體利用，酶產(chǎn)量較低；發(fā)酵時間過長，菌體會耗盡培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致菌體自溶，pH上升，對酶的產(chǎn)量也有影響。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)至8.0，接入5%的種子液，28℃搖床培養(yǎng)，在不同的發(fā)酵時間測定發(fā)酵液酶活。由圖9可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液酶活逐漸增大，當(dāng)連續(xù)發(fā)酵96h時發(fā)酵液酶活最高為35U/mL。

2.3.8 搖瓶裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 溶解氧的濃度會影響微生物的生長，在培養(yǎng)過程中微生物只能利用溶解在培養(yǎng)基中的溶解氧。如果中斷供氧，菌體就會短時間內(nèi)把培養(yǎng)基中的氧耗盡，所以在發(fā)酵過程中必須不斷地供給空氣，使培養(yǎng)基中的溶解氧保持一定水平，裝液量顯著影響培養(yǎng)基中溶解氧的濃度。在250mL的三角瓶中分別裝30、40、50、60、70mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液，接入5%的種子液，28℃搖床培養(yǎng)96h，以離心后的粗酶液酶活為指標(biāo)，考察裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖10可知，隨著搖瓶裝液量的增加，發(fā)酵液酶活逐漸增大，當(dāng)250mL三角瓶中裝 60mL發(fā)酵培養(yǎng)基時，發(fā)酵液酶活最高為37U/mL。

圖9 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖10 裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.9 不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 接種量影響菌體的生長和形態(tài)。接種量較少，對菌體生物量和酶的合成不利；適中的接種量可以縮短菌體的生長周期，這是由于種子量多，同時種子液中含有大量體外水解酶類，菌種進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后容易適應(yīng)，有利于對基質(zhì)的利用；接種量過大往往使菌體生長過快，培養(yǎng)液粘度增大，造成基質(zhì)缺乏或溶解氧不足。因此，實驗中應(yīng)選擇合適的接種量。在60mL/250mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別接種2%、4%、6%和8%的種子液，28℃搖床培養(yǎng)96h，以離心后的粗酶液酶活為指標(biāo)，考察接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖11可知，當(dāng)接種量為4%時發(fā)酵液酶活最高為50U/mL。

圖11 接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.10 搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在60mL/ 250mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接入4%的種子液，分別在搖床轉(zhuǎn)速0、150、175、200、225r/min條件下28℃培養(yǎng)96h，以離心后的粗酶液酶活為指標(biāo)，考察搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖 12可知，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min時發(fā)酵液酶活最高為59U/mL。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速較低時，酶活較低，可能由于轉(zhuǎn)速較低時不利于菌體與培養(yǎng)基的充分接觸，導(dǎo)致菌體未獲得充足的營養(yǎng)；另一方面轉(zhuǎn)速較低導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧量低，抑制菌體繁殖，從而抑制了酶的分泌。當(dāng)轉(zhuǎn)速高于200r/min時，粗酶液酶活明顯降低，可能由于轉(zhuǎn)速較高時溶液中的剪切力過大，對菌體造成損傷。

圖12 搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

3 討論

國內(nèi)對Geotrichum LK.脂肪酶的研究已有報道，其均從土壤中分離篩選得到，從牦牛乳酥油中分離篩選產(chǎn)脂肪酶微生物的研究目前尚未報道。本研究采用平皿透明圈法對產(chǎn)脂肪酶菌株進(jìn)行大量的篩選，從甘肅天祝牧區(qū)牦牛乳酥油中篩選得到一株產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株S122，經(jīng)形態(tài)學(xué)和26S rDNA序列同源性比對分析鑒定為Geotrichum sp.S122。

對菌株Geotrichum sp.S122發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究表明，其最適的發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分（%）：蔗糖1.0、蛋白胨2.0、硫酸鎂0.1、磷酸氫二鉀1.0、橄欖油乳化液1.0；最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基初始pH8.0，培養(yǎng)溫度28℃，接種量4%，裝液量60mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵周期 96h。王蕾［17］等對 Geotrichum sp.GXU33脂肪酶發(fā)酵條件進(jìn)行研究，優(yōu)化后脂肪酶活力只有10.68U/mL；本研究對 Geotrichum sp.S122脂肪酶發(fā)酵條件初步優(yōu)化后，酶活最高達(dá)59U/mL。

在發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，以葡萄糖為碳源時脂肪酶活力較低，與文獻(xiàn)［18］報道的葡萄糖不利于脂肪酶產(chǎn)生相一致；在培養(yǎng)基組成中，蔗糖對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響最顯著。很多菌株產(chǎn)生的脂肪酶屬于誘導(dǎo)酶，在培養(yǎng)基中添加適量的油脂或金屬鹽可有效促進(jìn)產(chǎn)酶或提高酶活性［19］。本研究中，Mg2+、K+、Zn2+、Fe2+和Mn2+對發(fā)酵產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其中Mg2+的效果更顯著，周海霞［20］等對脂肪酶產(chǎn)生菌假單胞菌研究表明，Mg2+對產(chǎn)酶有良好的促進(jìn)作用，但是Zn2+和Mn2+對產(chǎn)酶有一定的抑制作用，與本研究結(jié)果相反。Geotrichum sp.S122產(chǎn)脂肪酶還需油脂的誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中不含橄欖油時菌體產(chǎn)酶活力較低，但過多的橄欖油會抑制脂肪酶的產(chǎn)生，這可能是因為油脂降解后的脂肪酸有阻遏抑制產(chǎn)脂肪酶的作用。

本研究對從天祝牧區(qū)牦牛乳酥油篩選出的產(chǎn)脂肪酶菌株 Geotrichum sp.S122目前只做了初步的研究，在后續(xù)的研究中將對菌株Geotrichum sp.S122進(jìn)行誘變處理并對其產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，以進(jìn)一步提高其發(fā)酵酶活力。

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Screening lipase－producing microorganisms from yak butter of Tianzhu pasturing area and study on its fermentation conditions

SUN Guo－zheng1，2，GAN Bo－zhong1，2，3，*，ZHANG Wei－bing1，2，LI Xiao－peng1，2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Analysis and Research Center of Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；3.Gansu Casein Engineering Technical Research Center，Lanzhou 730000，China）

Lipase－producing microorganisms were isolated from yak butter in the Tianzhu pasturing area of Gansu province.The high lipase－producing strain S122 was isolated by secondary screening.It was identified as Geotrichum sp.S122 through the morphological feature observation and 26S rDNA sequence analysis.The fermentation conditions of the lipase－production strain were optimized and fermentation techniques on the lipase production were studied.The results showed that the optimal medium composition for lipase production was as follows（%）：sucrose 1.0，peptone 2.0，MgSO40.1，K2HPO41.0，olive oil 1.0.The optimal fermentation conditions were as follows：the initiation pH 8.0 for the culture medium，the optimal culture temperature 28℃，inoculation volume 4%，rotation speed 200r/min，culture medium 60mL/250mL（v/v）and the culture time 96h.After optimization，the lipase activity was 59U/mL.

yak butter；lipase；isolation and screening；conditions for lipase production

TS201.1

A

1002－0306（2010）12－0195－05

2009－12－11 *通訊聯(lián)系人

孫國政（1982－），男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物與酶工程。

甘肅省科技重大專項（0702NKDA034）。