姜紹通，孫 磊，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院農(nóng)產(chǎn)品分離工程研究所，安徽 合肥 230009)

復合防腐劑對腌制蔬菜中腐敗細菌的抑制效果研究

姜紹通，孫 磊，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院農(nóng)產(chǎn)品分離工程研究所，安徽 合肥 230009)

對腌制蔬菜中的腐敗菌進行分離與鑒定，結果表明：腌制蔬菜中腐敗菌主要為6株細菌，其中4株球菌，1株鏈桿菌，1株桿菌，都為革蘭氏陽性菌。對腐敗菌的抑菌劑進行篩選與優(yōu)化，結果表明：Nisin、脫氫醋酸鈉、尼泊金復合酯鈉對腐敗菌有明顯的抑制作用。正交試驗優(yōu)化得到復合防腐劑最佳配方為：Nisin 0.4g/L、脫氫醋酸鈉0.3g/L、尼泊金復合酯鈉0.2g/L。在該復配條件下對于實驗中分離得到的6種腐敗菌及食品中常見的腐敗菌(金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)都有良好的抑制效果，抑制率都在96%以上。

腌制蔬菜；復合防腐劑；抑菌

我國腌制菜起源于周朝，距今約有3000年歷史[1]，是我國傳統(tǒng)佐餐食品，袋裝產(chǎn)品是其市場銷售的主要形式。為保證貨架期，生產(chǎn)過程通常采用高溫滅菌結合添加苯甲酸鹽等防腐劑進行。其過程往往導致腌制蔬菜脆度下降、色澤變暗，且風味變差。所以研究非熱殺菌和高效安全的腌制菜防腐劑備受人們關注。王敏等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)高鹽醬腌菜坯致腐微生物主要為堅強芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。陳建初等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)雖然熱力殺菌對袋裝榨菜有一定的防腐效果，但是添加一定的防腐劑是必要的。

新型高效的防腐劑的開發(fā)現(xiàn)今尤為重要，其中一些具有安全并且有廣泛應用前景的防腐劑也廣受人們的關注。Nisin作為一種新型的生物防腐劑具有安全、無毒的特性，但是抑菌譜較窄，其能抑制大部分G+菌及其芽孢的生長和繁殖，但對G－菌抑制效果不明顯[4]。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，具有高效抑菌能力，良好的成膜性，并且天然、無毒、無害，在食品的防腐保鮮方面有著較高的應用價值[5]。脫氫醋酸鈉、尼泊金復合酯是高效、廣譜、安全的防腐劑，其對真菌、細菌都有一定的抑制效果[6-7]。

本實驗即通過對上述各種防腐劑成分及質量濃度的復合研究，旨在得到一種高效的復合防腐劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌制蔬菜 安徽露仙調味食品有限公司；Nisin 浙江銀象生物工程有限公司；尼泊金復合酯鈉、脫氫醋酸鈉 廣州市安心生物制品有限公司；殼聚糖 青島海普生物技術有限公司；富馬酸鈉 鄭州瑞普生物工程有限公司。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院微生物實驗室；腐敗菌從腐敗的腌制蔬菜中分離。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，加入20g/L瓊脂為固體培養(yǎng)基(用于菌種分離)。

1.2 儀器與設備

SWCJCO雙面無菌操作臺 江蘇凈化設備有限公司；UV-1201紫外-可見光分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；250D數(shù)顯光照培養(yǎng)箱 江蘇金壇市正基儀器有限公司。

1.3 菌種的分離純化與鑒定

菌種的分離方法參考文獻[8]進行。菌種的初步鑒定參考文獻[9]進行。

1.4 單一防腐劑對腌制蔬菜中腐敗菌抑制作用研究

將Nisin、脫氫醋酸鈉、尼泊金復合酯鈉(尼泊金乙酯鈉:尼泊金丙酯鈉=1:1)、脫氫醋酸鈉、殼聚糖按照國標最大添加量稀釋成不同的質量濃度，添加到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別接種對數(shù)期生長的腐敗菌1mL，培養(yǎng)12h，測定腐敗菌的生長情況。

1.5 復配防腐劑對腌制蔬菜中腐敗菌的抑制作用研究

在單因素試驗的基礎上，選擇對于致腐菌有一定抑制作用的防腐劑質量濃度進行復合，進行正交試驗。正交試驗選用正交表L9(34)。因素及水平如表1所示。

表1 復合防腐劑優(yōu)化的正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimizing compound preservative

1.6 應用實驗

將優(yōu)化后的復合防腐劑配方，按照實驗的質量濃度加入腌制蔬菜中，包裝，85℃殺菌。以不加入防腐劑的腌制蔬菜為對照，將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d測定其細菌總數(shù)，細菌總數(shù)測定：按照GB4789.2—1994《食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》進行。具體實驗步驟按照文獻[10]進行。

1.7 分析方法

腐敗菌生長的測定：比濁法，測定OD600nm值。用腐敗菌的抑制率評價防腐劑的抑制效果。腐敗菌的菌落數(shù)用標準曲線法[11]計算。

2 結果與分析

2.1 腌制蔬菜中腐敗菌的分離與初步鑒定

取腐敗的腌制蔬菜25g，無菌剪碎，于225g無菌水中用力振蕩攪拌。稀釋成不同倍數(shù)的溶液，于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)24h后計數(shù)。其中腐敗菌分離和初步鑒定結果如表2所示。

表2 腌制蔬菜中腐敗菌的分離及初步鑒定結果Table 2 Separation and preliminary identification of spoilage bacteria in pickled vegetables

2.2 單一防腐劑對腌制蔬菜中腐敗菌的抑制效果

2.2.1 Nisin對于腐敗菌的抑制效果

圖1 不同質量濃度Nisin對腐敗菌的抑制效果Fig.1 Suppression effect of Nisin at various concentrations on spoilage bacteria

由圖1可知，Nisin對1號、5號、6號菌有很好的抑制效果，當其質量濃度達到0.15g/L時，對這3種致腐菌的抑制率分別達到了70.59%、69.88%、91.83%，但是對于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，當Nisin質量濃度達到最大即0.5g/L時，其抑制率分別達到95.86%、86.20%。

2.2.2 脫氫醋酸鈉對腐敗菌的抑制效果

由圖2可知，脫氫醋酸鈉對所進行實驗的5種腐敗菌都有較好的效果，其中對于1號菌和6號菌，在脫氫醋酸鈉質量濃度為0.2g/L時，抑制率就分別達到了95.57%和66.19%，對于5號菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，隨著脫氫醋酸鈉質量濃度的增大，抑菌效果迅速增強。當防腐劑質量濃度達到0.4g/L時，可以較強的抑制除金黃色葡萄球菌外的腐敗菌。

圖2 不同質量濃度脫氫醋酸鈉對腐敗菌的抑制效果Fig.2 Suppression effect of sodium dehydroacetate at various concentrations on spoilage bacteria

2.2.3 富馬酸鈉對于腐敗菌的抑制效果

圖3 不同質量濃度富馬酸鈉對腐敗菌的抑制效果Fig.3 Suppression effect of sodium fumarate at various concentrations on spoilage bacteria

由圖3可知，隨著富馬酸鈉質量濃度的增大，對腐敗菌的抑制效果逐漸增強，對1號及5號腐敗菌的抑制效果較好，當質量濃度達到0.3g/L及以上時，基本可以完全抑制這兩種菌。但是對于6號菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌，當其質量濃度達到最大，即質量濃度達到0.4g/L時，對金黃色葡萄球菌的抑制率僅有31.14%，對枯草芽孢桿菌的抑制率也僅有26.14%。

2.2.4 殼聚糖對于腐敗菌的抑制效果

圖4 不同質量濃度殼聚糖對腐敗菌的抑制效果Fig.4 Suppression effect of chitosan at various concentrations on spoilage bacteria

殼聚糖對腐敗菌的抑制效果如圖4所示，殼聚糖由于其絮凝作用，在添加到液體培養(yǎng)基時，抑制效果比較明顯，但是從實驗過程可以看出，由于其會使液體培養(yǎng)基中菌體沉降，用于實際生產(chǎn)時，會影響產(chǎn)品的風味，所以沒有考慮將殼聚糖作為復合防腐劑的成分。

2.2.5 尼泊金復合酯鈉對于腐敗菌的抑制效果

圖5 不同質量濃度尼泊金復合酯鈉對腐敗菌的抑制效果Fig.5 Suppression effect of Nipagin composite sulfate at various concentrations on spoilage bacteria

尼泊金復合酯鈉對腐敗菌的抑制效果如圖5所示，其對于1號菌有比較好的抑制效果，當質量濃度達到0.2g/L時，抑制率達到了89.63%，對于6號菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌，在尼泊金復合酯鈉最大質量濃度下才對其有明顯的抑制效果，抑制率分別達到了61.10%、51.13%、57.62%。

綜上所述，脫氫醋酸鈉對實驗的5種致腐菌均有良好的抑制作用，Nisin 對于1號、5號、6號菌具有良好的抑制效果，對于金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌隨著添加質量濃度的提高，抑制效果增強比較明顯，尼泊金復合酯鈉對于所篩得的致腐菌有一定的抑制作用，但其與其他防腐劑復合會有較好的抑菌效果。

所以選擇脫氫醋酸鈉、Nisin、尼泊金復合酯鈉作為下一步復合防腐劑的成分。

2.3 復合防腐劑最佳配方對于抗性較強菌種的正交試驗結果

由實驗過程中發(fā)現(xiàn)，6號菌，金黃色葡萄球菌是對于防腐劑抗性較強的菌種，所以以下選用這兩種菌的抑制率作為正交試驗的評價標準。并且對正交試驗的結果進行方差分析，結果見表3、4。

通過正交試驗設計及方差分析結果，可以得出各因素對金黃色葡萄球菌抑制效果的顯著水平：Nisin質量濃度對金黃色葡萄球菌抑制效果影響極為顯著，脫氫醋酸鈉及尼泊金復合酯鈉質量濃度對金黃色葡萄球菌抑制效果不顯著。因素主次順序為ACB，直觀分析和計算最佳水平組合均為A3C2B2即添加復合防腐劑Nisin質量濃度0.4g/L，脫氫醋酸鈉質量濃度0.25g/L，尼泊金復合酯質量濃度0.2g/L時對金黃色葡萄球菌抑制效果最好，抑制率達到了99.83%。同時可以得出因素對6號菌的抑制效果的顯著水平，Nisin質量濃度高度顯著，脫氫醋酸鈉質量濃度影響顯著，尼泊金復合酯鈉質量濃度影響不顯著。因素主次順序為ABC，計算分析最佳水平組合為A3B3C2。即Nisin質量濃度為0.4g/L，脫氫醋酸鈉質量濃度為0.3g/L，尼泊金復合酯鈉質量濃度為0.2g/L，此時，6號菌抑制率可以達到99.94%。

表4 正交試驗結果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experimental results

表3 正交試驗結果極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experimental results

綜合上述分析，根據(jù)因素相對于每個實驗菌種的實驗結果的顯著性不同，考慮成本、效果，復合防腐劑配方應為A3B3C2。即Nisin質量濃度為0.4g/L，脫氫醋酸鈉質量濃度為0.3g/L，尼泊金復合酯鈉質量濃度為0.2g/L。

2.4 驗證實驗

將優(yōu)化后得到的復合防腐劑添加到腐敗菌中，得到其對1號菌抑制抑制率達到99.57%，2號菌抑制率得到99.22%，3號菌抑制率達到99.87%，4號菌達到98.79%，5號菌達到99.84%，6號菌達到99.79%，金黃色葡萄球菌抑制率達到98.42%，枯草芽孢桿菌抑制率達到96.09%。

2.5 應用實驗

按照復合防腐劑配方，將防腐劑加入到調配腌制蔬菜的料液中，調配，包裝后于85℃下殺菌15min，于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)16d，每2d測定細菌總數(shù)。其結果如圖6所示。

圖6 復合防腐劑處理前后腌制蔬菜中細菌總數(shù)變化趨勢Fig.6 Change trends of total bacterial number in pickled vegetables treated by compound preservatives

由圖6可以看出，空白組在儲藏期間第8天～第10天，其細菌總數(shù)大于3×103CFU/g，已經(jīng)腐敗。但是當添加復合防腐劑時，腌制蔬菜的細菌總數(shù)在實驗的16d內，一直處于140CFU/g以下。對比空白組，有很高的保鮮程度，說明復合防腐劑對于腌制蔬菜有很好的保鮮效果。

3 結 論

3.1 在腐敗的腌制蔬菜中，其致腐菌有6種細菌，其中有4種球菌、1種鏈桿菌、1種桿菌。經(jīng)革蘭氏染色后全為陽性。

3.2 經(jīng)過單因素及正交試驗結果分析，得出在復合防腐劑(Nisin質量濃度為0.4g/L，脫氫醋酸鈉質量濃度為0.3g/L，尼泊金復合酯鈉質量濃度為0.2g/L)作用下，對于所進行實驗的食品中致腐菌的抑制率都達到了96%以上。

3.3 將所篩選的復合防腐劑添加到腌制蔬菜中，在37℃下培養(yǎng)16d，其仍然具有較好的保鮮程度，可以起到延長貨架期的目的。

[1] 周濤. 蔬菜腌制品的種類及腌制原理和保藏措施[J]. 中國調味品,2000, 255(5): 6-12.

[2] 王敏, 張耀相, 肖翔. 高鹽醬腌菜坯致腐微生物的分離鑒定[J]. 中國調味品, 2003(5): 19-20.

[3] 陳健初, 葉興乾, 吳丹. 真空軟包裝榨菜和蘿卜熱力殺菌工藝研究[J]. 食品工業(yè), 2008(6): 11-13.

[4] REUNANEN J, SAIRS P E J. Bioassay for nisin in sausage; a shelf life study of nisin in cooked sausage[J]. Meat Science, 2004, 66(3): 515-518.

[5] 王鴻, 沈月新. 不同脫乙酰度殼聚糖的抑菌性[J]. 上海水產(chǎn)大學學報, 2001, 10(4): 380-382.

[6] 黎婉園, 姚朔影, 夏楓耿. 脫氫醋酸鈉及其抗菌性試驗[J]. 中國食品添加劑, 2004(2): 41-44.

[7] 李永飛, 沈良, 齊艷. 尼泊金復合酯在醬菜生產(chǎn)中的應用[J].中國釀造, 2004, 133(4): 19-20.

[8] 潘麗軍, 劉蘭花, 曾敏. Nisin和植酸復合抑制腌制蔬菜中G－腐敗菌的效果研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(2): 263-268.

[9] 錢存柔, 黃儀秀. 微生物實驗教程[M]. 北京: 北京大學出版社, 2003.

[10] 易建華, 朱振寶. 不同工藝條件對醬腌菜保藏品質的影響[J]. 食品科技, 2008(9): 43-47.

[11] 王向陽, 周蓉, 劉繪景. 真空包裝腌制蘿卜干中致病菌的抑制[J]. 中國調味品, 2008, 355(9): 56-60.

Suppression Effect of Compound Preservative on Spoilage Bacteria in Pickled Vegetables

JIANG Shao-tong，SUN Lei，LUO Shui-zhong，PAN Li-jun
(Institute of Agricultural Products Separation Engineering, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Separation and identification of spoilage bacteria from pickled vegetables indicated that there were six dominant Grampositive bacteria including four strains of coccus, one strain of streptobacillus and one strain of bacillus. Meanwhile, the screening and optimization of bacteriostatic agents on spoilage bacteria were conducted. An obvious suppression effect of Nisin,sodium dehydroacetate or sodium Nipagin on spoilage bacteria was observed. Moreover, a compound preservative was optimized to be 0.4 g/L Nisin, 0.3 g/L sodium dehydroacetate and 0.2 g/L sodium Nipagin ester through orthogonal test. This compound preservative exhibited an excellent suppression effect on six strains of bacteria separated from pickled vegetables and common spoilage bacteria such as Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis in food. The suppression rate could reach up to 96%.

pickled vegetable；compound preservative；bacteriostasis

TS255.36

A

1002-6630(2010)09-0054-05

2009-09-02

安徽省農(nóng)業(yè)科學研究基金項目(08152317)

姜紹通(1954—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品生物化工。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn