宋宏新，鄒聯(lián)柱，馬 冬，薛海燕

(1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.華北煤炭醫(yī)學院，河北 唐山 063000)

PCR檢測牛乳中大腸桿菌基因組DNA的提取方法

宋宏新1，鄒聯(lián)柱1，馬 冬2，薛海燕1

(1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.華北煤炭醫(yī)學院，河北 唐山 063000)

為獲得一種適于牛乳樣品大腸桿菌PCR檢測的基因組DNA提取方法，對飽和酚法、CTAB法、試劑盒法及溶劑裂解法等4種提取方法加以比較，通過考察DNA的純度、定量分析以及PCR分析，確定一套有效、快速、適合牛乳中提取大腸桿菌的基因組DNA方法——溶劑熱裂解法。結(jié)果顯示該方法提取的DNA模板，適于PCR擴增大腸桿菌DNA，可以用于牛乳中的大腸桿菌檢測。

乳品；大腸桿菌；基因組總DNA；聚合酶鏈式反應

伴隨著近幾年人們對食品中微生物污染與危害的公共意識提高，快速、靈敏和可靠的檢測食源性病原微生物方法發(fā)展迅速，基于核酸分析的PCR方法成為確定和檢測食品中微生物，甚至死菌的可靠方法[1-3]。但是，直接檢測乳品樣品中細菌通常容易受到來自富集培養(yǎng)基、DNA分離劑、食品基質(zhì)本身和其他非目標微生物等PCR抑制因子的影響[4-6]。因此研究從乳品中高效提取DNA的方法，消除 PCR反應抑制因子，對利用PCR直接檢測食品中的致病菌[7-9]具有重要意義。本研究擬比較4種常用大腸桿菌基因組DNA提取方法在乳品PCR檢測中的應用，為PCR直接檢測乳中大腸桿菌及其他病原菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

非致病性大腸桿菌ATCC 25922菌株 中國醫(yī)學科學院菌種保藏中心；液態(tài)牛乳樣品 市購。

蛋白酶K、DNA Marker DL2000 北京天根生物有限公司；PCR buffer、dNTPs、Taq酶 大連寶生物科技有限公司；L B培養(yǎng)基試劑、酚、氯仿、異丙醇、無水乙醇、石油醚和氨水均為國產(chǎn)分析純。

PCR儀 美國MJ公司；水平電泳槽 北京六一儀器廠；JD-801凝膠成像系統(tǒng) 南京捷達科技公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及牛乳樣品制備

將大腸桿菌ATCC 25922菌種經(jīng)二次斜面活化再挑取單菌落，在LB液體培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)(37℃、100r/min)，經(jīng)平板菌落計數(shù)后4℃冰箱保藏；牛乳樣品經(jīng)巴氏滅菌后按國標法檢測證實無大腸桿菌，每份取1mL滅菌乳，接種10μL LB培養(yǎng)基(平板法測得大腸桿菌數(shù)為108CFU)，分別采用4種方法提取大腸桿菌DNA。

1.2.2 提取方法

將人工污染乳樣室溫下1200×g離心10min，棄上清液，沉淀4℃保存。

1.2.2.1 酚/氯仿抽提法[5]

①取1mL人工污染乳樣于Eppedorf管中，4000r/min室溫離心10min，去上清液；②取500μL STE溶液懸浮細胞，加入20% SDS 100μL，37℃條件下輕搖過夜，使細胞裂解；③加入等體積的飽和酚混合均勻，放置5min后3500r/min離心10min；④去上相，加入等體積的酚/氯仿，如步驟③離心；⑤取上相，加入等體積的氯仿，如步驟④；⑥取上相轉(zhuǎn)入干凈的Eppendorf管中，加入2倍體積的冷乙醇，－20℃放置10min，4℃、12000r/min離心10min，棄上清液；⑦用70%乙醇洗一次，4℃、12000r/min離心10min，棄乙醇，室溫倒置10min，用50μL水或TE溶液溶解DNA。

1.2.2.2 CTAB法[6]

①加入567μL的TE緩沖液懸浮，加入30μL質(zhì)量濃度100g/L SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K，混勻，37℃、1h；②加入100μL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μL CTAB/NaCl(質(zhì)量濃度50g/L CTAB，0.5mol/L NaCl)混勻，65℃溫浴10min；③加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(質(zhì)量比為25:24:1)抽提；④加入0.6倍體積的異戊醇混勻，沉淀DNA，離心沉淀用70%(V/V)乙醇洗2次，再用TE溶解沉淀，4℃?zhèn)溆没颍?0℃保存。1.2.2.3 UNIQ-10株式細菌基因組DNA抽提試劑盒

①取1mL人工污染乳10000×g室溫離心1min，棄上清液；②沉淀加入含溶菌酶的TE 200μL， Digestion Buffer 400μL，蛋白酶K 3μL，混勻55℃保溫5min；③加入260μL無水乙醇混勻，然后將樣品全部轉(zhuǎn)移到套放于2mL收集管的UNIQ-10柱中，室溫8000×g離心1min；④棄去收集管中廢液，向柱中加入500μL Wash Solution，室溫10000×g離心30s，重復步驟④一次，棄去收集管中的全部廢液，10000×g室溫離心1min，去除殘留Wash Solution；⑤將柱放入潔凈Eppedorf管中，加入50μL Elution Buffer，室溫2min，10000×g離心1min，離心管中的液體即為基因組DNA，根據(jù)用途樣品可以4℃或－20℃保存。

1.2.2.4 溶劑提取熱裂解法[7]

①1mL人工污染樣品加入0.2mL無水乙醇、0.2mL氨水和0.2mL石油醚混勻后12000×g離心10min；②沉淀用300μL 10mmol/L TE(pH7.8)溶解后，加入5μL 10mg/mL溶菌酶，37℃水浴振蕩1h。然后加入10% SDS 50μL煮沸5min；③加入等體積的氯仿充分振蕩，13000×g離心10min，上清液用0.1倍體積 2.5mol/L乙酸銨(pH5.4)和2.5倍體積預冷無水乙醇沉淀DNA，13000×g離心20min，DNA沉淀干燥后用100μL滅菌超純水溶解，4℃貯藏備用。

1.2.3 PCR反應

用以上不同方法所提取的DNA作為模板，進行PCR反應，用以驗證上述方法是否可有效從乳品中提取大腸桿菌DNA，PCR反應使用的引物、反應條件及應用檢測參見文獻[8]。

PCR采用25μL體系(2.5μL 10×PCR buffer、2.5μL dNTPs、0.2μL 2.5U/μL Taq酶，引物 alr-1和引物alr-2各2μL 4umol/L，5μL模板DNA)，94℃變性2min后進入PCR循環(huán)：94℃、30s，66℃、1min，72℃、1min，25個循環(huán)，72℃充分延伸補足5min。PCR以LB培養(yǎng)基中大腸桿菌ATCC 25922為陽性對照，以牛乳樣作為陰性空白對照，PCR產(chǎn)物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，進行比較，實驗電泳結(jié)果僅顯示了陽性及陰性對照的溶劑裂解法樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA定性和定量分析

圖1 4種方法從牛乳中提取基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA in milk extracted by four methods

表1 不同方法得到的DNA含量和純度Table 1 Contents and purities of genomic DNA extracted by four methods

圖1為基因組DNA瓊脂糖電泳圖譜，表1為基因組DNA含量和純度。從圖1明顯可以看出，在起始菌量相同的情況下，不同方法提取基因組DNA的效果存在明顯差異，1、2、3帶的亮度比4強，但是3帶卻在點樣槽，說明在提取的過程中沒有充分除掉蛋白，以致其與DNA結(jié)合從而影響在凝膠中的泳動，而且亮度與含量成比例關(guān)系，所以可以認為溶劑提取熱裂解法的提取效果與試劑盒法最接近。

從表1可以看出，無論從DNA提取的量還是純度(OD260/280閾值在1.8～2.0之間)，試劑盒法和溶劑裂解法均可提供足量可靠的PCR模板。

2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

將提取的DNA進行丙氨酸消旋酶基因擴增，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取方法擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results using genomic DNA extracted by different methods

電泳結(jié)果表明，1、2條帶最亮，說明利用溶劑裂解法和試劑盒方法均能有效提取大腸桿菌基因組DNA，適合作檢測乳品中大腸桿菌基因擴增的模板。

3 討 論

影響PCR產(chǎn)量主要發(fā)生在3個操作階段：分離和濃縮目標菌；模板DNA的提取效率；PCR反應條件[9]。本實驗主要通過對乳樣簡單的離心濃縮大腸桿菌，重點研究采用不同方法提取大腸桿菌基因組DNA，有效除去PCR抑制因子及雜蛋白，最后進行PCR擴增反應及分析。

通過比較，酚/氯仿抽提法和CTAB法，需要過夜消化，全過程接近一整天，嚴重影響實驗進度和效率，加入溶菌酶及蛋白酶K會增加檢測試驗成本，且需要多次酚、氯仿抽提轉(zhuǎn)相，除去牛乳中雜蛋白，實驗時間長，造成NDA提取率降低，可以造成DNA降解現(xiàn)象。試劑盒的應用在價格上相對昂貴，對于大量的實驗來說大大增加了實驗整體成本。因此，本實驗選取上述的幾種方法并從其中挑選出一套適合于在牛乳樣品中提取DNA的方法——溶劑裂解法，其主要優(yōu)點在于：提取的全過程大約在2h左右，節(jié)省時間；提取的基因組DNA純度高、數(shù)量多，成本遠比試劑盒少；同時此方法不使用CATB、溶菌酶、蛋白酶K等生物試劑，降低了實驗成本，有利于實驗的推廣。通過溶劑裂解法提取的大腸桿菌基因組DNA，在應用PCR檢測乳品中大腸桿菌中提供足量、可信的模板，從而完成E.coli在牛乳衛(wèi)生安全上的檢測研究。

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Extraction Methods of PCR-detectable Escherichia coli Genomic DNA in Milk

SONG Hong-xin1，ZOU Lian-zhu1，MA Dong2，XUE Hai-yan1
(1. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China ；2. North China Coal Medical University, Tangshan 063000, China)

In order to obtain an appropriate sample for PCR detection, four extraction methods including saturated phenol method, CTAB method, kit method and solvent pyrolysis method for E. coli genomic DNA in milk samples were compared.Through evaluating the purity, quantitative analysis and PCR analysis of genomic DNA extracted by four methods, an effective and fast solvent-thermal pyrolysis method was suitable for the extraction of E. coli genomic DNA in milk. The genomic DNA extracted by this method used as the template is suitable for PCR amplification of E. coli DNA, which can be used for the detection of E. coli in milk.

dairy products；Escherichia coli；total genomic DNA；PCR

TS252.1

A

1002-6630(2010)24-0308-03

2010-07-23

陜西省科學技術(shù)廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2009K02-09)；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目(09JC19)

宋宏新(1959—)，男，教授，主要從事生物化學與分子生物學、食品科學研究。E-mail：hongxinsong@163.com