孔曉雪，安辛欣*，趙立艷，胡秋輝

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

金針菇水溶性多糖物理提取工藝及優(yōu)化

孔曉雪，安辛欣*，趙立艷，胡秋輝

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

對比研究濕法超微粉碎提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取等不同提取方法，對金針菇可溶性多糖提取效果的影響，采用響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計法優(yōu)化濕法超微粉碎提取金針菇水溶性多糖的工藝條件。結(jié)果表明，濕法超微粉碎提取法能顯著提高金針菇水溶性多糖的提取率，優(yōu)化后的工藝參數(shù)為膠體磨磨齒間隙42μm、提取溫度87℃、提取時間170min。根據(jù)模型預(yù)測提取液中多糖含量為417.6μg/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中多糖含量為(418±3.21)μg/mL，提取率為3.63%。

金針菇；水溶性多糖；濕法超微粉碎；響應(yīng)曲面

金針菇(Flammunlina velutipes)為擔(dān)子菌目金錢菌屬，是一種藥食兩用菌，其子實(shí)體含蛋白31.2%，含有豐富的維生素(VB1、VB2、VC、Vpp)和多種氨基酸[1-2]。金針菇多糖是金針菇中主要的生物活性成分之一，具有抑制腫瘤、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[3-5]。

金針菇多糖的提取方法大致分為3類：水提醇沉法、酶解法、物理提取法。水提醇沉法操作簡便但提取率不高，已報道的提取率(以金針菇干質(zhì)量計)在1.6%左右[6-7]。酶解法中使用較多的是纖維素酶，該法提取率在2%左右[8]。物理提取法主要是指通過微波、超聲波、超微粉碎等物理手段輔助提取多糖，該法能有效提高金針菇多糖提取率，研究發(fā)現(xiàn)微波可使多糖提取率提高83.67%[9-11]，超聲波可使多糖提取率提高76.22%[9]。

本實(shí)驗(yàn)研究微波、超聲波、濕法超微粉碎(膠體磨處理)輔助提取對金針菇多糖的工藝，并通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計對濕法超微粉碎提取金針菇多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期能夠提高金針菇多糖提取率，從而為金針菇多糖的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金針菇白色品系F21，購于高淳金針菇種植基地，無開傘，平均含水量為85%。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)、Sevag試劑(體積比5:1的氯仿正丁醇混合溶液)、硫酸、蒽酮、無水乙醇等均為分析純。

表1 對照實(shí)驗(yàn)操作步驟Table 1 Operation procedures of different extraction metods

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；SANLEWZD1S型微波設(shè)備 南京三樂微波設(shè)備有限公司；AS 20500A超聲儀 瑞士Buchi公司；L50試驗(yàn)室專用膠體磨 上海諾尼機(jī)械廠；HH-42數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海第三儀器廠；AUY120電子分析天平 日本島津公司；植物組織破碎機(jī) 臺灣聯(lián)中電器廠；Avanti J-E落地式高效冷凍離心機(jī) 美國 Beckman Coulter 公司。

1.2 方法

1.2.1 金針菇多糖提取方法篩選

準(zhǔn)確稱取18份金針菇，每份100.00g，分為6組依次編號為1、2、3、4、5、6，操作步驟如表1所示。通過對比實(shí)驗(yàn)選擇適宜的提取方法，并對該方法進(jìn)行單因素與響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.2 濕法超微粉碎提取金針菇多糖工藝的單因素優(yōu)化

以提取液中多糖含量為指標(biāo)，對金針菇多糖的濕法超微粉碎提取工藝的5個單因素(提取次數(shù)、料液比、膠體磨磨齒間隙、提取溫度和提取時間)進(jìn)行優(yōu)化。

提取次數(shù)的影響：準(zhǔn)確稱取數(shù)份100.00g新鮮金針菇，按1次提取料液比1:15，2次提取料液比1:10，3次提取料液比1:5進(jìn)行濕法超微粉碎提取(其余提取條件與表1中2組相同)，提取液濃縮為1500mL后測定多糖含量。

料液比的影響：按料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，進(jìn)行濕法超微粉碎，提取液濃縮或稀釋為1500mL后測定提取液中多糖含量。

膠體磨磨齒間隙的影響[12]：調(diào)節(jié)膠體磨磨齒間隙依次為20、40、60、80、100μm，將金針菇漿液在膠體磨中膠磨，得到金針菇超微粉碎漿按表1中2組的步驟提取，并測定提取液中多糖含量。

提取時間的影響：金針菇超微粉碎漿，在80℃提取30、60、90、120、180min(其余提取條件與表1中2組相同)，測提取液中多糖含量。

提取溫度的影響：金針菇超微粉碎漿，在20、40、60、80、100℃范圍內(nèi)提取90min(其余提取條件與表1中2組相同)，測提取液中多糖含量。

1.2.3 提取液中多糖含量的測定

采用硫酸-蒽酮法[13]進(jìn)行測定。

1.2.4 多糖提取率的計算

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計

根據(jù)濕法超微粉碎提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇磨齒間隙、提取溫度、提取時間3個因素為研究對象，以提取液中多糖含量為響應(yīng)值設(shè)計Box-Behnken試驗(yàn)，對濕法超微粉碎提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計試驗(yàn)因素水平和編碼Table 2 Factors, levels and codes of Box-Behnken response surface experiments

1.2.6 回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照Design Expert 7.0給出的最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，計算實(shí)驗(yàn)值與理論值之間的誤差。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SAS 8.12進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及多重檢驗(yàn)(P＜0.05)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。響應(yīng)曲面優(yōu)化及數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 7.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：

式中：y為吸光度；x為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度/(μg/mL)。

2.2 金針菇多糖提取

表3 不同提取方式提取效果比較Table 3 Comparison of extraction rates using different extraction methods

如表3所示，超聲波、微波輔助提取能顯著提高提取液中多糖含量(P＜0.05)；濕法超微粉碎提取、濕法超微粉碎與超聲波結(jié)合輔助提取、濕法超微粉碎與微波結(jié)合輔助提取，能極顯著的提高提取液中多糖含量(P＜0.01)，其中濕法超微粉碎與超聲波結(jié)合輔助提取法，提取液中多糖含量最高，較熱水提取工藝提高83%，但與濕法超微粉碎處理組相比提取液中多糖含量沒有顯著差異，為了簡化工藝，本實(shí)驗(yàn)中金針菇水溶性多糖的提取采用濕法超微粉碎提取法。

2.3 濕法超微粉碎提取法單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取次數(shù)對多糖含量的影響

圖1 提取次數(shù)對多糖含量的影響Fig.1 Effect of extraction repeat number on the content of polysaccharides

如圖1所示，隨提取次數(shù)增加，多糖提取率逐漸增加，其中1次提取與2次提取相比，多糖提取率增加顯著；兩次提取與3次提取相比，多糖提取率增加不顯著，從工藝耗時和經(jīng)濟(jì)方面考慮，提取次數(shù)選擇2次。

2.3.2 料液比對多糖含量的影響

圖2 料液比對多糖含量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the content of polysaccharides

如圖2所示，隨料液比比值減小多糖提取率逐漸升高，當(dāng)料液比比值小于1:15時，提取液中多糖含量上升趨勢減緩，結(jié)果表明金針菇多糖濕法超微粉碎提取適宜的料液比為1:15。

2.3.3 膠體磨磨齒間隙對多糖含量的影響

圖3 膠體磨磨齒間隙對多糖含量的影響Fig.3 Effect of colloid mill gap on the content of polysaccharides

如圖3所示，隨膠體磨磨齒間隙的增加，多糖提取率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)磨齒間隙為40μm時，提取液中多糖含量最高，達(dá)384μg/mL。磨齒間隙越小，金針菇粉碎的粒徑越小，細(xì)胞壁破壁率越高，多糖越容易溶出，可以很快溶解到提取溶劑中；但如果粒子粒徑繼續(xù)減小，顆粒表面能會增加，將對一部分多糖產(chǎn)生吸附作用，反而使溶劑中多糖含量下降[12,14]，適宜的磨齒間隙選為40μm。

2.3.4 提取時間對多糖含量的影響

圖4 提取時間對多糖含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the content of polysaccharides

如圖4所示，隨著提取時間的延長，提取液中多糖含量迅速增加，當(dāng)提取時間超過150min后，提取液中多糖含量有所下降，這可能是因?yàn)殚L時間的高溫處理使提取液中的一部分多糖分子發(fā)生了降解[13,15]，適宜的提取時間為150min。

2.3.5 提取溫度對多糖含量的影響

圖5 提取溫度對多糖含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the content of polysaccharides

如圖5所示，隨著提取溫度的升高，提取液中多糖含量迅速增加，當(dāng)溫度超過80℃以后，多糖含量上升趨勢減緩。這主要是由于隨溫度的升高分子活動加劇，可溶物溶出速率提高，但溫度超過80℃后，繼續(xù)升高溫度也不能使提取液中多糖含量繼續(xù)上升，適宜的提取溫度為80℃。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計

2.4.1 擬合模型的建立

對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得二元多次回歸方程：

2.4.2 擬合方程方差分析

表4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments

響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果見表4，對模型的方差分析結(jié)果見表5。分析結(jié)果表明，對金針菇多糖得率所建立的二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性(P＜0.0001)，方程負(fù)相關(guān)系數(shù)的平方(R2)為0.9961，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1853)，R2Adj=0.9911，說明建立的模型能夠解釋99.11%響應(yīng)值的變化，能很好的描述金針菇多糖濕法超微粉碎提取過程中多糖提取率隨提取條件的變化規(guī)律，可以用此模型對多糖的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測[16-17]。

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

模型方程回歸系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，模型一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2，交互項(xiàng)AB、AC、BC對響應(yīng)值的影響都極顯著。

2.4.3 交互作用分析

由二次多項(xiàng)式方程所作的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖5～7，各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響可以通過該組圖直觀反映出來。等高線的形狀反映了交互作用的強(qiáng)弱，等高線圖越接近圓形表明交互作用越不顯著[18]。

2.4.3.1 磨齒間隙與提取溫度的交互作用

圖5 膠體磨磨齒間隙與提取溫度的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between the gap of colloid mill and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

圖5顯示提取時間最佳值為171.2min時，磨齒間隙與提取溫度對多糖提取率的影響。由方差分析表中的P值分析得出磨齒間隙與提取溫度之間的交互作用極顯著，當(dāng)把提取溫度固定在85℃，隨磨齒間隙的增加，在試驗(yàn)范圍內(nèi)提取液中多糖含量先增加后減少，在40μm附近達(dá)到峰值。當(dāng)把磨齒間隙固定在40μm，隨提取溫度的升高在試驗(yàn)范圍內(nèi)提取液中多糖含量先增加后減小，在85℃附近達(dá)到峰值。

2.4.3.2 磨齒間隙與提取時間的交互作用

圖6 膠體磨磨齒間隙與提取時間的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between the gap of colloid mill and extraction time on the extraction rate of polysaccharides

圖6顯示提取溫度最佳值為86.9℃時，磨齒間隙與提取時間對多糖提取率的影響。由方差分析表中的P值分析得出磨齒間隙與提取時間的交互作用極顯著。當(dāng)把提取時間固定在165min，隨磨齒間隙的增大提取液中多糖含量呈先增加后減少的趨勢，在40μm附近達(dá)到峰值。當(dāng)把磨齒間隙固定在40μm，隨提取時間延長，提取液中多糖含量持續(xù)增加，在165～180min內(nèi)達(dá)到峰值。

2.4.3.3 提取時間與提取溫度的交互作用

圖7 提取時間與提取溫度的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

圖7顯示了磨齒間隙最佳值為42.2μm時，提取時間與提取溫度對多糖提取率的影響。由方差分析表中的P值分析得出提取時間與提取溫度之間的交互作用達(dá)到極顯著水平。當(dāng)把提取溫度固定在85℃，隨提取時間的延長提取液中多糖含量在試驗(yàn)范圍內(nèi)持續(xù)增加，在165～180min內(nèi)達(dá)到峰值。當(dāng)把提取時間固定在165min上，隨提取溫度升高，多糖含量先增加后減少，在85℃附近達(dá)到峰值。

2.4.4 模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

通過Design Expert 7.0分析得到最佳提取條件為磨齒間隙42.2μm、提取溫度86.9℃、提取時間171.2min。根據(jù)實(shí)際情況把工藝參數(shù)修正為磨齒間隙42μm、提取溫度87℃、提取時間170min。按照此工藝得到的提取液中多糖含量為(418±3.21)μg/mL，經(jīng)擬合模型得到的預(yù)測值為417.6μg/mL，與實(shí)測值差異不顯著，說明該模型可以很好的預(yù)測金針菇水溶性多糖的提取條件與提取液中多糖含量之間的關(guān)系，同時也說明了工藝參數(shù)的可行性。此時的多糖提取率(按金針菇干質(zhì)量計)為3.63%。

3 結(jié) 論

濕法超微粉碎(膠體磨處理)、超聲波、微波等物理手段能提高提取液中多糖的含量。其中濕法超微粉碎處理效果最為明顯，與單純沸水提取相比，濕法超微粉碎提取法獲得的多糖含量提高了75%。

響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的多糖提取率為3.63%，高于已報道的水提醇沉法和酶解法的提取率，操作簡便，工藝參數(shù)切實(shí)可行。

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Optimization of Extraction Processing for Water-soluble Polysaccharides from Flammulina velutipes

KONG Xiao-xue，AN Xin-xin*，ZHAO Li-yan，HU Qiu-hui
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Wet ultra-fine pulverization extraction, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction were used to explore the optimal extraction conditions of water-soluble polysaccharides from Flammulina velutipes. Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the conditions of wet ultra-fine pulverization extraction for water-soluble polysaccharides. Results indicated that the optimal extraction processing parameters were the gap of colloid mill at 42μm,extraction temperature of 87 ℃ and extraction time of 170 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of polysaccharides was 3.63%. The concentration of water-soluble polysaccharides based on predictive model was 417.6μg/mL,and the actually determined concentration of water-soluble polysaccharides was (418 ± 3.21 )μ g/mL.

Flammulina velutipes；water-soluble polysaccharides；wet ultra-fine pulverization extraction；response surface methodology (RSM)

TS201

A

1002-6630(2010)24-0230-06

2010-11-02

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)

孔曉雪(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)化學(xué)。E-mail：ldxmkxx@yahoo.cn

安辛欣(1960—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)化學(xué)。E-mail：anxinxin@njau.edu.cn