房耀維，呂明生，徐煒楓，劉 姝，焦豫良，王淑軍,*

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋資源研究院，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 南京 210036)

產(chǎn)抗氧化胞外多糖海洋細(xì)菌的篩選及發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基優(yōu)化

房耀維1，呂明生1，徐煒楓2，劉 姝1，焦豫良1，王淑軍1,*

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋資源研究院，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 南京 210036)

從連云港海域分離海洋細(xì)菌，并從中篩選獲得一株產(chǎn)抗氧化活性較強(qiáng)的胞外多糖的細(xì)菌菌株OST23a。通過形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16S rRNA分析，將菌株OST23a鑒定為Bacillus subtilis。采用單因素試驗(yàn)確定菌株OST23a發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳碳、氮源和金屬離子分別為正己烷、酵母提取物和CaCl2。采用正交試驗(yàn)確定了菌株OST23a產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基的配方為：正己烷1.5%、酵母提取物0.1%、K2HPO4 0.3%、KH2PO4 0.1%、CaCl2 0.1%。菌株在該培養(yǎng)基產(chǎn)胞外多糖可達(dá)到9.06mg/L。

海洋細(xì)菌；胞外多糖；抗氧化活性；篩選；培養(yǎng)基優(yōu)化

微生物胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)是由微生物產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外的長(zhǎng)鏈、高分子質(zhì)量聚合物。由于微生物胞外多糖具有包括抗氧化活性在內(nèi)的多種生物活性，并且安全無毒、易于純化和連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)，因此成為人們研究的熱點(diǎn)[1-2]。目前報(bào)道較多的抗氧化微生物胞外多糖是海藻多糖和真菌多糖，而細(xì)菌多糖研究較少。海洋的高鹽、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)等特殊環(huán)境賦予海洋微生物代謝產(chǎn)物多樣性、新穎性和獨(dú)特性。海洋微生物胞外多糖往往具有獨(dú)特的生化結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性[3-4]。本實(shí)驗(yàn)從連云港海域篩選抗氧化活性的微生物胞外多糖高產(chǎn)菌株，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化及16S rDNA序列分析鑒定，對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的條件進(jìn)行研究，為微生物胞外多糖的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海泥及海水樣品采集于連云港連島海域。

胰蛋白胨、酵母提取物 英國(guó)Oxoid公司；基因組提取試劑盒 大連寶生物公司；dNTP、瓊脂糖、Taq酶 美國(guó)BBI公司；還原型輔酶(NADH) 美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2216E 液體培養(yǎng)基(%)：胰蛋白胨0.5、酵母提取物0.1、海水配制，pH7.0，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂；種子培養(yǎng)基(%)：葡萄糖1、胰蛋白胨0.5、酵母提取物0.1、海水配制，pH7.0，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂；發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：葡萄糖1、胰蛋白胨0.5、酵母提取物0.1、K2HPO40.3、KH2PO40.1、MgSO40.05、海水配制，pH7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；680 ELX-800 酶標(biāo)儀、Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司；DV-I Prime黏度計(jì) 美國(guó)Brookfield公司。

1.3 產(chǎn)抗氧化胞外多糖菌株的篩選

1.3.1 連云港海域海洋細(xì)菌的篩選

將取自連云港連島海域的海水1mL、潮間帶海泥1g添加到250mL 三角瓶裝有50mL的2216E培養(yǎng)基中，28℃、160r/min 培養(yǎng)36h后，將培養(yǎng)液稀釋106倍，吸取10～100μL 涂布2216E培養(yǎng)基平板。在28℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察菌落顏色、形態(tài)，劃線純化至純種后保藏備用。

1.3.2 產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)生菌的初篩

初篩獲得的菌株接種到種子培養(yǎng)基，28℃、160r/min培養(yǎng)24h后，以1%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、160r/min 培養(yǎng)36h后，測(cè)定發(fā)酵液黏度和OD600nm，從中選擇黏度/OD600nm比值最高的12株菌備用。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 高產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將上述發(fā)酵液8000×g離心10min，取20mL上清液加3倍體積的95%乙醇，4℃沉淀過夜，10000×g離心20min，所得沉淀用蒸餾水定容到20mL，獲得粗胞外多糖，測(cè)定粗多糖含量。

1.3.4 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸顯色法測(cè)定多糖含量[5]。

1.3.5 抗氧化胞外多糖產(chǎn)生菌的篩選

復(fù)篩獲得高產(chǎn)胞外多糖菌株后，將所有菌株的粗多糖質(zhì)量濃度稀釋至0.05g/L，測(cè)定1.3.3節(jié)所獲得的粗胞外多糖清除超氧陰離子自由基()和羥自由基(·OH)能力。

采用氮藍(lán)四唑(NBT)法。配制50mmol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(含150μmol/L的NBT)、60μmol/L的吩嗪硫酸甲脂(PMS)、468μmol/L的NADH，量取1mL該緩沖液加入1mL 1.3.5節(jié)所獲得的粗胞外多糖溶液，25℃反應(yīng)5min，然后在波長(zhǎng)560nm處測(cè)定吸光度(Ai)。對(duì)照液以1mL蒸餾水代替待測(cè)液，測(cè)定其吸光度(A01)。O2－·清除能力用TR表示，通過式(1)計(jì)算。

1.3.7 對(duì)·OH清除能力的測(cè)定[7]

采用α-脫氧核糖氧化法。準(zhǔn)確量取0.2mL FeSO4-EDTA混合液(10mmol/L)移至具塞試管中，加入10mmol/L 2-脫氧核糖溶液 0.2mL，再加入1.0mL 不同質(zhì)量濃度的1.3.5節(jié)所獲得的粗胞外多糖溶液，隨后用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4) 定容至1.8mL，最后加入10mmol/L過氧化氫溶液0.2mL，混合均勻后將該體系置于37℃恒溫水浴中1h，取出，再向該體系加入1.0mL 2.8% 的三氯乙酸溶液(TCA)，1.0mL 1.0% 的硫代巴比妥酸溶液(TBA)，混合均勻后于水浴中反應(yīng)10min，取出，冷水冷卻，在532nm波長(zhǎng)處測(cè)定該體系的吸光度AS。對(duì)照液以1.0mL蒸餾水代替待測(cè)液，測(cè)定吸光度A02。

對(duì)·OH的清除能力用SA表示，通過式(2)計(jì)算。

1.4 細(xì)菌鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定[8]。進(jìn)一步對(duì)菌株16S rRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，序列測(cè)定后Blast 搜索同源序列并構(gòu)建進(jìn)化樹[9]。

1.5 培養(yǎng)基成分對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

1.5.1 碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分以及發(fā)酵條件不變，分別用1%的果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、正己烷替換培養(yǎng)基中的葡萄糖和蛋白胨，用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量確定最佳碳源。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，下同。

1.5.2 氮源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分以及發(fā)酵條件不變，分別用0.1%的牛肉膏、硝酸鉀、硫酸銨、尿素、酪蛋白替換培養(yǎng)基中的酵母提取物，用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量確定最佳氮源。

1.5.3 金屬離子對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分以及發(fā)酵條件不變，分別用0.05% 的 MnSO4、FeSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2替換培養(yǎng)基中的MgSO4，用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量，確定最佳金屬離子。

1.5.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以正己烷、酵母提取物、CaCl2為因素進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗氧化胞外多糖菌株的篩選

通過2216E培養(yǎng)基平板對(duì)所采樣品中海洋細(xì)菌進(jìn)行分離，獲得菌株389株。研究表明，產(chǎn)胞外多糖菌株使發(fā)酵液黏度增加，并呈一定的相關(guān)性。用OD600nm測(cè)定生物量，二者的比值可以衡量菌株產(chǎn)胞外多糖的能力。對(duì)389株海洋細(xì)菌發(fā)酵液黏度和OD600nm進(jìn)行測(cè)定，比值最高的12株菌的測(cè)定結(jié)果如表1所示。在黏度/OD600nm比值最高的12株菌中，不同菌株的黏度/OD600nm和多糖之間相關(guān)性較差，這可能是由于不同菌株使發(fā)酵液變黏稠的原因不同，或者即使都是多糖導(dǎo)致的黏稠度增加，不同菌株多糖的種類亦有差別，因此造成相關(guān)性較差，因此黏度只能作為多糖產(chǎn)生菌株篩選的初篩指標(biāo)。GDM21產(chǎn)粗多糖的能力最高，但是該多糖檢測(cè)不到對(duì)·OH和O2－·的清除能力。結(jié)合產(chǎn)多糖能力及對(duì)·OH和O2－·清除能力，選取菌株OST23a作為出發(fā)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 菌種鑒定

表2 菌株OST23a形態(tài)、生長(zhǎng)特性及生理生化特征Table 2 Morphological, physiological and biochemical characteristics of strain OST23a

對(duì)菌株OST23a進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定，結(jié)果如表2所示，對(duì)照文獻(xiàn)[8]，初步將菌株OST23a鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。對(duì)該菌株擴(kuò)增的部分16S rRNA 序列(GenBank HQ141318)長(zhǎng)度為1345bp，經(jīng)Blast比對(duì)，與之相似度最高的菌株均為Bacillus sp.；其中與Bacillus subtilis的 16S rRNA (AF142577) 相似度最高。選取相似度最高的部分序列，經(jīng)Clustal X 多序列比對(duì)后，利用Mega4.0 軟件的Neighbour-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。菌株OST23a與菌株Bacillus subtilis (AF142577) 的 16S rDNA位于同一簇群，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征將菌株鑒定為Bacillus subtilis。目前報(bào)道的產(chǎn)抗氧化多糖的微生物主要有 Lactococcus lactis[10]、Keissleriella sp.[11]、Paenibacillus polymyxa[12]、Penicillium sp.、Epicoccum nigrum[3]、Bacillus sp.亦有報(bào)道，該菌株篩選于新疆羅布泊沙漠[13]。

表1 抗氧化活性多糖產(chǎn)生菌的篩選(±s, n=3)Table 1 Screening of marine strains with the ability to produce antioxidant EPS (±s, n=3)

表1 抗氧化活性多糖產(chǎn)生菌的篩選(±s, n=3)Table 1 Screening of marine strains with the ability to produce antioxidant EPS (±s, n=3)

注：－.無活性檢出。

菌株 黏度/(Pa·s) OD600nm 黏度/OD600nm 粗多糖產(chǎn)量/(mg/L) 清除率/%O2－· ·O H LDM21 2.79±0.11 2.12±0.10 1.41 5.66±0.26 18.31±1.22 35.62±1.68 LDM131 2.76±0.12 1.98±0.11 1.55 4.92±0.27 － －LDM135 2.83±0.12 2.02±0.10 1.48 6.01±0.23 － －LDM1521 2.79±0.13 1.32±0.12 1.48 5.93±0.22 27.91±1.83 45.87±2.65 OST23a 2.88±0.11 1.82±0.09 1.58 5.99±0.23 38.3±2.6 55.56±2.11 OSTK93 2.91±0.14 1.76±0.11 1.66 5.66±0.23 － －OSTK95 2.80±0.12 1.83±0.13 1.53 5.46±0.22 31.12±1.79 44.6±2.1 OSTK102 2.81±0.12 2.00±0.12 1.46 5.62±0.26 12.78±1.16 25.33±1.20 GDM0 2.73±0.11 2.10±0.13 1.59 6.00±0.26 － －GDM21 2.80±0.13 1.76±0.12 1.59 6.13±0.24 － －GDM29 2.80±0.12 1.79±0.11 1.57 5.87±0.23 21.90±1.52 37.41±1.98 GDM51 2.915±0.12 2.12±0.11 1.54 5.97±0.23 30.13±1.77 40.45±1.90

表3 培養(yǎng)基中碳源對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(±s, n=3)Table 3 Effect of carbon source type on EPS prodution (±s, n=3)

表3 培養(yǎng)基中碳源對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(±s, n=3)Table 3 Effect of carbon source type on EPS prodution (±s, n=3)

碳源 果糖 蔗糖 麥芽糖 乳糖 可溶性淀粉 正己烷 葡萄糖+蛋白胨胞外多糖產(chǎn)量/(mg/L) 3.35±0.13 2.66±0.12 5.81±0.38 4.09±0.22 4.12±0.23 6.15±0.26 5.99±0.19

表4 培養(yǎng)基中氮源對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(±s, n=3)Table 4 Effect of nitrogen source type on EPS prodution (±s, n=3)

表4 培養(yǎng)基中氮源對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(±s, n=3)Table 4 Effect of nitrogen source type on EPS prodution (±s, n=3)

氮源 牛肉膏 硫酸銨 酪蛋白 酵母提取物 硝酸鉀 尿素胞外多糖產(chǎn)量/(mg/L) 4.68±0.18 1.23±0.08 4.52±0.19 5.99±0.23 1.02±0.06 1.32±0.09

圖1 利用16S rDNA同源序列和鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on homologous sequences of 16SrRNA and Neighbor-Joining analysis

2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.3.1 碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

由表3可見，在供試的碳源中，葡萄糖和蛋白胨利于胞外多糖的產(chǎn)生，正己烷為碳源時(shí)，多糖產(chǎn)量最高，這可能是由于正己烷為有機(jī)溶劑，具有一定的極性(極性常數(shù)3.5)，菌株通過產(chǎn)生多糖來抵御有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞造成的危害，所以多糖產(chǎn)量增加，但是正己烷并不是菌株生長(zhǎng)的最佳碳源，生物量減少，因此多糖產(chǎn)量增加不明顯。

2.3.2 氮源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

由表4可知，供試氮源中，無機(jī)氮不利于多糖的產(chǎn)生，有機(jī)氮中酵母提取物為氮源時(shí)胞外多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到5.99mg/L。氮源主要通過影響微生物的生長(zhǎng)速率影響多糖、酶等代謝產(chǎn)物的分泌。無機(jī)氮源不利于微生物的生長(zhǎng)，使生物量減少，導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量下降。

2.3.3 金屬離子對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

表5 培養(yǎng)基中金屬離子對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(±s, n=3)Table 5 Effect of metal ions on EPS prodution (±s, n=3)

表5 培養(yǎng)基中金屬離子對(duì)多糖產(chǎn)量的影響(±s, n=3)Table 5 Effect of metal ions on EPS prodution (±s, n=3)

金屬離子 MnSO4 FeSO4 CuSO4 MgSO4 ZnSO4 CaCl2多糖產(chǎn)量/(mg/L)4.68±0.18 2.12±0.08 4.52±0.19 5.99±0.24 4.21±0.24 6.12±0.26

由表5可見，CaCl2可以提高多糖產(chǎn)量。有研究表明，CaCl2可以提高酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌產(chǎn)多糖的能力[14-15]。

2.3.4 正交試驗(yàn)

表6 優(yōu)選產(chǎn)EPS條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal array design experiments for optimizing fermentation medium formula

由表6可知，培養(yǎng)基產(chǎn)胞外多糖最佳正己烷、酵母提取物、CaCl2條件為A3B2C3，即正己烷、酵母提取物、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、0.1%和0.1%。從極差R的大小看出，因素C(CaCl2)是影響胞外多糖產(chǎn)量最大的因素，其次是因素B(酵母提取物)，因素A(正己烷)極差最小。對(duì)本試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)基組分進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株胞外多糖產(chǎn)量能維持在9.06mg/L左右。

3 結(jié) 論

從連云港海域細(xì)菌中篩選獲得一株產(chǎn)抗氧化活性較強(qiáng)胞外多糖的細(xì)菌菌株OST23a，通過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA分析，將菌株OST23a鑒定為Bacillus subtilis。該菌株分泌的胞外多糖對(duì)·OH和O2－·有較好的清除效果，具有潛在的食品及醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。培養(yǎng)基中的碳、氮源及金屬離子對(duì)菌株OST23a發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響研究發(fā)現(xiàn)，最佳碳、氮源分別為正己烷和酵母提取物，CaCl2可以提高胞外多糖產(chǎn)量。利于胞外多糖產(chǎn)量積累的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：正己烷1.5%、酵母提取物0.1%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%、CaCl20.1%。在此培養(yǎng)基中28℃、160r/min培養(yǎng)36h后胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)9.06mg/L。

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Screening and Optimization of Fermentation Medium of an Antioxidant Exopolysaccharide-producing Marine Strain

FANG Yao-wei1，Ming-sheng1，XU Wei-feng2，LIU Shu1，JIAO Yu-liang1，WANG Shu-jun1,*
(1. Jiangsu Marine Resources Development Research Institute, School of Marine Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Jiangsu Agro-product Quality Test Center, Nanjing 210036, China)

In this study, a marine strain named OST23a with the ability to produce antioxidant exopolysaccharide (EPS) was screened out of the strains isolated from the samples of sea water or sea mud collected from the sea area near Lianyungang. The strain OST23a was identified as Bacillus subtilis according to its morphological, physiological, biochemical characteristics and 16S rRNA sequence. The EPS produced by this strain exhibited an obvious antioxidant activity. The optimal carbon and nitrogen sources as well as metal ion for the production of EPS were determined to be n-hexane, yeast extract and CaCl2 by single-factor experiments. The optimal formula of fermentation medium for the production of EPS by OST23a were explored to be 1.5%n-hexane, 0.1% yeast extract, 0.3% K2HPO4, 0.1% KH2PO4, and 0.1% CaCl2 by orthogonal array experiments. The productivity of EPS was up to 9.06 mg/L using this optimal medium.

marine strain；EPS；antioxidant activity；screening；medium composition

TS202.21

A

1002-6630(2010)23-0276-05

2010-08-24

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(08KJB550001)

房耀維(1978—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锷锛夹g(shù)。E-mail：foroei@yahoo.cn

王淑軍(1964—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：shujunwang@163.com