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        碘量法測定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

        2010-10-27 04:09:58馮曉燕周延政孫文敬王大明余泗蓮劉敬澤
        食品科學(xué) 2010年24期
        關(guān)鍵詞:質(zhì)量

        馮曉燕,周延政,孫文敬,,王大明,余泗蓮,劉敬澤,*

        (1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 石家莊 050016;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;3.百勤異VC鈉有限公司,江西 德興 334221)

        碘量法測定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

        馮曉燕1,周延政2,孫文敬1,2,王大明1,余泗蓮3,劉敬澤1,*

        (1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 石家莊 050016;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;3.百勤異VC鈉有限公司,江西 德興 334221)

        在優(yōu)化樣品處理條件的基礎(chǔ)上,考察葡萄糖對2-酮基-D-葡萄糖酸測定的影響,改進發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的碘量法測定技術(shù)。結(jié)果表明:滴定樣品溶液所消耗的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積、樣品溶液中2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系,R2>0.9999;該方法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好,2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率為95.68%,RSD為1.35%(n=5)。該方法準(zhǔn)確、快速,操作簡便,可用于發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量檢測。

        2-酮基-D-葡萄糖酸;葡萄糖;發(fā)酵液;碘量法

        2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)是目前國際上規(guī)?;l(fā)酵生產(chǎn)的有機酸之一,主要作為食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鹽類合成的前體[1-4]。關(guān)于發(fā)酵液中2KGA的測定方法已有一些報道,如旋光法[5]、酸堿滴定法[6]、HPLC法[1]、酶法[7]和碘量法[8-9]等。旋光法、HPLC法和酶法等儀器分析方法可以準(zhǔn)確檢測發(fā)酵液中的2KGA,但因樣品處理過程復(fù)雜、所需儀器昂貴或試劑成本較高等原因而難以在國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)中得到推廣應(yīng)用;酸堿滴定法的操作過程比較簡單,但因測定中的變色現(xiàn)象難以觀察而導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差較大。因此,碘量法成為目前國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)上檢測發(fā)酵液中2KGA的主要方法。

        碘量法測定2KGA的基本原理:2KGA分子內(nèi)含有可直接發(fā)生酯化反應(yīng)的羧基和醇羥基,還含有可發(fā)生互變異構(gòu)反應(yīng)的羰基,在強酸性條件下加熱2KGA水溶液可以將其定量轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸[10]。利用D-異抗壞血酸與I2的氧化還原反應(yīng)可以定量測定D-異抗壞血酸的質(zhì)量濃度[11-12],然后換算成2KGA的質(zhì)量濃度。該方法也稱轉(zhuǎn)化碘量法[13]。

        長期以來,國內(nèi)相關(guān)學(xué)者對發(fā)酵液中2KGA碘量法測定的準(zhǔn)確性還有一些質(zhì)疑。有學(xué)者認為,發(fā)酵液中的葡萄糖對該法的測定結(jié)果影響很大[6]。因此,本研究對發(fā)酵液中2KGA的碘量法測定進行方法學(xué)考察,為該方法在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        2KGA發(fā)酵液:采用文獻[4]的菌種和方法自制;2KGA鈣鹽(2KGA含量的質(zhì)量分數(shù)為78.41%) 江西省德興市百勤異V C鈉有限公司;葡萄糖、碘、碘化鉀、硫酸、氫氧化鈉、可溶性淀粉等為國產(chǎn)分析純試劑;實驗溶液均采用二次蒸餾水配制。

        1.2 儀器與設(shè)備

        SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;PHS-3C型pH計 上海精密儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;80-2型離心沉淀機 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;CS501型超級恒溫水浴器 常州諾基儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品溶液的制備

        取一定量的發(fā)酵液,4000r/min離心20min除去沉淀物。取1.0mL上清液于試管內(nèi),與5.0mL 2.0mol/L H2SO4溶液充分混合,立刻將試管放入沸水浴中精確加熱35min。從水浴中取出試管后,立即用冷水將其冷卻,再用100mL蒸餾水將試管內(nèi)的反應(yīng)液洗入250mL三角瓶中,所得的混合液作為樣品溶液。

        1.3.2 對照品溶液的制備

        精密稱取各配比所需的無水葡萄糖和2KGA,用少量水將其充分溶解,加入100mL的容量瓶中定容。其他制備步驟同1.3.1節(jié),所得的溶液作為對照品溶液1~9。

        1.3.3 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定

        按文獻[14]方法進行配制和標(biāo)定。

        1.3.4 葡萄糖的分析

        25℃條件下,采用生物傳感分析儀測定。

        1.3.5 pH值的測定

        采用pH計測定。

        1.3.6 2KGA的測定

        以1g/100mL的淀粉溶液為指示劑,用0.05mol/L的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定待測溶液至藍色,30s內(nèi)溶液不褪色即為滴定終點,記錄滴定消耗的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。待測溶液中2KGA的質(zhì)量濃度X1與I2標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量Y之間存在如下關(guān)系:

        式中:X1為待測樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度/(mg/ mL);Y為滴定待測樣品溶液時消耗的0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL;4.403為1.0mL 0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于D-異抗壞血酸的毫克數(shù)[15-16];A為測定條件下2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率;B為待測樣品溶液的取樣體積/mL;0.9071為D-異抗壞血酸與2KGA的相對分子質(zhì)量之比。

        1.3.7 2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率測定

        以特定條件對2KGA標(biāo)準(zhǔn)品進行轉(zhuǎn)化,然后采用1.3.6節(jié)的方法測定反應(yīng)液消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率(A):

        式中:V為滴定反應(yīng)液時消耗的0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL;4.403為1.0mL 0.05mol/L I2標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于D-異抗壞血酸的毫克數(shù)[15-16];m為被測標(biāo)準(zhǔn)品溶液中2KGA的質(zhì)量/mg;0.9071為D-異抗壞血酸與2KGA的相對分子質(zhì)量之比。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品處理條件的優(yōu)化

        2.1.1 H2SO4用量的選擇

        在水浴溫度100℃、加熱時間20min、H2SO4濃度2.0mol/L的條件下,對1.0mL質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的2KGA溶液進行轉(zhuǎn)化,考察H2SO4用量對2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響。研究結(jié)果(表1)表明,H2SO4用量為5.0mL時,2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率最高。因此,選擇5.0mL的H2SO4用量作為2KGA樣品溶液的處理條件之一。

        表1 H2SO4用量對2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響Table 1 Effect of H2SO4 concentration on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

        2.1.2 水浴溫度的選擇

        表2 溫度對2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響Table 2 Effects of temperature on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

        在加熱時間為20min、被測樣品中加入5.0mL 2.0mol/L的H2SO4的條件下,對1.0mL質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的2KGA溶液進行轉(zhuǎn)化,考察溫度對2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響。結(jié)果(表2)表明,轉(zhuǎn)化率隨水浴溫度的升高而提高;溫度達到100℃時,轉(zhuǎn)化率有明顯的增加。因此,選擇100℃作為2KGA樣品溶液的處理溫度。

        2.1.3 水浴時間的選擇

        在水浴溫度100℃、被測樣品加入5.0mL 2.0mol/L H2SO4溶液的條件下,對1.0mL質(zhì)量濃度2.0g/100mL 2KGA溶液進行轉(zhuǎn)化,考察水浴時間對2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響(表3)。隨著水浴時間的增加,2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率呈增加趨勢,但反應(yīng)液的色澤也會逐漸加深。反應(yīng)時間超過35min時,轉(zhuǎn)化率的增加不再明顯(反應(yīng)接近平衡),反應(yīng)液的色澤明顯變深。有學(xué)者認為,反應(yīng)時間過長,會導(dǎo)致具有烯醇結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物產(chǎn)生,且該副產(chǎn)物同樣具有較強的還原性,會影響測定結(jié)果[10]。綜合考慮,該反應(yīng)的水浴時間以35min為宜,以避免過多副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

        表3 水浴時間對2KGA轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸的影響Table 3 Effects of water bath treatment time on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

        2.2 方法學(xué)考察

        2.2.1 葡萄糖存在條件下碘量法測定2KGA的準(zhǔn)確性

        根據(jù)2.1節(jié)研究結(jié)果可知,當(dāng)待測樣品中沒有葡萄糖存在時,在優(yōu)化的樣品處理條件下(即1.3.1節(jié)樣品溶液的制備條件),待測樣品I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量Y與其2KGA質(zhì)量濃度X1之間存在的線性關(guān)系為Y= 0.0630004X1。該情況下碘量法測定的準(zhǔn)確性已經(jīng)得到實踐驗證和相關(guān)學(xué)者的普遍認可,在此不再進行贅述。

        按照國內(nèi)現(xiàn)行的測定方法,對對照品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度進行測定。實驗結(jié)果(表4)表明,葡萄糖對碘量法測定2KGA具有一定的影響,導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。在實驗設(shè)計的范圍內(nèi),其相對誤差最高可達6.82%。利用Excel對對照品溶液I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗結(jié)果(表4)進行多元線性回歸,可以得到線性回歸方程:Y=0.064060X1+0.000827X2,且R2>0.9999。其中:Y為發(fā)酵液消耗碘液的體積(碘量值)/mL;X1為發(fā)酵液中2KGA的質(zhì)量濃度/(mg/mL);X2為被測樣品中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        上述線性回歸方程的建立,說明滴定對照品溶液的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量、2KGA質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系,即葡萄糖對碘量法測定2KGA的影響可以從方法學(xué)上予以解決。實驗結(jié)果(表4)表明,利用所建立的線性回歸方程計算對照品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度,其相對誤差明顯降低。

        表4 對照品溶液的組成及其碘量值測定結(jié)果Table 4 Composition and the iodine value of the standard solution

        2.2.2 精密度實驗

        隨機抽取對照品溶液5進行精密度實驗(表5)。重復(fù)5次取樣測定的碘量值及葡萄糖質(zhì)量濃度的RSD值分別為0.49%和1.33%,根據(jù)線性回歸方程計算的2KGA質(zhì)量濃度的RSD值為0.48%,說明該方法具有良好的精密度。

        表5 碘量法測定2KGA的精密度實驗結(jié)果Table 5 Precisions of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

        2.2.3 穩(wěn)定性實驗

        取新鮮的發(fā)酵液,4000r/min離心10min。將離心得到的上清液在25℃條件下分別放置0、30、60、90min和120min,再按照1.3.1節(jié)的方法對其進行處理,然后測定樣品溶液的碘量值及葡萄糖質(zhì)量濃度,RSD值分別為0.79%和0.39%;根據(jù)所建立的線性回歸方程計算樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度,RSD值為0.79%。結(jié)果(表6)表明,在本實驗條件下,用于2KGA質(zhì)量濃度測定的樣品在2h內(nèi)穩(wěn)定。

        表6 碘量法測定2KGA的穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 6 Stability of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

        2.2.4 重現(xiàn)性實驗

        取相同的發(fā)酵液5份,按1.3.1節(jié)方法分別進行處理,測定所得各個樣品溶液的碘量值及葡萄糖質(zhì)量濃度,RSD值分別為0.55%和0.39%;根據(jù)所建立的線性回歸方程計算樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度,RSD值為0.55%,結(jié)果(表7)表明重現(xiàn)性良好。

        表7 碘量法測定2KGA的重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 7 Reproducibility of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

        2.2.5 回收率實驗

        準(zhǔn)確量取2KGA質(zhì)量濃度36.6664mg/mL的發(fā)酵液50mL,精確加入0.6377g 2KGA鈣鹽(含2KGA 0.5000g),按1.3.1節(jié)方法制備樣品溶液,平行5份。測定各個樣品溶液的碘量值及葡萄糖的質(zhì)量濃度,并根據(jù)所建立的線性回歸方程計算樣品溶液中2KGA的質(zhì)量濃度。計算結(jié)果(表8)顯示,2KGA的5次平均回收率為95.68%,RSD為1.35%。

        表8 2KGA的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 8 Spike recoveries and RSD for determining 2KGA content in the fermentation broth

        3 結(jié) 論

        實驗結(jié)果表明,樣品處理的適宜條件為2.0mol/L硫酸用量5.0mL,處理溫度100℃,處理時間35min。在葡萄糖存在的條件下,滴定樣品溶液的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量、樣品溶液中2KGA質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系,即葡萄糖對碘量法測定2KGA的影響可以從方法學(xué)上予以解決。2KGA碘量法測定技術(shù)的準(zhǔn)確度較高,精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好,操作簡便、經(jīng)濟、快速,適用于2KG A發(fā)酵過程的控制分析。

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        Iodometric Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth

        FENG Xiao-yan1,ZHOU Yan-zheng2,SUN Wen-jing1,2,WANG Da-ming1,YU Si-lian3,LIU Jing-ze1,*
        (1. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China;2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;3. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

        Iodometric method was improved to prevent the interference of glucose in determination of 2-keto-D-gluconic acid (2KGA) in fermentation broth. The results revealed a good linear relationship among the volumes of I2 standard solution consumed and concentrations of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2>0.9999). The average recovery was 95.68% with the relative standard deviation (RSD) of 1.35% (n=5). The method developed here had good accuracy, stability and reproducibility, and was easily operated, hereby could be used for the determination of concentrations of 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

        2-keto-D-gluconic acid;glucose;fermentation broth;iodometry

        TQ921.2

        A

        1002-6630(2010)24-0314-04

        2010-08-29

        江蘇大學(xué)科研啟動基金項目(08JDG029);江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計劃項目(2008DD00600);江西省科技支撐計劃項目(贛財教[2008]147號)

        馮曉燕(1985—),女,碩士研究生,研究方向為微生物生態(tài)學(xué)。E-mail:xiaoyan0316@126.com

        *通信作者:劉敬澤(1964—),男,教授,博士,研究方向為生態(tài)學(xué)。E-mail:liujingze@mail.hebtu.edu.cn

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