謝 娟，王顏紅*，王世成，張 紅，王 瑩，王姍姍

(1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.中國科學院研究生院，北京 100049)

GC-MS法測定蔬菜中3,5,6-三氯-2羥基吡啶

謝 娟1,2，王顏紅1,*，王世成1，張 紅1，王 瑩1，王姍姍1

(1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；2.中國科學院研究生院，北京 100049)

建立蔬菜中毒死蜱代謝物3,5,6-三氯-2羥基吡啶(3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP)的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)丙酮提取，正己烷去除雜質(zhì)，二氯甲烷反萃取，過無水硫酸鈉去除水分，濃縮后乙酸乙酯溶解，再用N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)衍生，正己烷定容，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測，外標法定量。方法的檢出限為8.3μg/kg，加標回收率為70.4%～107.6%，RSD為4.3%～8.7%。在5～500μg/L的范圍內(nèi)線性范圍良好，相關系數(shù)大于0.99。該方法通用性強，靈敏度高，可用于蔬菜中TCP的檢測。

氣相色譜-質(zhì)譜；3,5,6-三氯-2羥基吡啶；蔬菜

毒死蜱是一種低毒、廣譜的有機磷類殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)和家庭中使用廣泛。近年來國內(nèi)外關于毒死蜱的殘留、毒性及降解方面的研究比較多[1-3]。已有研究表明，毒死蜱在環(huán)境(土壤、水體、空氣等)以及動植物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為3,5,6-三氯-2羥基吡啶(3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP)[4-6]，正常噴施毒死蜱后，空氣、蔬菜中均能檢出TCP[4,7]；含有毒死蜱的蔬菜加熱后會有一部分毒死蜱轉(zhuǎn)化生成TCP[8]。TCP具有毒性，甚至毒性比毒死蜱大，Baskaran等[9]發(fā)現(xiàn)TCP對土壤微生物的毒性影響比毒死蜱更高，在Microtox系統(tǒng)中TCP對土壤細菌群落的毒性是毒死蜱的2.5倍；Caceres等[6]發(fā)現(xiàn)TCP對水虱的毒性比毒死蜱大，且兩者有協(xié)同作用。TCP對人體健康的潛在威脅也引起了學者的重視[4]。鑒于食品，尤其是蔬菜是人體攝入TCP的主要途徑，有必要對蔬菜中TCP的殘留量進行監(jiān)控，首要的是建立一種簡便、快捷、高靈敏度的檢測方法。

國內(nèi)外文獻報道TCP的檢測主要采用液相-質(zhì)譜法(LC-MS)[10]、高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[11]、酶聯(lián)免疫(ELISA)[12]等，這些報道大多以動物血液及尿液樣品作為研究對象，而食品，尤其是蔬菜中TCP的分析方法則鮮見報道。本實驗擬建立一種蔬菜中TCP的GC-MS檢測方法，為監(jiān)測TCP在蔬菜中的殘留情況提供測定方法參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TCP標準品(純度＞99%) 美國Accustandard公司；N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA) 美國ACROS公司。

丙酮、乙酸乙酯、正己烷(均為分析純) 天津博迪公司化學試劑公司；無水硫酸鈉：650℃灼燒4h，貯于干燥器中備用；實驗用水為超純水，由純水發(fā)生器制得。

1.2 儀器與設備

TRACE GC氣相色譜(Finnigan TRACE DSQ 四級桿質(zhì)譜儀配有電子電離源及Xcalibar 質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)) 美國Finnigan公司；電熱恒溫箱 上海精宏實驗設備有限公司；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 日本東京理化器械株式會社；KQ-250B型超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX GENIUS3渦旋混合器 IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將蔬菜可食部位粉碎后，取2g置于具塞三角瓶中，加入30mL丙酮，超聲30min。過濾，濾液于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入15mL超純水，用質(zhì)量分數(shù)為20%的 NaOH溶液調(diào)pH≥12，再加入3×15mL正己烷渦旋萃取。靜置10min分層，棄去正己烷層，下層水相加入濃HCl調(diào)pH≤2。加入15mL CH2Cl2渦旋萃取，靜置10min分層，棄去上層水相，重復操作3次，合并有機層，過無水Na2SO4漏斗。濾液于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干。殘渣用1mL乙酸乙酯充分溶解后，取0.1mL乙酸乙酯溶液，加入5μL MTBSTFA，混合均勻，置于50℃恒溫箱中衍生1h后迅速冷卻，正己烷定容至1 m L，待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP DB-5MS 石英毛細柱(30m×0.25mm，0.25μm)；升溫程序：初始溫度為70℃，保持2min后以20℃/min速率升至250℃，保持2min后再以20℃/min速率升溫至300℃，保持3min。進樣口溫度：280℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1μL；載氣：氦氣，純度＞99.99%，流速1.0mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊離子化(EI)；電子能量70eV；接口溫度250℃；離子源溫度200℃；測定方式：選擇離子監(jiān)測(SIM)。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

以回收率為指標，比較在實際應用中最常用的幾種提取劑甲醇、乙酸乙酯、丙酮的超聲提取效果。實驗結果表明3種提取劑的平均回收率為41.5%、65.7%、80.2%。另外，由于甲醇極性較強，可對農(nóng)藥充分提取，但也能提取出大量的色素雜質(zhì)，給下一步的凈化帶來困難。綜合考慮提取效率及凈化等因素，選取丙酮為提取溶劑。

2.1.2 水分去除

MTBSTFA屬硅烷化試劑的一種，遇水迅速分解[13]，因此前處理中水分的去除極其關鍵。本實驗在提取、凈化之后，衍生反應之前將提取液過無水硫酸鈉漏斗，能夠保證水分去除完全，且不影響回收率。

2.1.3 樣品凈化

蔬菜樣品中的主要雜質(zhì)為色素，為避免背景干擾以及減少對檢測器的污染，需對提取液進行凈化。目前使用較多的固相萃取方法雖然凈化效果較好，但成本較高。由于TCP具有弱酸性，本實驗通過兩次調(diào)節(jié)溶液pH值，利用酸堿萃取的方法使目標物與雜質(zhì)在有機相和水相中實現(xiàn)不同的分配而達到分離、凈化的效果。實驗表明，該方法能去除樣品中絕大部分色素，可滿足GC-MS檢測的需要。

2.2 衍生條件的確定

TCP為毒死蜱的代謝產(chǎn)物，其性質(zhì)穩(wěn)定，不容易被氣化，需要衍生才能進行氣相色譜分析。已報道的衍生化方法以硅烷化為主，使用的硅烷化試劑主要有BSA和MTBSTFA[14-16]。在檢出限以及回收率方面，使用MTBSTFA的效果均好于BSA，因此，本實驗采用MTBSTFA進行衍生(圖1)。

圖1 TCP的衍生化反應Fig.1 Derivatization of TCP

有關衍生時間及衍生溫度的優(yōu)化已有相關的研究，參考已有報道[17]，采用50℃衍生1h的方法。另外，為保證衍生反應充分、完全，比較溶劑與衍生試劑的比例分別為100:1、50:1、40:1、20:1和10:1時的衍生效率，結果見表1。

表1 溶劑與衍生試劑不同體積比條件下的衍生效率Table 1 Derivatization efficiency in different volume ratios

由表1可看出，溶劑與衍生試劑的比例為20:1及10:1時，衍生效率較好，而高于40:1，衍生效率不到65%。這可能是由于當溶劑體積遠大于衍生試劑時，盡管衍生試劑相對于TCP是過量的，但MTBSTFA分散在溶劑中，含量太低，與TCP反應的幾率較小。結合衍生效率及節(jié)約試劑的考慮，確定溶劑與衍生試劑的比例為20:1。

2.3 質(zhì)譜條件選擇

通過對GC-MS全掃獲得的TCP衍生物總離子流色譜圖及對應質(zhì)譜圖的分析，選擇豐度高、干擾低的特征離子作為SIM定量離子，以期獲得較高的靈敏度；同時選擇2個質(zhì)量數(shù)和豐度較高、干擾較低的特征離子作為定性離子，通過對2個定性離子豐度比例的分析實現(xiàn)對目標化合物的定性。TCP衍生物的總離子流色譜圖及質(zhì)譜圖見圖2、3。本實驗選擇的定量離子為m/z 254(相對豐度100%)，定性離子為m/z 256(次強峰，同位素峰，相對豐度89%)和m/z 93(相對豐度55%)。結合文獻[18]及硅烷化試劑衍生的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可判斷TCP衍生物質(zhì)譜中，基峰m/z 254為[M－57]+，豐度較強的m/z 93為碎片離子。

圖2 TCP標樣衍生物的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram for the derivatives of standard TCP

圖3 TCP標樣衍生物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of the derivatives of standard TCP

2.4 方法線性范圍及檢出限

在本方法確定的色譜、質(zhì)譜條件下，對配制的系列濃度的標準溶液進行測定，采用外標法對TCP進行定量，以其峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X，μg/L)作圖，得到的線性方程為Y=2979.6X－29159，R2=0.9995，表明在5～500μg/L范圍內(nèi)線性良好。將標準溶液逐級稀釋后測定，以3倍信噪比計算方法的檢出限(LOD)，方法的LOD為8.3μg/kg。

2.5 加標回收率及精密度實驗

選取白菜、苦苣、青椒3種空白蔬菜樣品中添加3個水平的標準溶液進行回收率實驗，每個水平重復測定5次。結果表明，各個添加水平平均回收率介于70.4%～107.6%，相對標準偏差均小于8.7%(表2)。

表2 樣品中添加TCP的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recovery rates and precision of TCP spiked samples (n=5)

2.6 實際樣品的測定

表3 TCP在蔬菜中的殘留量Table 3 Determination of TCP residue in vegetables

圖4 空白樣品的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of blank sample

于大棚苦苣上噴施推薦劑量的毒死蜱，并分別于施藥后2h、1d、5d采集蔬菜樣品，按照本實驗所述方法測定TC P含量，結果見表3，色譜圖見圖4、5。

圖5 蔬菜樣品的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatogram of vegetable samples

3 結 論

建立一種以氣相色譜-質(zhì)譜技術檢測蔬菜中農(nóng)藥毒死蜱代謝物3,5,6-三氯-2-羥基吡啶(TCP)的方法。用丙酮超聲提取樣品中的TCP，濃縮提取液后調(diào)節(jié)溶液酸堿性，經(jīng)液液萃取進行凈化，再經(jīng)硅烷化試劑衍生，G C-M S法檢測。建立的方法能保證將水分完全去除，簡單易行，方法的準確度與精密度良好，檢出限為8.3μg/kg，可用于蔬菜樣品中TCP的分析。

[1] 吳華, 李冰清, 林瓊芳, 等. 毒死蜱在豆角、辣椒和土壤中的殘留動態(tài)[J]. 農(nóng)藥, 2007, 46(11): 765-769.

[2] 陳振德, 陳雪輝, 馮明祥, 等. 毒死蜱在菠菜中的殘留動態(tài)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2005, 24(4): 728-731.

[3] 劉國光, 徐海娟, 王莉霞, 等. 毒死蜱對淡水原生動物群落的急性毒性[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2004, 23(4): 814-817.

[4] MORGAN M K, SHELDON L S, CROGHAN C W, et al. Exposures of preschool children to chlorpyrifos and its degradation product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol in their everyday environments[J]. Journal of Exposure Analysis and Environmental Epidemiology, 2005, 15: 297-309.

[5] SARDAR D, KOLE R K. Metabolism of chlorpyrifos in relation to its effect on the availability of some plant nutrients in soil[J]. Chemosphere, 2005, 61: 1273-1280.

[6] CACERES T, HE Wenxiang, NAIDU R, et al. Toxicity of chlorpyrifos and TCP alone and in combination to Daphnia carinata: the influence of microbial degradation in natural water[J]. Water Research, 2007, 41: 4497-4503.

[7] RANDHAWA M A, ANJUM F M, AHMED A, et al. Field incurred chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol residues in fresh and processed vegetables[J]. Food Chemistry, 2007, 103: 1016-1023.

[8] BYRNE S L, PINKERTON S L. The effect of cooking on chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol levels in chlorpyrifos-fortified produce for use in refining dietary exposure[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52: 7567-7573.

[9] BASKARAN S, KOOKANA R S, NAIDU R. Contrasting behaviour of chlorpyrifos and its primary metabolite, TCP(3,5,6-trichloro-2-pyridinol), with depth in soil profiles[J]. Australian Journal of Soil Research, 2003, 41(4): 749-760.

[10] BICKER W, LAMMERHOFERA M, GENSER D, et a1. A case study of acute human chlorpyrifos poisoning: novel aspects on metabolism and toxicokinetics derived from liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis of urine samples[J]. Toxicology Letters, 2005, 159(3): 235-251.

[11] 韓暢, 朱魯生, 王軍, 等. HPLC測定水體中毒死蜱及其有毒降解產(chǎn)物TCP[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2009, 28(7): 1552-1556.

[12] CHUANG J C, van EMON J M, REED A W, et a1. Comparison of immunoassay and gas chromatography-mass spectrometry methods to measuring 3,5,6-trichloro-2-pyridinol in multiple sample media[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 517(1/2): 177-185.

[13] 汪正范, 楊樹民, 吳侔天, 等. 色譜聯(lián)用技術[M]. 2版. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2007: 78.

[14] INMAN R D, KIIGEMAGI U, DEINZER M L. Determination of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol residues in peppermint hay and peppermint oil[J]. J Agric Food Chem, 1981, 29: 321-323.

[15] DISHBURGER H J, MCKELLAR R L, PENNINGTON J Y, et al. Determination of residues of chlorpyrifos, its oxygen analogue, and 3,5, 6-trichloro-2-pyridinoiln tissues of cattle fed chlorpyrifos[J]. J Agric Food Chem, 1977, 25(6): 1325-1329.

[16] BARR D B, NEEDHAM L L. Analytical methods for biological monitoring of exposure to pesticides: a review[J]. Journal of Chromatography B, 2002, 778: 5-29.

[17] 凌云, 王菡, 雍煒, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測蔬菜中的毒死蜱及其代謝物[J]. 色譜, 2009, 27(1): 78-81.

[18] SCHUMMER C, DELHOMME O, BRICE M R, et al. Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds prior to GC/MS analysis[J]. Talanta, 2009, 77: 1473-1482.

Determination of 3, 5, 6-Trichloro-2-pyridinol in Vegetables by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

XIE Juan1,2，WANG Yan-hong1,*，WANG Shi-cheng1，ZHANG Hong1，WANG Ying1，WANG Shan-shan1
(1. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China；2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was established for the determination of 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP), a kind of metabolite of chlorpyrifos in vegetables. The sample was extracted by acetone, and the extract was purified using hexane and DCM. The water was removed with anhydrous sodium sulfate. After condensation, the extract was dissolved into 1 mL of ethyl acetate and then derivatized with N-(tert-butyldimethylsilyl)-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA), and finally the volume was adjusted to 1 mL using hexane. The analyte was detected by GC-MS, and an external standard method was used for quantifying TCP. The limit of detection was 8.3 μg/kg, and the recovery rates of spiked sample were in the range of 70.4%－107.6% with relative standard deviation of 4.3%－8.7%. An excellent linear relationship was achieved in the range of 5－500 μg/L with correlation coefficients over 0.99. This method is characteristics of accuracy, easy operation and can be applied for determining TCP in vegetables.

gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；3,5,6-trichloro-2-pyridinol；vegetables

O657.73

A

1002-6630(2010)24-0277-04

2010-02-01

財政部社會公益研究項目(2007-10)；沈陽市科技支撐計劃項目(1081197-3-00)

謝娟(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測技術。E-mail：xiej@iae.ac.cn

*通信作者：王顏紅(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品檢測與風險評估技術。E-mail：wangyh@iae.ac.cn