謝 娟，王顏紅*，王世成，張 紅，王 瑩，王姍姍

(1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049)

GC-MS法測(cè)定蔬菜中3,5,6-三氯-2羥基吡啶

謝 娟1,2，王顏紅1,*，王世成1，張 紅1，王 瑩1，王姍姍1

(1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049)

建立蔬菜中毒死蜱代謝物3,5,6-三氯-2羥基吡啶(3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP)的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)丙酮提取，正己烷去除雜質(zhì)，二氯甲烷反萃取，過(guò)無(wú)水硫酸鈉去除水分，濃縮后乙酸乙酯溶解，再用N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)衍生，正己烷定容，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量。方法的檢出限為8.3μg/kg，加標(biāo)回收率為70.4%～107.6%，RSD為4.3%～8.7%。在5～500μg/L的范圍內(nèi)線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99。該方法通用性強(qiáng)，靈敏度高，可用于蔬菜中TCP的檢測(cè)。

氣相色譜-質(zhì)譜；3,5,6-三氯-2羥基吡啶；蔬菜

毒死蜱是一種低毒、廣譜的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，在農(nóng)業(yè)和家庭中使用廣泛。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于毒死蜱的殘留、毒性及降解方面的研究比較多[1-3]。已有研究表明，毒死蜱在環(huán)境(土壤、水體、空氣等)以及動(dòng)植物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為3,5,6-三氯-2羥基吡啶(3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP)[4-6]，正常噴施毒死蜱后，空氣、蔬菜中均能檢出TCP[4,7]；含有毒死蜱的蔬菜加熱后會(huì)有一部分毒死蜱轉(zhuǎn)化生成TCP[8]。TCP具有毒性，甚至毒性比毒死蜱大，Baskaran等[9]發(fā)現(xiàn)TCP對(duì)土壤微生物的毒性影響比毒死蜱更高，在Microtox系統(tǒng)中TCP對(duì)土壤細(xì)菌群落的毒性是毒死蜱的2.5倍；Caceres等[6]發(fā)現(xiàn)TCP對(duì)水虱的毒性比毒死蜱大，且兩者有協(xié)同作用。TCP對(duì)人體健康的潛在威脅也引起了學(xué)者的重視[4]。鑒于食品，尤其是蔬菜是人體攝入TCP的主要途徑，有必要對(duì)蔬菜中TCP的殘留量進(jìn)行監(jiān)控，首要的是建立一種簡(jiǎn)便、快捷、高靈敏度的檢測(cè)方法。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道TCP的檢測(cè)主要采用液相-質(zhì)譜法(LC-MS)[10]、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[11]、酶聯(lián)免疫(ELISA)[12]等，這些報(bào)道大多以動(dòng)物血液及尿液樣品作為研究對(duì)象，而食品，尤其是蔬菜中TCP的分析方法則鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立一種蔬菜中TCP的GC-MS檢測(cè)方法，為監(jiān)測(cè)TCP在蔬菜中的殘留情況提供測(cè)定方法參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TCP標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%) 美國(guó)Accustandard公司；N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA) 美國(guó)ACROS公司。

丙酮、乙酸乙酯、正己烷(均為分析純) 天津博迪公司化學(xué)試劑公司；無(wú)水硫酸鈉：650℃灼燒4h，貯于干燥器中備用；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由純水發(fā)生器制得。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE GC氣相色譜(Finnigan TRACE DSQ 四級(jí)桿質(zhì)譜儀配有電子電離源及Xcalibar 質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)) 美國(guó)Finnigan公司；電熱恒溫箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 日本東京理化器械株式會(huì)社；KQ-250B型超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX GENIUS3渦旋混合器 IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將蔬菜可食部位粉碎后，取2g置于具塞三角瓶中，加入30mL丙酮，超聲30min。過(guò)濾，濾液于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入15mL超純水，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的 NaOH溶液調(diào)pH≥12，再加入3×15mL正己烷渦旋萃取。靜置10min分層，棄去正己烷層，下層水相加入濃HCl調(diào)pH≤2。加入15mL CH2Cl2渦旋萃取，靜置10min分層，棄去上層水相，重復(fù)操作3次，合并有機(jī)層，過(guò)無(wú)水Na2SO4漏斗。濾液于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干。殘?jiān)?mL乙酸乙酯充分溶解后，取0.1mL乙酸乙酯溶液，加入5μL MTBSTFA，混合均勻，置于50℃恒溫箱中衍生1h后迅速冷卻，正己烷定容至1 m L，待測(cè)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP DB-5MS 石英毛細(xì)柱(30m×0.25mm，0.25μm)；升溫程序：初始溫度為70℃，保持2min后以20℃/min速率升至250℃，保持2min后再以20℃/min速率升溫至300℃，保持3min。進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1μL；載氣：氦氣，純度＞99.99%，流速1.0mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊離子化(EI)；電子能量70eV；接口溫度250℃；離子源溫度200℃；測(cè)定方式：選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

以回收率為指標(biāo)，比較在實(shí)際應(yīng)用中最常用的幾種提取劑甲醇、乙酸乙酯、丙酮的超聲提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3種提取劑的平均回收率為41.5%、65.7%、80.2%。另外，由于甲醇極性較強(qiáng)，可對(duì)農(nóng)藥充分提取，但也能提取出大量的色素雜質(zhì)，給下一步的凈化帶來(lái)困難。綜合考慮提取效率及凈化等因素，選取丙酮為提取溶劑。

2.1.2 水分去除

MTBSTFA屬硅烷化試劑的一種，遇水迅速分解[13]，因此前處理中水分的去除極其關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)在提取、凈化之后，衍生反應(yīng)之前將提取液過(guò)無(wú)水硫酸鈉漏斗，能夠保證水分去除完全，且不影響回收率。

2.1.3 樣品凈化

蔬菜樣品中的主要雜質(zhì)為色素，為避免背景干擾以及減少對(duì)檢測(cè)器的污染，需對(duì)提取液進(jìn)行凈化。目前使用較多的固相萃取方法雖然凈化效果較好，但成本較高。由于TCP具有弱酸性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩次調(diào)節(jié)溶液pH值，利用酸堿萃取的方法使目標(biāo)物與雜質(zhì)在有機(jī)相和水相中實(shí)現(xiàn)不同的分配而達(dá)到分離、凈化的效果。實(shí)驗(yàn)表明，該方法能去除樣品中絕大部分色素，可滿足GC-MS檢測(cè)的需要。

2.2 衍生條件的確定

TCP為毒死蜱的代謝產(chǎn)物，其性質(zhì)穩(wěn)定，不容易被氣化，需要衍生才能進(jìn)行氣相色譜分析。已報(bào)道的衍生化方法以硅烷化為主，使用的硅烷化試劑主要有BSA和MTBSTFA[14-16]。在檢出限以及回收率方面，使用MTBSTFA的效果均好于BSA，因此，本實(shí)驗(yàn)采用MTBSTFA進(jìn)行衍生(圖1)。

圖1 TCP的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatization of TCP

有關(guān)衍生時(shí)間及衍生溫度的優(yōu)化已有相關(guān)的研究，參考已有報(bào)道[17]，采用50℃衍生1h的方法。另外，為保證衍生反應(yīng)充分、完全，比較溶劑與衍生試劑的比例分別為100:1、50:1、40:1、20:1和10:1時(shí)的衍生效率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 溶劑與衍生試劑不同體積比條件下的衍生效率Table 1 Derivatization efficiency in different volume ratios

由表1可看出，溶劑與衍生試劑的比例為20:1及10:1時(shí)，衍生效率較好，而高于40:1，衍生效率不到65%。這可能是由于當(dāng)溶劑體積遠(yuǎn)大于衍生試劑時(shí)，盡管衍生試劑相對(duì)于TCP是過(guò)量的，但MTBSTFA分散在溶劑中，含量太低，與TCP反應(yīng)的幾率較小。結(jié)合衍生效率及節(jié)約試劑的考慮，確定溶劑與衍生試劑的比例為20:1。

2.3 質(zhì)譜條件選擇

通過(guò)對(duì)GC-MS全掃獲得的TCP衍生物總離子流色譜圖及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖的分析，選擇豐度高、干擾低的特征離子作為SIM定量離子，以期獲得較高的靈敏度；同時(shí)選擇2個(gè)質(zhì)量數(shù)和豐度較高、干擾較低的特征離子作為定性離子，通過(guò)對(duì)2個(gè)定性離子豐度比例的分析實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的定性。TCP衍生物的總離子流色譜圖及質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2、3。本實(shí)驗(yàn)選擇的定量離子為m/z 254(相對(duì)豐度100%)，定性離子為m/z 256(次強(qiáng)峰，同位素峰，相對(duì)豐度89%)和m/z 93(相對(duì)豐度55%)。結(jié)合文獻(xiàn)[18]及硅烷化試劑衍生的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可判斷TCP衍生物質(zhì)譜中，基峰m/z 254為[M－57]+，豐度較強(qiáng)的m/z 93為碎片離子。

圖2 TCP標(biāo)樣衍生物的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram for the derivatives of standard TCP

圖3 TCP標(biāo)樣衍生物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of the derivatives of standard TCP

2.4 方法線性范圍及檢出限

在本方法確定的色譜、質(zhì)譜條件下，對(duì)配制的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法對(duì)TCP進(jìn)行定量，以其峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，μg/L)作圖，得到的線性方程為Y=2979.6X－29159，R2=0.9995，表明在5～500μg/L范圍內(nèi)線性良好。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋后測(cè)定，以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(LOD)，方法的LOD為8.3μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

選取白菜、苦苣、青椒3種空白蔬菜樣品中添加3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果表明，各個(gè)添加水平平均回收率介于70.4%～107.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.7%(表2)。

表2 樣品中添加TCP的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recovery rates and precision of TCP spiked samples (n=5)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

表3 TCP在蔬菜中的殘留量Table 3 Determination of TCP residue in vegetables

圖4 空白樣品的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of blank sample

于大棚苦苣上噴施推薦劑量的毒死蜱，并分別于施藥后2h、1d、5d采集蔬菜樣品，按照本實(shí)驗(yàn)所述方法測(cè)定TC P含量，結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖4、5。

圖5 蔬菜樣品的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatogram of vegetable samples

3 結(jié) 論

建立一種以氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥毒死蜱代謝物3,5,6-三氯-2-羥基吡啶(TCP)的方法。用丙酮超聲提取樣品中的TCP，濃縮提取液后調(diào)節(jié)溶液酸堿性，經(jīng)液液萃取進(jìn)行凈化，再經(jīng)硅烷化試劑衍生，G C-M S法檢測(cè)。建立的方法能保證將水分完全去除，簡(jiǎn)單易行，方法的準(zhǔn)確度與精密度良好，檢出限為8.3μg/kg，可用于蔬菜樣品中TCP的分析。

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Determination of 3, 5, 6-Trichloro-2-pyridinol in Vegetables by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

XIE Juan1,2，WANG Yan-hong1,*，WANG Shi-cheng1，ZHANG Hong1，WANG Ying1，WANG Shan-shan1
(1. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China；2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was established for the determination of 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP), a kind of metabolite of chlorpyrifos in vegetables. The sample was extracted by acetone, and the extract was purified using hexane and DCM. The water was removed with anhydrous sodium sulfate. After condensation, the extract was dissolved into 1 mL of ethyl acetate and then derivatized with N-(tert-butyldimethylsilyl)-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA), and finally the volume was adjusted to 1 mL using hexane. The analyte was detected by GC-MS, and an external standard method was used for quantifying TCP. The limit of detection was 8.3 μg/kg, and the recovery rates of spiked sample were in the range of 70.4%－107.6% with relative standard deviation of 4.3%－8.7%. An excellent linear relationship was achieved in the range of 5－500 μg/L with correlation coefficients over 0.99. This method is characteristics of accuracy, easy operation and can be applied for determining TCP in vegetables.

gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；3,5,6-trichloro-2-pyridinol；vegetables

O657.73

A

1002-6630(2010)24-0277-04

2010-02-01

財(cái)政部社會(huì)公益研究項(xiàng)目(2007-10)；沈陽(yáng)市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1081197-3-00)

謝娟(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)技術(shù)。E-mail：xiej@iae.ac.cn

*通信作者：王顏紅(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)。E-mail：wangyh@iae.ac.cn