唐艷平，張偉敏，陳文學，李從發(fā)，苗子健，劉四新*

(海南大學食品學院，海南 海口 570228)

腰果梨渣多酚提取及抗氧化性研究

唐艷平，張偉敏，陳文學，李從發(fā)，苗子健，劉四新*

(海南大學食品學院，海南 ?？?570228)

為提高腰果梨加工的附加價值，采用響應面分析法優(yōu)化腰果梨渣多酚提取的工藝條件，并以DPPH法和ABTS+法對其多酚提取物的抗氧化性進行研究。結(jié)果表明：以體積分數(shù)40%乙醇溶液為提取劑，以經(jīng)過烘干的黃色腰果梨渣為樣品，液料比為35:1，在95℃水浴中回流提取150min，得到多酚提取得率最高為1.54%；腰果梨渣的抗氧化能力較強，其中紅色腰果梨渣對DPPH自由基的清除能力強于黃色腰果梨渣，其EC50為1.35mg/mL，而黃色腰果梨渣對ABTS+的清除作用又強于紅色腰果梨渣，其EC50為0.057mg/mL。

腰果梨渣；多酚；提??；抗氧化

腰果(Anacardium occidentaleL.)是漆樹科熱帶堅果作物，為世界著名的四大干果之一。腰果果實由腰果梨(Cashew apple)和腰果堅果(種籽，即真果)兩部分組成，腰果梨是果實發(fā)育中花托膨大形成的“假果”，外形似梨狀，果肉質(zhì)柔軟多汁，顏色主要有黃色、橙色和紅色[1]，是腰果堅果收獲時的副產(chǎn)物，但生物量約為堅果的7～9倍。由于腰果梨含有大量的酚類物質(zhì)(3%～5%)[2]，澀味較重，一般較少作為鮮果直接食用，國內(nèi)外主要是將其加工成腰果梨酒和果汁飲品[2]。

在國內(nèi)，腰果種植主要在海南和云南[3]，在海南的樂東縣種植面積曾高達8萬畝，年產(chǎn)約八千至一萬噸的腰果梨[4]，主要加工產(chǎn)品是腰果梨酒[5]。在國外，種植較多的國家有印度、巴西、越南、坦桑尼亞、莫桑比克等，如在越南的種植面積就達25.7萬公頃[6]。據(jù)研究，新鮮腰果梨在取汁過程中會產(chǎn)生大量果渣(約30%～40%)，目前沒有很好地進行利用。腰果梨果渣中除含有果膠、纖維以外，還含有較多的酚類物質(zhì)。美國曾報道分離自腰果梨汁的腰果酸已作為抑制BT20乳腺癌細胞的毒素劑[7]。因此從腰果梨以及腰果梨渣中提取多酚物質(zhì)具有重要意義。本實驗探討簡便的溶劑回流法提取腰果梨渣的多酚物質(zhì)，并且對提取物的抗氧化性進行初步研究，為腰果梨加工副產(chǎn)物的綜合利用和深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腰果梨渣：紅色腰果梨和黃色腰果梨均采自海南省腰果研究中心試驗場。鮮果經(jīng)雙螺旋壓榨機壓榨、取汁，所得果渣于電熱恒溫鼓風干燥箱中40℃烘干48h，經(jīng)粉碎機粉碎、過40目篩、得到含水量9.98%的腰果梨果渣粉，冷藏備用。

沒食子酸、BHA 國藥集團上海試劑公司；DPPH、ABTS Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-2450型紫外掃描儀 日本島津制作所；DFT-250手提式中藥粉碎機 貴州三陽包裝設(shè)備有限公司；NF-2000雙螺旋壓榨機 新鄉(xiāng)市利達輕工釀酒設(shè)備有限公司；SHZD(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英予華儀器廠；32R型冷凍離心機 德國赫得馳公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚提取物的制備

精確稱取腰果梨渣粉1.00g于圓底燒瓶中，加入一定量的提取溶劑，置一定溫度的水浴鍋中進行冷凝回流提取，一定時間后對提取液進行抽濾，濾液在40℃條件下進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮后得到粗提取物。

1.3.2 總酚含量的測定

多酚含量采用Folin-Ciocalteus法[8](簡稱FC法)測定，以沒食子酸為對照品。參照李靜等[9]的方法，以標準曲線法測定樣品多酚的含量。

1.3.3 多酚提取得率的計算

將粗提物用蒸餾水溶解、定容至100mL，用FC法測定總酚含量，并按下式計算多酚提取得率：

1.3.4 提取工藝條件的優(yōu)化

1.3.4.1 提取溶劑的選擇

精確稱取5份黃色腰果梨渣粉，每份1.00g，按每1g渣粉加提取溶劑20mL(簡稱液料比20:1，下同)的比率分別加入甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿，水浴溫度70℃，回流60min，考察不同溶劑對多酚提取得率的影響。

1.3.4.2 溶劑體積分數(shù)的選擇

精確稱取6份黃色腰果梨渣粉，每份1.00g，按液料比20:1加入上述試驗所確定的提取溶劑，回流條件同上，考察溶劑體積分數(shù)(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對多酚提取得率的影響。

1.3.4.3 提取溫度的選擇

精確稱取7份黃色腰果梨渣粉，每份1.00g，按液料比20:1分別加入上述試驗所確定的一定體積分數(shù)的提取溶劑，設(shè)定不同水浴溫度(40、50、60、70、80、90、95℃)，回流60min，考察提取溫度對多酚提取得率的影響。

1.3.4.4 回流時間的選擇

精確稱取6份黃色腰果梨渣粉，每份1.00g，按液料比20:1、按上述試驗所確定的溶劑體積分數(shù)和水浴溫度，分別回流30、60、90、120、150、180min，考察回流時間對多酚提取得率的影響。

1.3.4.5 液料比的選擇

精確稱取8份黃色腰果梨渣粉，每份1.00g，液料比分別設(shè)為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1，其余條件按上述試驗所確定的進行，考察液料比對多酚提取得率的影響。

1.3.4.6 響應面分析法優(yōu)化提取工藝

為建立上述4種提取條件與多酚提取得率之間的函數(shù)關(guān)系，以便找出最佳提取條件的組合，采用Box-Behnken中心組合法對黃色腰果梨渣進行了4因素3水平的試驗設(shè)計，以多酚提取得率為響應值進行響應面分析，試驗因素水平見表1。

表1 試驗的因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.3.5 多酚提取物抗氧化活性的測定

以獲得的最佳提取工藝分別對紅色腰果梨渣和黃色腰果梨渣進行多酚物質(zhì)的提取，然后經(jīng)抽濾、真空濃縮得到多酚粗提物，對其進行抗氧化活性評價。

1.3.5.1 對DPPH自由基清除率的測定

將0.1mL不同質(zhì)量濃度的紅色/黃色腰果梨渣提取物溶液和1.4mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加入10mL試管中，以90%乙醇稀釋到3mL，室溫條件下暗處反應30min，在517nm波長處測定吸光度(A樣品)，以90%乙醇溶液作空白對照，測得517nm處的A空白[10]。以BHA做對照，每組3個重復。

為了評價抗氧化劑的抗氧化性能和自由基的清除能力，通常選擇清除率為50%時抗氧化劑的質(zhì)量濃度(EC50)作為評價指標，EC50越小，抗氧化劑清除自由基的能力越強[11]。

1.3.5.2 對ABTS+清除率的測定

分別量取50mL 7mmol/L的ABTS溶液和880mL 140mmol/L的過硫酸鉀溶液，混勻，室溫暗處反應12～16h，使用前用無水乙醇稀釋，使吸光度在734nm波長處為0.7±0.02，得到ABTS+工作液[12]。精確量取3mL ABTS+溶液和0.5mL不同質(zhì)量濃度的紅色/黃色腰果梨渣提取物溶液，混勻，室溫反應10min，在734nm處測吸光度A樣品；精確量取3mL無水乙醇和0.5mL不同質(zhì)量濃度的3種試劑提取物溶液，在734nm處測吸光度A樣品空白；精確量取3mL ABTS+溶液和0.5mL無水乙醇，在734nm處測吸光度A模型。以BHA做對照，每組3個重復。用EC50來評價抗氧能力的強弱。

1.3.6 統(tǒng)計學分析

使用SAS 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。測定結(jié)果以平均數(shù)±標準差(x±s)表示，顯著性檢驗為t檢驗，顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標、沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。得回歸方程y=0.1611x－0.1533，R2=0.9993，結(jié)果表明多酚測定體系符合要求。

圖1 沒食子酸標準曲線圖Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 多酚提取條件的確定

2.2.1 溶劑對多酚提取得率的影響

由圖2可知，甲醇對腰果梨渣多酚的提取得率最大，而氯仿對腰果梨渣多酚的提取得率較低，說明腰果梨渣多酚物質(zhì)的極性較大。統(tǒng)計分析表明，以甲醇和乙醇進行提取、提取得率之間沒有顯著性的差異。綜合考慮，宜采用乙醇作為提取劑。

圖2 溶劑對多酚提取得率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on extraction rate of polyphenols from cashew apple pomace

2.2.2 乙醇體積分數(shù)的影響

圖3 乙醇體積分數(shù)對提取得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from cashew apple pomace

由圖3知，乙醇體積分數(shù)為40%時提取得率最大，但當乙醇體積分數(shù)增大時提取得率趨于降低?？赡艿脑蚴牵掖俭w積分數(shù)增大，糖類及其他醇溶性物質(zhì)溶出增加，而這些化合物與多酚物質(zhì)競爭乙醇-水結(jié)合。溶劑體積分數(shù)增大時，溶劑與多酚極性相差較大，不利于多酚物質(zhì)提出，從而降低了提取得率。故選用40%的乙醇作為提取溶劑。

2.2.3 提取溫度的影響

圖4 水浴溫度對提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polyphenols from cashew apple pomace

由圖4可見，提取溫度對提取得率影響較大，在90℃時提取得率達到最大，但若溫度過高，熱不穩(wěn)定性的成分或揮發(fā)性成分易被破壞或揮發(fā)損失[13]，提取得率有所下降，故選90℃進行提取。

2.2.4 回流時間的影響

由圖5可以看出，隨著回流時間的延長，多酚提取得率逐漸增加。當回流150min時，腰果梨渣多酚提取得率達到最大。這可能是由于溶劑滲透到物料中需要一定的時間，而這個時間會受酚類物質(zhì)在物料和溶劑之間的傳質(zhì)速度影響；時間過短提取不充分，而時間過長、酚類物質(zhì)會因氧化損失而降低得率。因此宜選用150min進行回流提取。

圖5 回流時間對提取得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from cashew apple pomace

2.2.5 液料比的影響

圖6 液料比對提取得率的影響Fig.6 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of polyphenols from cashew apple pomace

由圖6可看出，隨著液料比的增大，多酚提取得率逐漸增加。當液料比為35:1時腰果梨渣多酚提取得率達到最大；液料比為40:1多酚提取得率開始下降。在固液提取中，物料與溶劑間的濃度差是提取過程的一種推動力。在提取中保持一定的濃度差，將有利于提高提取率。一般地，溶劑越多，被浸提出的物質(zhì)就越多，而當物質(zhì)擴散達到平衡時，更多的溶劑并不會使浸出物增加[14]，且液料比過大、不利于溶劑回收，還造成浪費。因此宜選35:1的液料比。2.2.6 響應面分析法優(yōu)化提取工藝

2.2.6.1 響應面分析結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對乙醇體積分數(shù)、提取溫度、回流時間和液料比等因素分別確定了3個水平值，以黃色腰果梨渣多酚提取率進行響應面試驗設(shè)計，結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

通過SAS 9.0軟件進行二次響應面回歸分析，得到多元二次響應面回歸模型為：

該回歸模型的方差分析見表3。

從表3可知，該模型P=0.0001，表示模型影響極顯著，失擬項P=0.402，說明該模型擬合程度較高，模型的確定系數(shù)R為0.9551，說明該模型可以解釋95.51%響應值的變化，僅有總變異約5%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度較好，模型可靠。

2.2.6.2 驗證實驗

運用Lingo 9.0軟件求解上述方程，得出最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)40%、提取溫度95℃、提取時間150min、液料比35:1。計算的腰果梨渣多酚提取得率的理論值為1.59%。驗證時以此最佳工藝條件對黃色腰果梨渣進行了多酚提取，設(shè)3個平行，測得實際提取得率平均為1.54%，說明實際測定結(jié)果與模型計算結(jié)果良好符合。表明采用SAS響應面分析法優(yōu)化獲得的腰果梨渣多酚提取的最佳工藝條件準確可信。

2.3 抗氧化活性評價

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用

根據(jù)清除率和抗氧化劑質(zhì)量濃度的線性關(guān)系，得到紅色腰果梨渣、黃色腰果梨渣和BHA的EC50(表4)，可知腰果梨渣多酚提取物對DPPH自由基均具有一定的清除作用，且紅色腰果梨渣提取物對DPPH自由基的清除能力比黃色腰果梨渣提取物要強，但是都略低于對照品BHA對DPPH自由基的清除能力。其可能的原因之一是對照品為純度較高的化學試劑，二是本實驗多酚提取物中還含有較多雜質(zhì)和水分。

表4 兩種提取物對DPPH自由基的清除率與抗氧化劑質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 4 Linear relationship between DPPH free radical scavenging rate and antioxidant concentration of two extracts from cashew apple pomace

2.3.2 對ABTS+的清除作用

用EC50表示對ABTS+清除率的強弱。根據(jù)清除率和抗氧化劑質(zhì)量濃度的線性關(guān)系，得到紅色腰果梨、黃色腰果梨和BHA的EC50(表5)，可知黃色腰果梨渣提取物對ABTS+的清除作用強于紅色腰果梨渣提取物對ABTS+的清除作用。

表5 兩種提取物對ABTS+的清除率與抗氧化劑質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 5 Linear relationship between ABTS free radical scavenging rate and antioxidant concentration of two extracts from cashew apple pomace

3 結(jié)論與討論

本實驗通過響應面分析的Box-Behnken中心組合模型優(yōu)化了腰果梨渣的多酚提取工藝、并對提取物進行了抗氧化活性評價。結(jié)果表明，以烘干的黃色腰果梨渣為樣品，以40%的乙醇溶液為提取劑，液料比為35:1，在95℃水浴中冷凝回流提取150min，在此條件下腰果梨渣多酚提取得率為1.54%。

該提取率1.54%比高暢等[15]用纖維素酶輔助乙醇超聲提取藍莓果渣的多酚提取率0.43%、綦菁華等[16]提取蘋果皮渣多酚的提取率1.31%、葛蕾[17]用超聲提取蘋果渣多酚的提取率為0.24%均要高。這可能是因為一方面由于腰果梨渣樣品本身多酚含量較高，另一方面由于對原料的前處理方式以及提取的方法和工藝參數(shù)有所不同。本研究所用的乙醇回流提取法簡便、安全、高效，更易于實現(xiàn)大規(guī)模推廣應用。

采用對DPPH自由基清除率和對ABTS+清除率初步評價了腰果梨渣多酚提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，紅色腰果梨渣和黃色腰果梨渣提取物對DPPH自由基和ABTS+均具有一定的清除率。紅色腰果梨渣提取物對DPPH自由基的清除能力比黃色腰果梨渣提取物要強，其EC50為1.35mg/mL；但是黃色腰果梨渣提取物對ABTS+的清除作用強于紅色腰果梨渣提取物對ABTS+的清除作用，其中EC50為0.057mg/mL，比韓林等[18]研究的檳榔多酚提取物對ABTS+的清除作用EC50為0.091mg/mL要強。

腰果梨渣提取物的抗氧化性均略低于對照品BHA的抗氧化活性，這可能與腰果梨渣粗提物中主要活性物質(zhì)的純度有關(guān)。紅色腰果梨渣和黃色腰果梨渣多酚提取物對DPPH自由基清除率和對ABTS+清除率的結(jié)果呈現(xiàn)不平行現(xiàn)象的原因有待進一步研究，可能與品種因素、日照、土壤等生理因素對酚類物質(zhì)的組成產(chǎn)生影響有關(guān)，下步擬采用其他抗氧化能力評價體系進一步研究、以及對不同品種腰果梨酚類成分的組成進行深入研究。

[1] NAIDU M, RAGHAVAN M B. A cashew apple beverage dry mix and a process for the preparation thereof[P]. USA, WO 2006/103514 A1[P].2006-10-05.

[2] SHUKLAJASHA M, PRATIMA R. Fermentation of cashew (Anacardium occidentaleL.) “apple” into wine[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2006, 30(3): 314-322.

[3] 粱李宏, 郝永祿. 滇南與滇西南地區(qū)發(fā)展腰果產(chǎn)業(yè)探討[J]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學學報, 2005, 11(3): 12-19.

[4] 呂芳德, 張日清, 李向華. 我國腰果引種現(xiàn)狀和對策[J]. 中國經(jīng)濟現(xiàn)狀與對策, 1996: 201-202.

[5] 李從發(fā), 李枚秋, 彭黎旭. 腰果梨酒的果香保持作用研究[J]. 熱帶作物學院, 1999, 9(3): 21-24.

[6] 李一. 2005年越南腰果仁出口目標為11萬噸[EB/OL].(2010-02-21)[ 2005-02-01]. http://www.agroviet.gov.vn/.

[7] IVAN R, GREEN A, FELISMINO E T, et al .Molecular design of anti-MRSA agents based on the anacardic acid scaffold[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2007, 15: 6236-6241.

[8] AMIN I, NORAZAIDAH Y, HAINIDA K. Antioxidant activity and phenolic content of raw and blanched Amaranthus species[J]. Food Chemistry, 2006, 94: 47-52.

[9] 李靜, 聶繼云, 李海飛, 等. Folin-酚法測定水果及其制品中總多酚含量的條件[J]. 果樹學報, 2008, 25(1): 126-131.

[10] KRIENGSAK T, UNAROJ B, KEVIN C. Comparison of ABTS,DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2006, 19: 669-675.

[11] LI Jiaojuan, HUANG Keying, GONG Jianliang, et al. Research on the scavenging effect of ethanol extracts from camel liaolei fera abel leaves on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2008, 28(2): 82-86.

[12] FANG Zhongxiang, ZHANG Yuhuan, YUAN Lu, et al. Phenolic compounds and antioxidant capacities of bayberry juices[J]. Food Chemistry,2009, 113: 884-8881.

[13] 何志勇. 橄欖酚類化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)研究[D]. 無錫: 江南大學, 2007.

[14] 王如, 宿文斌, 王承明, 等. 黃連木餅粕粗多酚提取的響應曲面優(yōu)化研究[J]. 食品科學, 2008, 29(7): 160-165.

[15] 高暢, 程大海, 高欣, 等. 藍莓果渣提取物總酚含量及抗氧化活性研究[J]. 植物研究, 2010, 30(2): 253-256.

[16] 綦菁華, 黃漫青, 王芳, 等. 蘋果皮渣中酚類提取及其抗氧化活性[J].北京農(nóng)學院學報, 2006, 21(2): 36-38.

[17] 葛雷. 蘋果渣多酚浸提物及抗氧化性質(zhì)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學, 2005.

[18] 韓林, 黃玉林, 張海德, 等. 檳榔籽中抗氧化成分的提取及活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(9): 157-160.

Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Cashew Apple Pomace

TANG Yan-ping，ZHANG Wei-min，CHEN Wen-xue，LI Cong-fa，MIAO Zi-jian，LIU Si-xin*
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

In order to improve the added value of cashew apple processing, the extraction process of polyphenols from cashew apple pomace was optimized by response surface methodology. Along with this, the antioxidant activity of the extract was evaluated by DPPH and ABTS free radical scavenging assays. The optimal extraction parameters were determined as follows:extraction solvent, 40% ethanol; liquid/material ratio, 35:1; reflux temperature, 95 ℃; and extraction time, 150 min. The extraction rate of polyphenols from cashew apple residue was 1.54% under these optimal extraction conditions. The ethanol extract of cashew apple pomace exhibited strong antioxidant activity. However, red cashew apple pomace exhibited stronger DPPH free radical scavenging capacity than yellow cashew apple pomace. In reverse, yellow cashew apple pomace exhibited stronger ABTS free radical scavenging capacity than red cashew apple pomace. The EC50 values of red cashew apple pomace for DPPH free radicals and of yellow cashew apple pomace for ABTS free radicals were 1.35 mg/mL and 0.057 mg/mL,respectively.

cashew apple pomace；polyphenols；extraction；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-6630(2010)20-0240-06

2010-06-29

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAD76B04)；?？谑懈咝录夹g(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(?？屏2009])

唐艷平(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為天然活性成分。E-mail：tangxiaoping02@163.com

*通信作者：劉四新(1966—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：liusixin@21cn.com