胡振珠，楊賢慶*，馬海霞，李來好，吳燕燕，石 紅

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201300)

羅非魚骨粉制備氨基酸螯合鈣及其抗氧化性研究

胡振珠1,2，楊賢慶1,*，馬海霞1，李來好1，吳燕燕1，石 紅1

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201300)

利用羅非魚魚排、魚頭酶解獲得魚骨粉和復合氨基酸液，然后以羅非魚骨粉的酸解液為鈣源，與復合氨基酸液進行螯合反應制備氨基酸螯合鈣，并對其抗氧化性進行研究。在單因素試驗的基礎上采用多元線性回歸正交組合試驗，以螯合率為指標，研究復合氨基酸液與羅非魚骨粉的螯合條件。結(jié)果顯示：pH7.0、反應時間90min、反應溫度60℃、氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度1.6g/L，產(chǎn)品螯合率為57.22%?？寡趸芯拷Y(jié)果表明，在一定的體積范圍內(nèi)，氨基酸螯合鈣濃縮液的還原力隨著其體積的增大而增大。氨基酸螯合鈣濃縮液對羥自由基的清除率和對超氧陰離子自由基的抑制率分別為6.60%和51.67%。

羅非魚魚骨粉；復合氨基酸液；氨基酸螯合鈣

科學研究表明鈣是人體中極為重要的金屬元素[1]，它是骨骼、牙齒的重要組成物質(zhì)，同時對于血液的凝結(jié)，體內(nèi)一些重要酶的活化，維持神經(jīng)的傳導功能，調(diào)節(jié)肌肉的伸縮性，保持毛細血管的滲透壓，體內(nèi)的酸堿平衡等方面都起著非常重要的作用。氨基酸螯合鈣作為新一代補鈣產(chǎn)品，它具有穩(wěn)定的化學性能，較高的生物效價，無毒、無刺激作用，適口性好[2-4]等優(yōu)點，是較為理想的人和動物鈣補充劑。

近幾年來，隨著羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，加工羅非魚的下腳料(魚排、魚頭)的數(shù)量也在不斷地增加，如何綜合利用這些廢棄物，增加附加值，減少環(huán)境污染是今后要解決的難題。本實驗以羅非魚下腳料為原材料，酶解獲得魚骨粉和復合氨基酸液，通過酸解魚骨粉獲得鈣源，并與復合氨基酸液反應生成氨基酸螯合鈣。以螯合率為指標，研究初始pH值、反應溫度、反應時間、氨基態(tài)氮濃度等各個條件對螯合反應的影響，從而確定最佳的工藝條件，旨在為羅非魚排的綜合利用提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復合氨基酸液(自制)；羅非魚魚骨粉(自制)；鹽酸、高氯酸、濃硫酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鄰氮二菲、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

TD5A-WS離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器有限公司；DK-S 24型恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；DHG-9145型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科技術有限公司；EYELA N-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 托普儀器有限公司；GENESYS 5 紫外-可見分光光度計 北京順達杰欣科隆科技有限公司；Titrando 835 智能電位滴定儀 瑞士萬通中國有限公司；AA240FS 原子吸收分光光度計 美國瓦里安技術有限公司；ICS 3000 離子色譜 Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 復合氨基酸液的制備[5]

將羅非魚下腳料洗凈，用保鮮袋分裝，放入冰箱(－20℃)中保存。酶解時，將原料取出用自來水解凍，然后加入一定量的水，按原料的質(zhì)量加入1.5%～2%風味蛋白酶和胰蛋白酶復合酶(比例1:3)，在pH7.0，溫度50℃條件下酶解4h，水解完成后在90℃下加熱15min滅酶，離心所得的酶解液即為復合氨基酸液。

1.3.2 魚骨粉的制備[6]

在復合氨基酸液制備中，離心后剩下的沉淀即為骨渣。用清水將骨渣洗凈，高溫高壓蒸煮30min，在75℃烘2.5h，然后放在干燥器中冷卻至常溫，用粉碎機粉碎得到所需魚骨粉。

1.3.3 魚骨中鈣含量的測定

溶液中游離鈣離子的測定：離子色譜法[7]；溶液中總鈣含量的測定：原子吸收法[8]；溶液中螯合鈣的測定：溶液中的總鈣減去溶液中游離的鈣離子[9-10]。

1.3.4 復合氨基酸螯合鈣制備

1.3.4.1 工藝流程[11]

1.3.4.2 螯合率的測定

式中：W1為魚骨粉酸解液中游離鈣離子含量/(mg/L)；W2為氨基酸螯合液中總鈣含量(mg/L)；W3為氨基酸螯合液中游離鈣離子含量/(mg/L)。

1.3.4.3 單因素試驗

魚骨粉酸解液(鈣含量一定)中加入不同氨基態(tài)氮濃度的復合氨基酸液，在不同溫度、不同pH值下反應一定時間后測定螯合率。研究氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度、pH值、反應溫度及反應時間對螯合率的影響。

1.3.4.4 多元線性回歸設計方案[12]

在單因素試驗的基礎上，以螯合率為指標，對復合氨基酸液濃度、pH值、反應溫度及反應時間這4個主要因素進行多元線性回歸設計。試驗因素及水平表如表1所示。

表1 元線性回歸設計因素與水平表Table 1 Factors and levels in the multiple linear regression design

1.3.5 螯合液還原能力的測定[13]

取不同體積的提取液，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和1g/100mL鐵氰化鉀各2.50mL并混合均勻，混合液在50℃保溫20min后加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸，混合后在3000r/min離心10min，取上清液2.50mL，加入2.50mL蒸餾水及0.50mL 0.1g/mL的FeCl3溶液。測定反應液在700nm波長處的吸光度。吸光度的大小表示還原能力的大小。

1.3.6 氨基酸螯合鈣濃縮液對羥自由基清除率的測定[14]

氨基酸螯合鈣濃縮液實驗方案見表2。

表2 羥自由基清除率的測定條件Table 2 Multiple linear regression design layout and experimental results

1.3.7 氨基酸螯合鈣濃縮液對超氧陰離子自由基抑制率的測定[15]

利用O2－·抑制劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在波長320nm處的吸收峰受到抑制這一特點，進行光化學方法間接測定O2－·的抑制率。方法如下：25℃，體系中0.1mL的氨基酸螯合鈣濃縮液，再加入2.8mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液，振蕩混勻，在25℃下水浴保溫10min。再加入0.1mL 3mmol/L鄰苯三酚溶液(在25℃水浴預熱)，迅速混勻并開始計時，320nm處測定吸光度，每隔30s讀取A320，5min后結(jié)束。以0.1mL去離子水加2.8mL 0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.2)調(diào)零。做吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V，按照下式計算樣品對超氧陰離子自由基抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同pH值對螯合反應的影響

圖1 pH值對螯合率的影響Fig.1 Effect of pH on calcium chelation rate

由圖1可知，在酸性比較強的條件下螯合率很低，在pH6～8范圍內(nèi)時螯合率較高，螯合率為31.26%～36.24%范圍之間，在堿性比較強的情況下螯合率也比較低。其原因可能是當反應液中存在大量的H+，H+需要大量的供電基團以形成穩(wěn)定的物質(zhì)，與Ca2+爭奪供電基團，從而會減少Ca2+的供電基團，減少螯合物的形成[16]。在堿性比較強的情況下，OH－與鈣離子形成的氫氧化鈣沉淀，其穩(wěn)定系數(shù)大于螯合鈣，從而大大減少了螯合鈣的形成。

2.1.2 不同螯合溫度對螯合反應的影響

由圖2可知，溫度對螯合率的影響非常顯著，在溫度比較低的情況下，螯合率比較低，在溫度60℃時螯合率最高，為54.74%。而高于60℃時，螯合率開始下降。由此可見，在溫度比較低的情況下，反應體系提供的能量不夠，不能使反應充分進行，從而導致螯合率的相應減小。在溫度較高時，反應體系產(chǎn)生的螯合物在高溫下會發(fā)生一定程度的分解，減少了螯合物的形成，導致螯合率的下降[17]。

圖2 溫度對螯合率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on calcium chelation rate

圖3 時間對螯合率的影響Fig.3 Effect of reaction time on calcium chelation rate

2.1.3 不同反應時間對螯合反應的影響由圖3可知，隨著時間的延長，螯合率在不斷上升，當反應時間為90min，螯合率達到最大55.62%。之后，隨著時間的延長，螯合率開始下降，當反應時間為120min，反應基本上達到平衡。當反應時間延長為150min，螯合率沒有太大的變化。在反應時間相對比較短的情況下，螯合反應沒有充分完成，因而螯合率相對較小。在反應時間相對較長的情況下，螯合產(chǎn)物會有一定程度的分解，從而導致螯合率的下降。

2.1.4 氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度對螯合反應的影響

圖4 氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度對螯合率的影響Fig.4 Effect of amino nitrogen content on calcium chelation rate

由圖4可知，當氨基態(tài)氮濃度較低時，螯合率也較低，但隨著氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度的上升，螯合率在不斷上升，當氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.6g/L時，螯合率達到最大，為56.62%。當氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度大于1.6g/L時，螯合率反而下降，其原因可能是氨基酸與鈣的螯合反應存在一個最適比例，大于或小于這個最適比例都會影響螯合率的大小。

2.2 多元線性回歸試驗結(jié)果及分析

表3 多元線性回歸試驗結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the developed regression model

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

采用多元線性回歸試驗設計，結(jié)果見表3。應用SPSS軟件分析，得到螯合率與因素編碼值之間的回歸方程：Y=53.09＋1.22X1＋1.38X2－0.29X3＋1.60X4。從表4可以看出，回歸模型的F值為4.9，P＜0.05，說明所得的回歸方程擬合較好，回歸效果顯著，因此用此回歸方程模型來模擬pH值、溫度、時間、氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度這4因素與指標值之間的關系是可行的。通過單因素試驗和多元線性回歸正交組合設計試驗的綜合對比，優(yōu)化得到螯合率較高的最佳工藝為多元線性回歸正交組合設計中的第9組，即pH7.0、溫度60℃、時間90min、氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度1.6g/L，此條件下，產(chǎn)品螯合率為57.22%。

2.3 氨基酸螯合鈣濃縮液抗氧化能力的研究

2.3.1 氨基酸螯合鈣濃縮液還原能力的測定結(jié)果

圖5 氨基酸螯合鈣濃縮液還原能力測定Fig.5 Reducing power evaluation of condensed amino acid chelated calcium solution obtained

由圖5可看出，在0.1～0.7mL體積范圍內(nèi)，氨基酸螯合鈣濃縮液的還原能力隨著體積的增大呈緩慢上升趨勢。當體積大于0.7mL時，氨基酸螯合鈣濃縮液的還原能力隨著體積的增大呈快速上升趨勢。這可能是反應存在累積效應，當積累到一定量程度時，反應會突破閾值，速度會加快。

2.3.2 氨基酸螯合鈣濃縮液對羥自由基的清除率

圖6 氨基酸螯合鈣濃縮液對羥自由基清除率結(jié)果Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging evaluation of condensed amino acid chelated calcium solution obtained

當加入0.5mg/mL的抗壞血酸0.5mL時，對羥自由基的清除率為6.62%，氨基酸螯合鈣濃縮液對羥自由基的清除率6.60%，說明濃縮液的清除自由基的效果已經(jīng)和0.5mg/mL的抗壞血酸效果相當。

2.3.3 氨基酸螯合鈣濃縮液對超氧陰離子自由基的抑制作用

做吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V。測得反應的對照品的速率回歸方程為V對照=0.060X＋0.057(R2=0.998)，樣品的速率回歸方程V樣品=0.029X＋0.081(R2=0.999)。所以，當氨基酸螯合鈣濃縮液的加入量為0.1mL時，對超氧陰離子自由基的抑制率為51.67%。因此，氨基酸螯合鈣濃縮液對超氧陰離子的抑制率效果比較好。

3 結(jié) 論

本實驗探討了以羅非魚魚排、魚頭作為原料，通過酶解獲得魚骨粉和復合氨基酸液，以羅非魚骨粉的酸解液為鈣源與復合氨基酸液反應制備氨基酸螯合鈣工藝條件的研究。最佳制備條件為：pH7.0、反應時間90min、反應溫度60℃、氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度1.6g/L，產(chǎn)品螯合率為57.22%。同時對氨基酸螯合鈣濃縮液的抗氧化性結(jié)果表明：在一定的體積范圍內(nèi)，氨基酸螯合鈣濃縮液的還原力隨著其體積的增大而增大。氨基酸螯合鈣對羥自由基的清除率為6.60%，對超氧陰離子自由基的抑制率為51.67%。

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Preparation and Antioxidant Activity Evaluation of Amino Acid Chelated Calcium from Tilapia Scraps

HU Zhen-zhu1,2，YANG Xian-qing1,*，MA Hai-xia1，LI Lai-hao1，WU Yan-yan1，SHI Hong1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201300, China)

Through double-enzyme hydrolysis, tilapia scraps were separated into two fractions, namely a compound amino acid solution and an insoluble residue left after the hydrolysis. The residue was processed into power and further hydrolyzed acidically to offer a calcium-containing solution for the reaction with the above prepared compound amino acid solution,producing amino acid chelated calcium. The optimal chelation reaction conditions for achieving maximum chelation rate were investigated, and the reaction product was tested for its for its antioxidant activity by reducing power and free radical scavenging assays. pH of 7.0, reaction time of 90 min, reaction temperature of 60 ℃ and amino nitrogen content of 1.6 g/L were found optimal, and the resultant chelation rate was 57.22 %. The antioxidant evaluation indicated that the condensed amino acid chelated calcium solution obtained had reducing power in a positive volume-dependent fashion in a proper range. The maximum scavenging rates against hydroxyl and superoxide anion free radicals were 6.60% and 51.67%, respectively.

tilapia bone powder；compound amino acid solution；amino acid chelated calcium

TS254.4

A

1002-6630(2010)20-0141-05

2010-06-30

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD94B08)；農(nóng)業(yè)部2007年公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(3-49)；

國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目(nycytx-48)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2010GB23260577)；

廣東省科技計劃項目(2009A020700004)；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣項目(A200899B02；A200901C01)

胡振珠(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：tiger1986416@163.com

*通信作者：楊賢慶(1963—)，男，研究員，本科，研究方向為水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全。E-mail：yxqgd@163.com