徐懷德，王臨賓，張立佳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蘋果葉多酚的純化及其抗氧化性研究

徐懷德，王臨賓，張立佳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

對(duì)蘋果葉多酚的純化及其抗氧化性進(jìn)行研究。采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚進(jìn)行初步純化、Sephadex LH-20進(jìn)一步精制，并進(jìn)行高效液相分析。結(jié)果表明X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚有較好的吸附解吸效果，X-5樹(shù)脂純化蘋果葉多酚的條件為上柱液質(zhì)量濃度3.658mg/mL、上柱液pH3、吸附流速2.0mL/min；以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇為解吸劑，洗脫流速1.0mL/min，洗脫體積4BV。在此條件下純化后的蘋果葉多酚的純度從10.07%提高到38.55%；X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附為放熱過(guò)程，吸附過(guò)程符合Langmuir等溫吸附模型和Freundlich等溫吸附模型。經(jīng)過(guò)X-5樹(shù)脂純化后的蘋果葉多酚對(duì)DPPH自由基和NO2－·的清除能力有所增強(qiáng)；蘋果葉中根皮苷的含量為2.45%，粗提物經(jīng)過(guò)X-5樹(shù)脂純化和Sephadex LH-20精制后得到的蘋果葉多酚精制品中根皮苷的含量為47.61%，占制品中總多酚的91.51%。

蘋果葉；多酚；大孔吸附樹(shù)脂；抗氧化性；根皮苷

蘋果葉為薔薇科植物蘋果(Malus pumilaMill.)的葉，性味苦寒，涼血解毒?！兜崮媳静荨酚涊d：敷臍上治陰癥，又治產(chǎn)后血迷，經(jīng)水不調(diào)，蒸熱發(fā)燒，服之神效；貼火毒瘡或湯火，燒灰調(diào)油搽之最良[1]。我國(guó)是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的40%[2]。其中遼寧、河北、山西、陜西、甘肅、山東等為主要的蘋果產(chǎn)地，目前僅陜西省蘋果葉產(chǎn)量400萬(wàn)噸，大量蘋果葉腐爛，未得到開(kāi)發(fā)利用。

蘋果多酚具有抗氧化[3]、抗過(guò)敏、抗齲齒、降低膽固醇、防治心腦血管疾病[4]、抗突變、抗癌、抑制血壓上升和提高人體應(yīng)變能力等作用[5-7]。根皮苷(phlorizin)主要存在于蘋果樹(shù)的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實(shí)中，具有調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)心臟及清除體內(nèi)自由基等作用，根皮苷可以減少小腸對(duì)葡萄糖的吸收和增加腎臟分泌排除葡萄糖，從而有降低血糖水平的作用。董華強(qiáng)等[8]研究結(jié)果證明多穗柯根皮苷對(duì)糖尿病防治有明顯作用。

大孔吸附樹(shù)脂具有物理、化學(xué)穩(wěn)定性高，選擇性好，吸附容量大，易洗脫再生等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物提取分離中得到廣泛應(yīng)用[9-15]。金瑩[16]、艾志錄[17]、劉杰超[18]等對(duì)蘋果、蘋果渣、蘋果汁中多酚類物質(zhì)的大孔樹(shù)脂純化工藝進(jìn)行研究，而未見(jiàn)蘋果葉多酚的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蘋果葉多酚的純化及其抗氧化性進(jìn)行研究，采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚進(jìn)行初步純化、Sephadex LH-20進(jìn)一步精制，并進(jìn)行高效液相分析，以期得到高含量根皮苷的蘋果葉多酚制品，為生產(chǎn)蘋果葉多酚提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果葉(富士品種)2008年10月采于楊凌，曬干，粉碎過(guò)40目篩。

沒(méi)食子酸、Folin-Ciocalteu試劑、二苯代苦味酰基自由基(DPPH) Sigma公司；對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、碳酸鈉、冰醋酸、茶多酚等均為分析純；乙腈(HPLC級(jí))。

1.2 儀器與設(shè)備

FW200高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；cp2245型分析天平 Sartorius公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-mini1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Bchi公司；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；HL-2B數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；Waters600E型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；1.8cm×30cm和1.6cm×50cm層析柱。

大孔吸附樹(shù)脂：LSA-10、NKA-II、NKA-9 西安藍(lán)曉樹(shù)脂廠；CAD-45、D-312 山東魯抗樹(shù)脂廠；HPD-80 河北滄州寶恩化工有限公司；X-5 天津南開(kāi)大學(xué)化工廠；聚酰胺 浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；Sephadex LH-20 Pharmacia公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果葉多酚粗提物的制備

稱取一定量的蘋果葉，以20%乙醇為提取溶劑，料液比(g/mL)1:40，超聲波輔助提取20min，提取溫度75℃，超聲波功率600W，提取兩次，抽濾，濾液用3倍體積的乙醚脫除葉綠素后，濃縮干燥得到多酚含量為10.07%的粗提物(ALPⅠ)。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[19]，以沒(méi)食子酸為基準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定蘋果葉中多酚的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=11.649C+0.0041，R2=0.9991(A為吸光度，C為沒(méi)食子酸質(zhì)量/mg)。

1.3.3 大孔樹(shù)脂純化蘋果葉多酚的性能研究

1.3.3.1 樹(shù)脂的預(yù)處理

將樹(shù)脂用無(wú)水乙醇室溫下密封浸泡8h，水洗后用5%鹽酸溶液浸泡8h，水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡8h，用水洗至中性備用。

1.3.3.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取用濾紙吸干的濕樹(shù)脂(預(yù)處理過(guò)的)1.000g于100mL錐形瓶中，加入25mL蘋果葉多酚溶液，避光密封置于振蕩器中，28℃ 100r/min振蕩24h后從上清液中取樣，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度。

根據(jù)以式(1)、(2)計(jì)算吸附量和吸附率：

式中：C0、C1為吸附前后試液多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為供試液體積/mL；m為樹(shù)脂濕質(zhì)量/g。

1.3.3.3 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

將充分吸附的樹(shù)脂過(guò)濾，用水沖洗后濾干置于錐形瓶中，分別加入20%和60%的乙醇溶液25mL，密封置于振蕩器中，28℃、100r/min振蕩24h后從上清液中取樣，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，根據(jù)式(3)計(jì)算解吸率。

式中：C為洗脫液中多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為洗脫液體積/mL；m為吸附量/mg。

1.3.3.4 蘋果葉多酚在所選樹(shù)脂上的等溫吸附研究

稱取1.000g所選樹(shù)脂于錐形瓶中，分別加入25mL不同質(zhì)量濃度的蘋果葉多酚溶液，于20、30、40℃下恒溫水浴振蕩24h，測(cè)定平衡液中多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量，以吸附平衡液中多酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，樹(shù)脂上多酚的吸附量為縱坐標(biāo)繪制吸附等溫線。

吸附等溫線描述的是一定溫度下平衡態(tài)吸附劑中溶質(zhì)的吸附量與溶液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同溫度下的吸附等溫線、Langmuir模型和Freundlich模型參數(shù)進(jìn)行研究[20-21]。

1.3.3.5 動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)

稱取20.0g篩選出的樹(shù)脂，預(yù)處理后濕法裝入1.8cm×30cm層析柱中(樹(shù)脂柱體積為30mL)，平衡后加入定量的蘋果葉多酚粗提液至飽和，先用水沖洗至無(wú)色，再用乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，并繪制洗脫曲線。合并多酚質(zhì)量濃度較高的洗脫液濃縮干燥后得蘋果葉多酚純化物(ALPⅡ)。

1.3.4 蘋果葉多酚的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

分別配制多酚質(zhì)量濃度為10、20、40、80、160、320、640μg/mL的蘋果葉多酚粗提液和純化液進(jìn)行抗氧化性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)配制不同質(zhì)量濃度的茶多酚溶液作為對(duì)照。

1.3.4.1 蘋果葉多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果[22-23]

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液4mL，加入1mL 1mmol/L無(wú)水乙醇配制的DPPH自由基溶液，用力振搖混勻后置暗室中靜置30min，于517nm處測(cè)定吸光度。按式(4)計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Ax為加入樣品溶液和DPPH自由基后的吸光度，Ax0為樣品溶液本底的吸光度；A0為DPPH自由基和蒸餾水的吸光度。

1.3.4.2蘋果葉多酚對(duì)NO2－·的清除效果[24]

分別吸取5mg/L的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液2mL置于25mL比色管中，分別加入3mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，常溫下反應(yīng)30min，然后分別加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液1mL，搖勻靜置5min，再分別加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.5mL，用水稀釋至刻度，搖勻靜置15min后于538nm處測(cè)定吸光度。按式(5)計(jì)算NO2－·清除率。

式中：A0為不加樣品溶液時(shí)NaNO2的吸光度；A1為加入樣品溶液后NaNO2的吸光度；A2為不加NaNO2時(shí)樣品溶液的吸光度。

1.3.5 Sephadex LH-20對(duì)蘋果葉多酚的精制和HPLC分析[25-26]

經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的蘋果葉多酚用Sephadex LH-20進(jìn)行精制。將25g干凝膠用80%乙醇充分溶脹6h后裝1.6cm×50cm層析柱。稱取一定量的蘋果葉多酚純化物溶解于80%乙醇中，經(jīng)過(guò)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后加到剛排干的凝膠表面，樣品滲入膠床后進(jìn)行洗脫。洗脫液經(jīng)濃縮干燥得到蘋果葉多酚精制物(ALPⅢ)。測(cè)定精制物中多酚的含量，分別按式(6)、(7)計(jì)算多酚純度和收率。

取一定量的蘋果葉多酚純化物和精制物，用乙腈溶解，經(jīng)過(guò)0.45μm的膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件：Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流動(dòng)相：A體積分?jǐn)?shù)3%乙酸水溶液，B乙腈。梯度洗脫條件：0～30min，A 95%～65%，B 5%～35%，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

本實(shí)驗(yàn)選取CAD-45、D-312、HPD-80、LSA-10、NKA-9、NKA-II、X-5和聚酰胺8種樹(shù)脂，運(yùn)用靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附解吸結(jié)果Table 1 Adsorption and desorption of different resins towards apple leaf polyphenols

由表1可知，X-5樹(shù)脂的吸附量最大，其次是LSA-10樹(shù)脂和聚酰胺；60%乙醇比20%乙醇的解吸能力強(qiáng)，更適合做解吸劑；60%乙醇做解吸劑時(shí)，D-312樹(shù)脂的解吸率最高，但其吸附量太低，CAD-45、LSA-10和X-5樹(shù)脂的解吸性能較好；由于X-5樹(shù)脂的吸附量大，解吸率高，同時(shí)3h后基本達(dá)到吸附解吸平衡，具有吸附解吸速度快的優(yōu)點(diǎn)，選擇X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚進(jìn)行純化。

2.2 X-5樹(shù)脂的靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)

2.2.1 蘋果葉多酚的質(zhì)量濃度對(duì)X-5樹(shù)脂吸附的影響

圖1 蘋果葉多酚的質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附的影響Fig.1 Effect of sample concentration on adsorption quantity of polyphenols

稱取濕樹(shù)脂各1.000g置于錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.457、0.914、1.828、2.709、3.658、4.572mg/mL的蘋果葉多酚溶液80、40、20、13.5、10、8mL進(jìn)行靜態(tài)吸附，計(jì)算吸附量，考察質(zhì)量濃度對(duì)X-5樹(shù)脂吸附的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附量隨質(zhì)量濃度的增大而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到3.658mg/mL后，繼續(xù)增大質(zhì)量濃度，吸附量增加不顯著，因此選擇上樣質(zhì)量濃度為3.658mg/mL。

2.2.2 蘋果葉多酚溶液的pH值對(duì)X-5樹(shù)脂吸附的影響

分別將蘋果葉多酚溶液調(diào)到pH2、3、4、5、6進(jìn)行靜態(tài)吸附，計(jì)算吸附量，考察pH值對(duì)X-5樹(shù)脂吸附的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蘋果葉多酚溶液的pH值對(duì)樹(shù)脂吸附的影響Fig.2 Effect of sample pH on adsorption quantity of polyphenols

由圖2可知，較低pH值范圍內(nèi)，X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值達(dá)到3時(shí)，吸附量最大；pH值繼續(xù)增加，吸附量下降。蘋果葉多酚是一種弱酸性物質(zhì)，其－OH基團(tuán)上的H+可解離出來(lái)，以離子形式存在于水中，此時(shí)不易被樹(shù)脂吸附，當(dāng)pH值低時(shí)蘋果葉多酚多以分子態(tài)存在，易被樹(shù)脂吸附，但當(dāng)pH值低于一定值后多酚幾乎完全以分子態(tài)存在，繼續(xù)降低pH反而降低了樹(shù)脂的選擇吸附性。因此pH3較適于X-5樹(shù)脂吸附蘋果葉多酚。

2.2.3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)X-5樹(shù)脂解吸的影響

分別用體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液進(jìn)行靜態(tài)解吸，計(jì)算解吸率，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)X-5樹(shù)脂解吸效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)樹(shù)脂解吸的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on desorption rate of polyphenols

由圖3可知，20%乙醇的解吸率最低，體積分?jǐn)?shù)大于40%后解吸率無(wú)顯著差異，因此選擇40%乙醇做解吸劑。

2.2.4 X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的等溫吸附研究結(jié)果

2.2.4.1 不同溫度下X-5樹(shù)脂吸附蘋果葉多酚等溫線不同溫度下，當(dāng)X-5樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡時(shí)，以溶液中的溶質(zhì)質(zhì)量濃度Ce對(duì)吸附載體上溶質(zhì)的吸附量Qe作圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同溫度下X-5樹(shù)脂吸附多酚等溫線Fig.4 Isothermal adsorption curves of X-5 resin at various temperatures

由圖4可知，這是一種呈略向上凸起的等溫曲線圖，屬于優(yōu)惠吸附的類型，表明X-5樹(shù)脂在蘋果葉多酚質(zhì)量濃度較低的溶液中可以吸附、富集到較高質(zhì)量濃度的多酚。

2.2.4.2 Langmuir吸附模型

Langmuir模型是一種普遍采用的等溫吸附模型，該模型可以表示為：

式中：Qe為平衡吸附量/(mg/g)；Ce為平衡質(zhì)量濃度/(mg/mL)；Qm為吸附量/(mg/g)；Kb為吸附平衡常數(shù)，在一定的溫度和固定的吸附劑-溶質(zhì)體系中，Qm和Kb是常數(shù)。

表2 Langmuir模型參數(shù)Table 2 Parameters of Langmuir isothermal models of X-5 resin at various temperatures

由表2可知，在所研究的質(zhì)量濃度和溫度范圍內(nèi)，Langmuir等溫方程能夠很好的描述X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附等溫線。相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98，表明X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附過(guò)程符合Langmuir模型。Qm隨溫度的升高而減小，顯示此過(guò)程是放熱反應(yīng)；平衡常數(shù)Kb隨溫度的升高而減小同樣證明隨溫度升高吸附能力不斷下降，即低溫有利于吸附發(fā)生；Kb＞1證明此過(guò)程是一個(gè)良好的吸附過(guò)程。

2.2.4.3 Freundlich吸附模型

Freundlich模型是另外一種常見(jiàn)的等溫吸附模型，可以用式(10)、(11)表述。

式中：k、n都為吸附常數(shù)；k反應(yīng)了吸附量的相對(duì)大小；n描述了等溫線的變化趨勢(shì)，二者都由溫度和吸附劑-吸附溶質(zhì)系統(tǒng)而定。

以式(11)為模型，以lnQe對(duì)lnCe作圖，考察X-5樹(shù)脂的吸附數(shù)據(jù)與Freundlich模型的符合程度。

表3 Freundlich模型參數(shù)Table 3 Parameters of Freundlich isothermal models of X-5 resin at various temperatures

由表3可知，在所研究的質(zhì)量濃度和溫度范圍內(nèi)，X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附符合Freundlich模型(R2＞0.99)，n＞1說(shuō)明X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附為優(yōu)惠型吸附。k隨著溫度的升高而減小，說(shuō)明低溫有利于吸附的發(fā)生。

2.3 X-5樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上柱液流速和洗脫流速對(duì)樹(shù)脂吸附解吸效果的影響

表4 上柱液流速和洗脫流速對(duì)樹(shù)脂吸附和洗脫效果的影響Table 4 Effects of adsorption and desorption flow rates on adsorption and desorption rates of polyphenols

將pH3，質(zhì)量濃度3.658mg/mL的蘋果葉多酚溶液150mL分別以0.5、1.0、2.0、4.0mL/min的速度通過(guò)裝有X-5樹(shù)脂的層析柱，檢測(cè)漏出液多酚質(zhì)量濃度，考察上柱流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響；吸附飽和的樹(shù)脂先用水沖洗至無(wú)色，再用120mL(4BV)40%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫流速分別為1.0、2.0、3.0、4.0mL/min，收集洗脫液，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率，考察洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響。結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，吸附解吸率均隨著流速的增大而減小。上柱流速太快，蘋果葉多酚溶液跟樹(shù)脂的接觸時(shí)間短，多酚分子來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面而漏過(guò)，導(dǎo)致吸附率低；流速小有利于對(duì)多酚的吸附，但流速過(guò)小會(huì)使作業(yè)周期增長(zhǎng)；同樣洗脫流速越小洗脫效果越好。根據(jù)差異顯著性的比較選擇2.0mL/min為上柱流速，洗脫流速宜控制在1.0mL/min。

2.3.2 動(dòng)態(tài)洗脫曲線

圖5 X-5樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.5 Dynamic desorption curve of X-5 resin

由圖5可得，出動(dòng)態(tài)條件下X-5樹(shù)脂上吸附的多酚物質(zhì)極易洗脫。120mL(4BV)洗脫劑就可將85%以上的多酚洗脫下來(lái)，洗脫高峰也相對(duì)比較集中。合并多酚質(zhì)量濃度較高的洗脫液濃縮干燥后，測(cè)定其純度為38.55%，較純化前的純度(10.07%)提高了近3倍。

2.4 蘋果葉多酚的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 蘋果葉多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果

圖6 ALPⅠ、ALPⅡ和茶多酚對(duì)DPPH 自由基的清除效果Fig.6 Comparison of DPPH free radical scavenging capacity among tea ployphenols and pre- and post-X-5 resin purification polyphenols-rich extract from apple tree leaves

由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)ALPⅠ、ALPⅡ和茶多酚對(duì)DPPH自由基的清除率均隨質(zhì)量濃度的增大而增大。在質(zhì)量濃度小于320μg/mL時(shí)，ALPⅡ的清除率高于ALPⅠ和茶多酚，在質(zhì)量濃度大于320μg/mL時(shí)三者相當(dāng)。X-5樹(shù)脂純化后的蘋果葉多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力有所增強(qiáng)。

2.4.2蘋果葉多酚對(duì)NO2－·的清除效果

圖7 ALPⅠ、ALPⅡ和茶多酚對(duì)·的清除效果Fig.7 Comparison of nitrite scavenging capacity among teaployphenols and pre- and post-X-5 resin purification polyphenols-rich extract from apple tree leaves

由圖7可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)ALPⅠ、ALPⅡ和茶多酚對(duì)·的清除率與質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)，ALPⅡ的清除率比ALPⅠ高，且與茶多酚相當(dāng)，X-5樹(shù)脂純化后的蘋果葉多酚對(duì)·的清除能力有所提高。

2.5 Sephadex LH-20對(duì)蘋果葉多酚的精制和HPLC分析

稱取0.250g X-5樹(shù)脂純化物溶解于5mL 80%乙醇中，用80%乙醇進(jìn)行洗脫，每8min收集一管洗脫液，檢測(cè)各管中多酚的含量，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖8。

圖8 Sephadex LH-20精制蘋果葉多酚Fig.8 Sephadex LH-20 purification of apple tree leaf polyphenols

由圖8可知，多酚的含量從20管開(kāi)始迅速增加，20～30管為多酚分布的高峰區(qū)間，合并此區(qū)間的洗脫液，濃縮干燥得到蘋果葉多酚精制物(ALPⅢ)，測(cè)定其多酚純度為52.02%，收率為41.3%。

HPLC分析結(jié)果(圖9～11)表明，蘋果葉中根皮苷的含量為2.45%。X-5樹(shù)脂純化物中根皮苷的含量為32.84%，占純化物中總多酚的85.16%；Sephadex LH-20精制物中根皮苷的含量為47.61%，占精制物中總多酚的91.51%；蘋果葉多酚精制物中根皮苷的含量很高，可以作為生產(chǎn)根皮苷的優(yōu)良原料。

圖9 X-5樹(shù)脂純化物的色譜圖Fig.9 HPLC profile of X-5 resin purification product

圖10 Sephadex LH-20精制物的色譜圖Fig.10 HPLC profile of Sephadex LH-20 purification product

圖11 蘋果葉多酚粗提物色譜圖Fig.11 HPLC profile of unpurified crude polyphenols-rich extract

3 結(jié) 論

3.1 X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚有較好的吸附和解吸效果。X-5樹(shù)脂純化蘋果葉多酚的條件為上柱液質(zhì)量濃度3.658mg/mL、上柱液pH3、吸附流速2.0mL/min；以40%乙醇為解吸劑，洗脫流速1.0mL/min，洗脫體積4BV。采用上述條件純化后的蘋果葉多酚的純度從10.07%提高到38.55%。

3.2 等溫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，X-5樹(shù)脂對(duì)蘋果葉多酚的吸附為放熱過(guò)程，屬于優(yōu)惠吸附，吸附過(guò)程符合Langmuir等溫吸附模型和Freundlich等溫吸附模型。

3.3 經(jīng)X-5樹(shù)脂純化后的蘋果葉多酚對(duì)DPPH自由基和·的清除能力增強(qiáng)，蘋果葉多酚具有與茶多酚相當(dāng)?shù)目寡趸饔?，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。

3.4 HPLC分析結(jié)果表明，蘋果葉中根皮苷的含量為2.45%，粗提物經(jīng)過(guò)X-5樹(shù)脂純化和Sephadex LH-20精制后得到的蘋果葉多酚精制品中根皮苷的含量為47.61%，占制品中總多酚的91.51%，開(kāi)發(fā)利用價(jià)值高。

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Purification and Antioxidant Activity of Polyphenols from Apple Tree Leaves

XU Huai-de，WANG Lin-bin，ZHANG Li-jia
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The preliminary purification of a polyphenols-rich extract from apple tree leaves prepared in our laboratory was carried out using macroporous resin adsorption, followed by further purification and HPLC analysis. Along with this, the preliminarily purified extract was tested for its ability to scavenge DPPH free radicals and nitrite. X-5 resin was the best resin found for adsorbing and desorbing apple tree leaf polyphenols among eight types of resins tested. The optimum adsorption/desorption conditions of X-5 resin were determined to be: sample concentration, 3.658 mg/mL; sample pH, 3; sample flow rate,2.0 mL/min; ethanol concentration for desorption, 40%; desoprtion flow rate, 1.0 mL/min; and desorption solvent volume, 4 BV.After the purification under the above conditions, the purity of polyphenols was increased from 10.07% to 38.55%. The adsorption of X-5 resin towards apple tree leaf polyphenols was an exothermic course and accorded with the Langmuir isothermal model and the Freundlich isothermal model. The purified extract presented stronger DPPH free radical and nitrite scavenging capacities than the native extract. The HPLC analysis showed that the content of phlorizin was 2.45% in apple tree leaves and 47.61% in the further purified extract, which accounted for 91.51% of the total polyphenols.

apple tree leaves；polyphenols；macroporous adsorption resin；antioxidant activities；phlorizin

TQ243.11

A

1002-6630(2010)20-0072-07

2010-12-26

徐懷德(1964—)，男，副教授，研究方向?yàn)檐涳嬃?、果品蔬菜貯藏與加工、天然產(chǎn)物提取。E-mail：xuhuaide@yahoo.com.cn