周昕，王江濤，譚麗菊，趙志超

1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，青島266100

2.青島科技大學化工學院，青島266042

膠州灣某水域蛤蜊（Ruditapes philippinarum）、牡蠣（Crassostrea ariakensis）中的雌激素含量

周昕1，2，王江濤1，*，譚麗菊1，趙志超2

1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，青島266100

2.青島科技大學化工學院，青島266042

為了探討海洋貝類對環(huán)境中雌激素的富集情況，采用液-液萃取和固相萃取方法提取了膠州灣李村河入?？诟蝌?、牡蠣和底泥中的雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）和雌炔醇（EE2），并用GC-MS方法測定了上述4種物質(zhì)的含量，此外還采用暴露實驗方法研究了蛤蜊吸收底泥中雌激素物質(zhì)的影響因素.測定結(jié)果顯示，該水域中蛤蜊全組織中E1含量為0.45～5.20ng·g-1，E2含量為nd～4.34ng·g-1，E3和EE2未檢出；牡蠣體內(nèi)的E1、E2和E3含量分別為4.64～29.66、2.16～7.20和0.96～7.96ng·g-1，EE2未檢出；底泥中E1、E2和E3含量分別為0.43～2.36、nd～0.59、0.52～1.13ng·g-1，EE2未檢出.蛤蜊和牡蠣體內(nèi)的雌激素物質(zhì)含量高于其棲息的底泥.暴露實驗結(jié)果顯示，隨著底泥中雌激素物質(zhì)含量的增加或暴露時間增加，蛤蜊體內(nèi)雌激素物質(zhì)的含量增加，貝類可吸收并富集底泥中的雌激素物質(zhì).

蛤蜊；牡蠣；雌激素；萃??；GC-MS

1 引言（Introduction）

天然雌激素如雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）和合成化合物雌炔醇（EE2）目前已在各種水體中被廣泛檢出（Lguchi et al.,2001;Tilton et al.,2002），例如英國某表層水中E2水平達到27ng·L-1，EE2水平達到5.1ng·L-1（Ying et al.,2002），中國深圳某污水排放口海水中雌激素物質(zhì)總量達260～300ng·L-1（Lee et al.,2006）.實驗室研究結(jié)果顯示，E2和EE2的雌激素活性較大，水中含有0.1ng·L-1的EE2就可使某些敏感生物出現(xiàn)內(nèi)分泌異常（Lange et al.,2002;Andersen et al.,2003）.據(jù)布魯尼爾大學研究人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)，流經(jīng)倫敦的泰晤仕河中出現(xiàn)的兩性同體魚，是口服避孕藥中的雌激素物質(zhì)通過污水流入河中的結(jié)果（徐俊康，2003）；黃河鱸幼體在性分化期間吸收了雌激素物質(zhì)處理的浮游生物鹵蟲幼體會產(chǎn)生功能性性逆轉(zhuǎn)（Stewart et al.,2001）.

水中雙殼類軟體動物也能夠累積其周邊環(huán)境中的甾體雌激素（Tarrant et al.,2001;Le Curieux-Belfond et al.,2005）.較高水平的E2等雌激素物質(zhì)已經(jīng)出現(xiàn)在蛤蜊等雙殼類軟體動物體內(nèi)（Janer and Porte,2007;Gauthier-Clerc et al.,2006）.蛤蜊等軟體動物體內(nèi)含有雌二醇受體（K?hler et al.,2007;Lafont et al.,2007），某些雌激素物質(zhì)會導致貝類的DNA受損（Gagné et al.,2002）.目前對雙殼類軟體類動物體內(nèi)雌激素水平研究較多的是貽貝（Mytilus edulis）（Ortiz-Zarragoitia and Cajaraville,2006），其次是扇貝，而蛤蜊（Ruditapes philippinarum）和牡蠣（Crassostrea ariakensis）的研究相對較少（王海艷等，2007）.本文采用萃取和GC-MS法對青島李村河-膠州灣?？趨^(qū)域的牡蠣、蛤蜊及蛤蜊生長的底泥中的雌激素物質(zhì)進行提取和測定，通過暴露實驗研究蛤蜊對底泥中雌激素物質(zhì)的吸收，以期為了解膠州灣雙殼類動物體內(nèi)雌激素物質(zhì)水平提供基礎(chǔ)依據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 儀器

菲尼根TRACE MC GC-MC儀，GC112-A氣相色譜儀（上海分析儀器廠）.0.25mm I.D.×30m×0.25μm DB-5石英毛細管柱.

2.2 試劑

N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺（MSTFA，美國Sigma-Aldrich公司）.雌二醇（17β-estradiol，C18H24O2，純度≥97%，美國Aldrich公司），雌三醇（estriol,C18H24O3，HPLC級，純度≥97%，F(xiàn)luka試劑，美國），雌酮（estrone,C18H22O2，HPLC級，純度≥97.0%，F(xiàn)luka試劑，美國），雌炔醇（17α-ethynyl estradiol,C20H24O2，HPLC級，純度≥98%，Sigma試劑，美國）.正-25碳烷烴（C25，色譜標準，F(xiàn)luka試劑，美國）.正-20碳烴（C20，色譜標準，上海試劑一廠），角沙烷（C30，色譜標準，英國，上?；瘜W試劑采購供應(yīng)站試劑廠分裝），SUPELCO LC-18小柱（填料100mg，50mm×5mm I.D.Fluka試劑，美國）.0.45μm纖維素膜.無水甲醇、正己烷、乙酸乙酯和吡啶均為分析純，二氯甲烷、氯仿為色譜純.實驗用混合雌激素標準溶液濃度為：E3=7.92mg·L-1，E2=20.4mg·L-1，E1=20.3mg·L-1，EE2=13.28mg·L-1.其他試劑濃度：C25=18.6mg·L-1，C20=600mg·L-1，C30=152mg·L-1.

2.3 樣品的收集

暴露實驗用蛤蜊樣品購于集貿(mào)市場.用于現(xiàn)場研究的蛤蜊樣品采自膠州灣青島李村河入?？诤?海水落潮后，將蛤蜊從海灘底泥中挖出.蛤蜊的長度均為2～2.5cm.3、4、5月各采集一次蛤蜊樣品.同時采集蛤蜊所棲息的海泥.4月的牡蠣樣品采自李村河-膠州灣海岸礁石表面（落潮后采集），牡蠣長度為6cm.5月采集的深海牡蠣樣品長度為8cm（漁民提供）.生物樣品均為活體貝類.上述采集的生物樣品和底泥樣品立即密封并置于-20℃冰凍保存.

2.4 貝類組織中雌激素的提取與測定

取6枚冰凍蛤蜊或牡蠣，去殼后，取其全組織稱重.搗碎后，加入40mL甲醇（Le Curieux-Belfond et al.,2001;Hartmann and Steinhart,1997）和10mL pH=7.4的0.2mol·L-1的磷酸鈉鹽緩沖溶液（Gagné et al.,2002;Gauthier-Clerc et al.,2006），勻漿15min.離心分離出混合物中的固體.將液體倒入分液漏斗中，然后用20mL正己烷對該液體萃取兩次（Hartmann and Steinhart,1997），棄去上層的正己烷溶液.將剩余溶液倒入燒杯中，在40℃水浴中，用氮氣吹至液體量為10mL.在該液體中加入50mL去離子水，用C-18小柱過濾，流速為1～2mL·min-1.加入20mL水清洗燒杯兩次，再將該水過柱.氮氣吹出小柱中的水，用1:6:6的甲醇:二氯甲烷:正己烷混合液洗脫小柱上的物質(zhì).收集洗脫液，在40℃下用氮氣吹干溶劑（任進民和侯艷寧，2004）.

在殘渣中加入20μL C30作內(nèi)標，用二氯甲烷將小燒杯中的殘渣轉(zhuǎn)移到反應(yīng)瓶中.用弱氮氣流吹溶劑至干.在該殘渣中加入50μL吡啶（Liu et al.,2004）和50μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），在室溫下放置30min.然后在反應(yīng)瓶中再加入50μL正己烷和50μL MSTFA硅烷化試劑，在100℃烘箱中加熱40min.冷卻后對樣品的硅烷化衍生物進行氣相色譜分析.氣相色譜分析程序為：初始溫度80℃（保持2min），后以10℃·min-1的速度升溫至250℃（保持15min），再以1℃·min-1的速度升至260℃，保持20min.采用無分流進樣.實際樣品用GC-MS法測定，進樣2μL.質(zhì)譜測定質(zhì)量掃描范圍從25～550.根據(jù)雌激素標準樣品的保留時間和掃描特征離子的m/Z進行定性分析，用雌激素的分子離子峰面積（Quintana et al.,2004）及內(nèi)標法對樣品中的雌激素含量進行定量分析.雌激素物質(zhì)含量用鮮重計.

2.5 底泥中4種雌激素（E1、E2、E3、EE2）的提取與測定

取冰凍干燥的底泥樣品于150mL錐形瓶中，加入含有甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷（Jurgens et al.,1999）、正己烷（體積比為3:4:3:6）的混合萃取液20mL，密封后用超聲波萃取20min.靜止沉降后，將上層清液轉(zhuǎn)移到小燒杯中.分別用10mL萃取液將上述萃取過的樣品再萃取兩次，每次20min，將該萃取液均并入小燒杯中.在40℃下，用氮氣吹干溶劑.在殘渣中加入少量二氯甲烷使殘渣溶解，再加入300mg柱層析硅膠與溶液混合，待溶劑揮發(fā)后，將混有樣品的硅膠轉(zhuǎn)移至塑料小柱中.將該小柱與C18柱（用C20、C25處理）相連，用100mL去離子水從硅膠小柱到C18小柱淋洗（Kuster et al.,2004），流速為1～2mL·min-1.取下C18柱，用氮氣吹出其中的水分.柱上樣品洗脫及樣品的衍生化處理同2.4節(jié).用GC-FID法進行測定，進樣4μL.底泥中雌激素物質(zhì)含量以干重計.

2.6 回收率與工作曲線的測定

將含有E1、E2、E3和EE2的混合標準樣品溶液噴入勻漿過的蛤蜊肉樣中，或加入到篩過的干燥底泥樣品中，攪拌均勻.分別用上述方法對蛤蜊或底泥樣品中的4種雌激素進行提取和衍生化，然后進行色譜分析.取等量上述4種雌激素標準樣品，衍生化后直接進行色譜分析.所得結(jié)果用于回收率計算.蛤蜊全組織中4種雌激素的回收率（n=5）為80%～90%，相對標準偏差為±5～19%.底泥樣品中的4種雌激素的提取回收率（n=3）為80%～120%，標相對準偏差為±10～17%.取5份不同濃度的4種混合雌激素標準溶液（E1、E2、E3、EE2的含量在0.1～3μg），按前述方法進行硅烷化，用GC-MS或GC-FID法測定工作曲線.在0.1～3μg濃度范圍內(nèi)E1、E2、E3和EE2的內(nèi)標工作曲線的線性相關(guān)系數(shù)在0.993～0.996之間，F(xiàn)ID方法的檢出限在2～8μg·kg-1之間，MS方法的檢出限在1～3μg·kg-1樣品之間（信噪比S/N=3）（周昕等，2006）.

2.7 蛤蜊暴露實驗

在培養(yǎng)皿中依次加入400g底泥、少量海水和一定量的混合雌激素（含E1、E2、E3、EE2）標準溶液，將該混合物攪拌均勻.取6枚市售活蛤蜊，將其埋入上述底泥中.培養(yǎng)基中混合標準雌激素的加入量分別為100、150和200μL，暴露實驗溫度為10、20和30℃，蛤蜊暴露在底泥中的時間為6、12和24小時（h）.將暴露實驗溫度、暴露時間和暴露雌激素量設(shè)計成三因素三水平正交實驗（設(shè)計方案見表1）.按表1方案分別進行實驗.暴露實驗后，取出蛤蜊并洗去其表面泥土，密封后將其置于-20℃冰凍.按前述方法對暴露蛤蜊中的4種雌激素測定.同時測定該市售蛤蜊中的雌激素含量用于對照.

表1 蛤蜊暴露實驗設(shè)計正交表Table 1Design matrix used in clamp exposure experiment

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 蛤蜊暴露

暴露實驗條件對蛤蜊體內(nèi)4種雌激素物質(zhì)水平的影響如圖1所示.結(jié)果表明，暴露在含有4種雌激素底泥中的蛤蜊，其全組織中的相關(guān)雌激素的濃度遠高于對照試驗組（E1=0.03，E2=0.30，EE2=0，E3=0，Ai/As%·g-1），說明在培養(yǎng)實驗中，蛤蜊吸收了底泥中的雌激素物質(zhì)，這與Champeau和Narbonne（2006）報道結(jié)果一致.

將蛤蜊暴露正交實驗結(jié)果進行級差分析，暴露溫度、暴露雌激素的量及暴露時間對蛤蜊吸收底泥中4種雌激素的綜合影響列于表2.

表2 暴露實驗條件對蛤蜊體內(nèi)4種雌激素水平的綜合影響Table 2Complex effects of conditions of exposure experiment on levels of estrogens in exposed clams

測定結(jié)果表明（見表2或圖1），當暴露溫度從10℃高到30℃時，蛤蜊體內(nèi)雌激素物質(zhì)E2、EE2、E3的含量呈下降趨勢.說明溫度較高時，蛤蜊對底泥中的雌激素物質(zhì)的吸收作用減弱，或蛤蜊體內(nèi)對雌激素物質(zhì)的降解作用增加.這種結(jié)果類似于貽貝（M.edulis）體內(nèi)E1和E2的含量在2月份高于12月份的情況（Gauthier-Clerc et al.,2006）.與前者相反，隨暴露實驗溫度升高，蛤蜊體內(nèi)E1的含量增加，但增加的幅度不大.除了E1有較強的脂溶性外，軟體動物體內(nèi)的代謝作用可以將E1和E2互相轉(zhuǎn)化（Janer and Porte,2007）.所以暴露蛤蜊體內(nèi)E1的增加可能與E2降解作用的增強有關(guān).

暴露正交實驗結(jié)果還表明，蛤蜊暴露在底泥的時間延長，其體內(nèi)雌激素物質(zhì)E1、E2、EE2的含量增加，說明蛤蜊會持續(xù)吸收底泥中的某些雌激素物質(zhì)并在體內(nèi)累積.然而，在實驗條件下，蛤蜊體內(nèi)E3的水平呈下降趨勢，說明蛤蜊對極性較強的E3吸收的少.這與Lai等（2002）的生物濃縮預測模型中E3具有較小的濃縮因子結(jié)論相一致.

當培養(yǎng)基質(zhì)中4種雌激素物質(zhì)的量增加時，試驗蛤蜊體內(nèi)的E2、EE2、E3的水平增加，表明底泥中雌激素物質(zhì)的量增加，生物組織對其吸收增加.但是，暴露蛤蜊體內(nèi)E1的水平呈下降趨勢.盡管E1的總量變化不大，但軟體動物體內(nèi)可能存在生物代謝平衡作用（Berg and Kuss,1991;Janer and Porte,2007）.

可見，蛤蜊能夠吸收并累積底泥中的雌激素物質(zhì).暴露時間長或暴露量大都會使蛤蜊對雌激素的累積量增加，但對不同雌激素物質(zhì)的吸收和累積程度不同.

3.2 蛤蜊和牡蠣體內(nèi)的雌激素現(xiàn)場調(diào)查

3.2.1 蛤蜊中雌激素物質(zhì)含量

測定結(jié)果見表3.蛤蜊樣品全組織中含有E1和E2，E3和EE2未檢出，其中E1的含量在0.45～5.20ng·g－1之間，E2的含量在nd～4.34ng·g－1之間，E1含量高于E2.據(jù)文獻報道，蛤蜊（Ruditapes decussate）全組織中E2含量小于0.01ng·g－1，軟殼蛤蜊（M.arenaria）的生殖腺體中的E2含量為0.1～1ng·g－1（Janer and Porte,2007）.本研究的測定結(jié)果均高于文獻值.盡管不同類型的蛤蜊的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和代謝水平可能不同，但這些蛤蜊體內(nèi)雌激素含量的差別與棲息的環(huán)境水域中的污染物質(zhì)水平有關(guān).測定結(jié)果還顯示，從3月到5月，隨環(huán)境溫度的升高，蛤蜊體內(nèi)的E1含量增加，E2含量下降，這與暴露實驗結(jié)果一致.說明蛤蜊體內(nèi)的雌激素水平受到了環(huán)境因素的影響.

表3 膠州灣底泥、蛤蜊及牡蠣中雌激素物質(zhì)含量（平均值）Table 3Average contents of estrogens in whole tissus in clam or oyster and bedmud from Jiaozhou Bay

3.2.2 牡蠣樣品中雌激素物質(zhì)含量

在測定的兩組牡蠣樣品中，均含有E1、E2和E3，EE2未檢出，它們的含量分別為，E1：4.64～29.66ng·g－1，E2：2.16～7.20ng·g－1，E3：0.96～7.96ng·g－1.其中，E1的含量高于E2和E3，E2與E3的水平相近.文獻報道中，牡蠣（Crassostrea gigas）整體組織中的E1和E2的含量分別為0.3和1.5ng·g－1，生殖腺體中的E1含量為0.01～1ng·g－1，E2含量為0.1～10ng·g－1（Janer and Porter,2007;Gauthier-Clerc et al.,2006）.可見牡蠣樣品中的E1和E2的測定值均比文獻報道值高，并且E1的含量高于E2，這與文獻相反.此外，在被測牡蠣的組織中發(fā)現(xiàn)有E3，這些物質(zhì)可能來自于海水或底泥環(huán)境.測定結(jié)果還表明，海岸牡蠣體內(nèi)雌激素的水平明顯高于深海牡蠣.

3.2.3 底泥中雌激素物質(zhì)含量

底泥中含有E1、E2和E3，EE2未檢出，其中E2的水平為nd～0.59ng·g－1，E1為0.43～2.36ng·g－1，E3為0.52～1.13ng·g－1.該結(jié)果高于Jurgens等（1999）的報道值（E1=1.5～33，E2=0.7～16，E3=8.43ng·kg－1），低于德國某河底泥雌激素的測定值（＜0.05～22.8μg·kg－1）（Ternes et al.,2002）.底泥中3種雌激素物質(zhì)的水平隨環(huán)境溫度的升高而下降，這與4、5月份蛤蜊體內(nèi)雌激素的測定值一致（見表3）.與海灘底泥中E1和E2的水平相比，棲息在該底泥中的蛤蜊全組織中的相應(yīng)的雌激素水平較高，這說明蛤蜊吸收并累積了底泥中的雌激素物質(zhì).根據(jù)Lai等（2002）的生物濃縮雌激素預測模型，E1、E2和E3的logBCF（BCF:底棲生物濃縮因子）分別為2.31、2.71和1.82，因此蛤蜊組織對環(huán)境中的雌激素物質(zhì)的累積量還是較小的.

3.2.4 不同貝類樣品中被測雌激素的水平

測定結(jié)果顯示，市售蛤蜊體內(nèi)E1的含量低于海灘蛤蜊中的，E2含量低于或與海灘蛤蜊中的相近.其原因可能是市售活蛤蜊均放在潔凈海水中浸泡了一定時間，使蛤蜊體內(nèi)的雌激素物質(zhì)被浸出而含量下降（Specker and Chandlee,2003）.深海牡蠣體內(nèi)的E1和E2的水平與蛤蜊的相近，說明這兩種貝類對雌激素物質(zhì)的吸收、代謝或累積能力相近.然而，據(jù)文獻報道，牡蠣生殖腺體中E2的含量是蛤蜊的10倍（Janer and Porter,2007），扇貝（Patinopecten yessoensis）的生殖腺體中的E2含量與其類似（0.1～10ng·g－1），而貽貝全組織中E2的水平高達0.04～10ng·g－1，其生殖腺體的E1含量為31.9ng·g－1，E2含量為0.04～162ng·g－1（Janer and Porter,2007;Gauthier-Clerc et al.,2006），我們測定的海岸牡蠣全組織中的E1的含量遠高于深海牡蠣的.可見，不同類型的雙殼類軟體動物體內(nèi)的E1和E2的水平有較大的差異.除了這些生物體內(nèi)的代謝水平不同外，可能還與對環(huán)境中的污染物的吸收和累積作用能力有關(guān)，或與環(huán)境中的污染物的含量有關(guān).

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Estrogens in Clam（Ruditapes philippinarum）and Oyster（Crassostrea ariakensis）from Waters in Jiaozhou Bay

ZHOU Xin1，2，WANG Jiang-tao1，*,TAN Li-ju1，ZHAO Zhi-chao2

1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology,Ministry of Education,Ocean university of China,Qingdao 266100
2.College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042

In order to study the estrogen adsorption of shellfish in aquatic environment,the levels of estrogens,such as estrone（E1）,estradiol（E2）,estriol（E3）and ethynyl estradiol（EE2）in clams,oyster and sediment from the mouth of the Licun River in Jiaozhou Bay were determined by GC-MS after the estrogens were extracted by liquid or solid-phase extraction.Factors affecting absorption of clams to estrogens in sediment were studied by exposure them to sediment spiked estrogens.Results showed that levels of estrogens in whole tissue of calm were 0.45～5.20ng·g-1for E1 and nd～4.34ng·g-1（wet weight）for E2,respectively and those in oyster were 4.64～29.66 for E1,2.16～7.20 for E2 and 0.96～7.96ng·g-1（wet weight）for E3,respectively.Contents of E1,E2 and E3 in sediment were 0.43～2.36,nd～0.59,0.52～1.13ng·g-1（dry weight）.Contents of estrogens in clams and oysters were higher than those in sediment.Also,contents of estrogens in clams increased with increasing contents of estrogens spiked in sediment and exposure time.So,the estrogens in sediment could be absorbed and enriched by the two kinds of shellfish.

calm；oyster；estrogens；extraction；GC-MS

1 January 2009accepted20 February 2009

1673-5897（2010）1-123-07

X834，X503.22

A

2009-01-01錄用日期：2009-02-20

山東省自然科學基金項目（No.Y2006E10）

周昕（1956—），女，博士研究生，E-mail:qust-zhou@163.com；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:jtwang@ouc.edu.cn

王江濤（1967—），教授、博士生導師，主要從事海洋中的碳循環(huán)及生物地球化學過程、海洋富營養(yǎng)化、海洋有機地球化學及海洋中的活性物質(zhì)等方面的研究工作.