趙艷景, 裴 波, 胡 虹, 王 穎

(1. 淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005; 2. 連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校, 江蘇 連云港 222006; 3. 中國藥科大學(xué), 江蘇 南京 210009)

縊蟶YC-2蛋白的提取及抗氧化作用研究

趙艷景1, 裴 波1, 胡 虹2, 王 穎3

(1. 淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005; 2. 連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校, 江蘇 連云港 222006; 3. 中國藥科大學(xué), 江蘇 南京 210009)

以新鮮縊蟶(Sinonovacula constricta)為材料, 經(jīng)水萃取、(NH4)2SO4鹽析、DEAE離子交換層析、Sepharose CL-6B凝膠層析、凍干濃縮。結(jié)合SDS-PAGE電泳技術(shù), 硫代巴比妥酸(TBA)法初步鑒定各個(gè)組分的抗氧化活性, 并用Bradford法進(jìn)行蛋白的定量。結(jié)果表明, 80%飽和度(NH4)2SO4鹽析得到的組分經(jīng)離子交換層析以及凝膠層析得到一個(gè)蛋白純品YC-2, 具有2個(gè)亞基, 大亞基的分子質(zhì)量為61.23 ku, 小亞基的分子質(zhì)量為45.39 ku, YC-2蛋白的分子質(zhì)量為106.62 ku, 而且其具有較高的抗氧化活性,在0.627 g/L時(shí)對·OH清除率達(dá)99.7 %。

縊蟶(Sinonovacula constricta); 蛋白質(zhì); 分離純化; 抗氧化活性

縊蟶(Sinonovacula constricta)隸屬軟體動物門、瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、竹蟶科, 廣泛分布于中國、日本和朝鮮等國的沿海地區(qū), 中國北自遼寧、山東南至廣東、福建都有分布。其肉豐腴脆嫩, 鮮美清甜, 藥物功效顯著。隨著“藍(lán)色革命”時(shí)代的迅速發(fā)展,海水貝類養(yǎng)殖等相關(guān)研究日益興起, 縊蟶成為我國四大養(yǎng)殖貝類之一, 對它的研究和開發(fā)利用受到越來越多的科研工作者的重視[1]。已經(jīng)有一些報(bào)道指出了縊蟶的藥物活性, 如抗氧化和抗腫瘤活性等[2,3]。目前國內(nèi)對縊蟶蛋白的藥物活性研究的比較少。

在正常的生命過程中自由基為維持生命所必需,但自由基也是生物大分子、細(xì)胞和生物組織的危險(xiǎn)的殺手。一般來說, 自由基具有很高的反應(yīng)活性, 可造成對機(jī)體的損傷。多年來, 大量的實(shí)驗(yàn)證明, 生命過程中的許多重要反應(yīng), 如多種酶催化的氧化還原反應(yīng)、光合作用、生物發(fā)光等多與自由基有關(guān); 多種疾病、生命的衰老亦涉及自由基反應(yīng)學(xué)作用, 羥自由基(·OH)是目前所知活性氧中對生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基?！H幾乎可以和生物細(xì)胞內(nèi)存在的所有類型的分子反應(yīng), 而且具有很高的速率常數(shù)。在活性氧中, 它的危害性最大。水的脈沖射解、Haber-Weiss反應(yīng)和Fenton反應(yīng), 甚至在超聲破碎和冷凍干燥的過程中都會產(chǎn)生·OH[4]。目前對羥自由基的研究已涉及不同的學(xué)科。尋找對羥自由基具有良好清除能力的清除劑, 特別是從常見的食品資源中進(jìn)行篩選, 就是一個(gè)非常有必要的課題, 如此可以保證體內(nèi)自由基的有效清除, 維護(hù)機(jī)體的正常機(jī)能, 也可預(yù)防一些疾病的發(fā)生[5～7]?，F(xiàn)在雖然有很多人研究自由基, 但從海洋蛋白資源中獲取具有抗氧化活性蛋白質(zhì)的研究報(bào)道很少, 只有Yu等[8]對海蜇蛋白抗氧化活性和李翠萍等[9]對白色霞水母蛋白抗氧化活性的初步研究的報(bào)道, 其他海洋生物蛋白質(zhì)的抗氧化活性報(bào)道很少。趙艷景等[10]發(fā)現(xiàn)在縊蟶粗提物中存在活性比較強(qiáng)的物質(zhì)。本研究旨在從中提取純化到比較純的活性物質(zhì), 為將縊蟶開發(fā)成為新的具有抗氧化作用的功能食品或新的抗氧化藥物先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

縊蟶(Sinonovacula constricta)購于連云港通灌蔬菜活禽直銷市場。

1.1.2 試劑

2-脫氧-D-核糖, 美國 INALCO 公司; 硫代巴比妥酸(TBA) , 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; Tris-Base,北京夏斯生物技術(shù)有限公司; 丙烯酰胺考馬斯亮藍(lán)G-250溴酚蘭考馬斯亮藍(lán)R-250, 加拿大BBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 縊蟶蛋白的粗提及分級鹽析

稱取50 g新鮮縊蟶肌肉組織, 放入組織勻漿機(jī)中攪成勻漿, 用大約 450 mL萃取緩沖液洗出勻漿,在4℃冰箱中充分浸取6 h。將萃取液于冷凍離心機(jī)中, 4℃下, 12 000 r/min離心30 min, 倒出上清并加水補(bǔ)充至500 mL。對提取到的蛋白水溶液進(jìn)行分級鹽析, 硫酸銨的飽和度比分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。 將分級鹽析得到的各個(gè)組分的沉淀再次溶解后裝入透析袋中, 加入適量的透析緩沖液于4℃透析24 h, 每4 h換1次透析液。將鹽析得到的各個(gè)組分的蛋白質(zhì)離心去除變性的蛋白質(zhì)后, 測量各組分蛋白溶液的體積。將離心后的上清冷凍或冷藏, 以備下一步純化。檢測分級鹽析各組分的蛋白含量以及蛋白的抗氧化活性, 制作出蛋白質(zhì)鹽析曲線。

1.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析

取上清液上樣DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱, 層析柱用10 mmol/L Tris-HCl, pH7.0 緩沖液平衡, 用10 mmol/LTris-HCl+1mol/NaCl, pH7.0進(jìn)行離子強(qiáng)度線性梯度洗脫, 洗脫處理溫度 25℃, 流速為1.5 mL/ min , 組分在280 nm波長的吸光度大于0.03時(shí)開始收集, 每管收集3 mL。對收集到的不同組分進(jìn)行蛋白質(zhì)定量、定性分析, 并測量各個(gè)組分的活性, 將相對活性較大的組分透析除鹽后冷凍干燥。

1.2.3 Sepharose CL-6B凝膠層析

將DEAE層析得到的活性較強(qiáng)組分凍干粉用25 mmol/L Tris-HCl, pH7.5溶解, 4℃下10 000 r/min離心 5 min, 上 Sepharose CL-6B柱。用 25mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 0.5 mL/min流速平衡柱, 上樣2mL,用上述緩沖液以 0.4 mL/min流速洗脫, 組分在 280 nm波長的吸光度值大于0.03時(shí)開始收集, 每管收集2 mL。對收集到的不同組分進(jìn)行蛋白質(zhì)定量、定性分析, 并測量各個(gè)組分的活性。選擇相對活性較大的組分做進(jìn)一步分析。

1.2.4 純度測定[11,12]

采用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(7.5%)電泳檢測分離得到的縊蟶蛋白質(zhì)的純度。

常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE) 電泳檢測分離得到的縊蟶蛋白質(zhì)的純度。

1.2.5 抗氧化活性測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法[13,14]測定： 取 0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液(10.0 mmol/L)于5 mL刻度試管中, 加入 0.5 mL的 2-脫氧核糖溶液(10.0 mmol/L)和0.6mL樣品, 用磷酸緩沖液(pH為7.4, 0.l mol/L)定容至 1.8 mL, 再加入 0.2 mLH2O2(10.0 mmol/L), 空白樣加入蒸餾水 0.2mL, 混勻后置于 37℃恒溫水浴中反應(yīng)l h。然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%三氯乙酸(TCA)溶液1.0 mL, 在4 000 r/ min下離心20 min, 取上清液2.0 mL于另一支試管中, 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.0%硫代巴比妥酸(TBA)溶液 1.0 mL, 混勻后置沸水浴反應(yīng)15 min, 冷卻后稀釋5倍, 在波長532 nm處測其吸光度值。提取物對羥自由基的清除效果用清除率(SA%)表示, 按下式計(jì)算：

SA(%)=[(Ac－As)/(Ac－A0)]×100%

式中：Ac為不加清除劑的吸光度;As為加入峰樣品后的吸光度;A0為試劑空白的吸光度。

1.2.6 蛋白含量測定

采用Bradford 檢測法[15,16]對所得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級鹽析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用了30%～100%硫酸銨飽和度的分級鹽析。得到不同飽和度鹽析出來組分的蛋白含量和抗氧化活性, 如表1所示。

由表1可以看出, 70%鹽析組分的比活力較大。因此采用70%鹽析的組分進(jìn)行下一步的分離純化。

表1 不同飽和度鹽析蛋白含量及活性Tab. 1 Protein content and antioxidant activity in samples prepared by (NH4) 2SO4 salting out

2.2 DEAE離子交換層析結(jié)果

用上述 70%硫酸銨飽和度鹽析組分濃縮后上DEAE離子交換層析, 洗脫圖譜見圖1。

從圖譜上可以看出, 在 280nm 檢測波長下, 一共洗脫出3個(gè)峰, 分別為D1、D2、D3將這3個(gè)峰樣品進(jìn)行蛋白含量和抗氧化活性測定, 結(jié)果見表 2。其中D3的蛋白含量和活性最強(qiáng), 作為進(jìn)一步純化的樣品。

2.3 Sepharose CL-6B凝膠層析結(jié)果

將上述DEAE離子交換層析得到的組分D3進(jìn)行Sepharose CL-6B凝膠層析。結(jié)果如圖2所示, 共得到3個(gè)組分, 分別命名為S1, YC-2, S3。

表2 DEAE分離的不同組分蛋白含量及活性Tab. 2 Protein content and antioxidant activity in proteins isolated by DEAE-cellulose chromatography

圖1 DEAE離子交換圖譜Fig. 1 DEAE Sepharose Fast Flow chromatography

圖2 Sepharose CL-6B凝膠層析圖譜Fig. 2 Sepharose CL-6B chromatography

將上述 3個(gè)樣品進(jìn)行蛋白含量和抗氧化活性測定, 結(jié)果見表3。

由表3可見, YC-2抗氧化活性最強(qiáng), 有待于進(jìn)一步對其鑒定分析。

2.4 電泳結(jié)果

將上述得到的 YC-2蛋白進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠和常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳, 結(jié)果如圖3、4所示, 圖4中YC-2的常規(guī)電泳顯示一條帶, 而圖3顯示YC-2電泳出現(xiàn)兩條帶, 這說明此蛋白可能有兩個(gè)亞基。由蛋白質(zhì) marker的標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出, YC-2大亞基的分子質(zhì)量為61.23 ku, 小亞基的分子質(zhì)量為45.39 ku。因此, YC-2蛋白的分子質(zhì)量為106.62 ku。

表3 Sepharose CL-6B分離的不同組分蛋白含量及活性Tab. 3 Protein content and antioxidant activity of proteins separated by Sepharose CL-6B chromatography

圖3 YC-2蛋白的SDS-PAGE電泳Fig. 3 SDS-PAGE of YC-2M為蛋白marker; 1為D3組分; 2為YC-2組分M： Proteins markers; Lane 1：D3; Lane 2： YC-2

圖4 YC-2蛋白的活性電泳 Fig. 4 Native-PAGE of YC-2

3 討論

近年來, 研究發(fā)現(xiàn)自由基與許多疾病如心血管病、癌癥及氧化脅迫的其他機(jī)能障礙密切相關(guān)[17,18]。人體細(xì)胞在氧化還原代謝過程中產(chǎn)生少量性質(zhì)活潑的氧自由基(活性氧) ,主要有超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)等[19]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,腫瘤發(fā)生、輻射致癌、心腦血管疾病、器官的缺血再灌流、藥物中毒、人體衰老等過程都涉及自由基和活性氧[20]。近年來, 隨著海洋生物技術(shù)研究的發(fā)展, 不斷從海洋生物中發(fā)現(xiàn)一些具有抗氧化活性的化合物, 如海藻多糖、殼聚糖及其衍生物等[21,22], 但從海洋蛋白資源中獲取具有抗氧化活性蛋白質(zhì)的研究報(bào)道很少?？O蟶是傳統(tǒng)的藥食兩用海洋貝類, 屬于軟體動物門雙殼綱真瓣鰓目平齒亞目, 在我國沿海地區(qū)普遍分布, 可入藥。早在《本草綱目》和《藥錄》中就記載了蟶肉的功效： 去邪熱、治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產(chǎn)后虛損、虛熱[23], 趙艷景等[13]發(fā)現(xiàn)在縊蟶粗提物中存在抗氧化活性較強(qiáng)的物質(zhì)。

本研究通過分級鹽析實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)在硫酸銨飽和度80%時(shí), 縊蟶蛋白的比活力最強(qiáng)。用硫酸銨飽和度為80%時(shí)的樣品進(jìn)行DEAE離子交換層析, 共得到3個(gè)組分, 其中活性最高的是在鹽濃度為 40%時(shí)洗脫下來的組分D3, 將D3透析凍干后, 進(jìn)行凝膠層析共得到 3個(gè)組分 S1、YC-2、S3, 其中 YC-2組分的活性最高, 將 YC-2進(jìn)行 SDS-PAGE和 native-PAGE,變性電泳結(jié)果為兩條帶, 非變性電泳結(jié)果為一條帶。因此判斷, YC-2有 2個(gè)亞基, 大亞基的分子質(zhì)量為61.23 ku, 小亞基的分子量為45.39 ku, 所以YC-2蛋白的分子質(zhì)量為106.62 ku。通過以上的分離純化步驟得到了一個(gè)電泳純的縊蟶蛋白, 并對其分子質(zhì)量和活性做了初步的分析。但對于縊蟶蛋白YC-2作為一種新型的抗氧化物的分子機(jī)制及其結(jié)構(gòu)、性質(zhì), 究竟是一種功能性蛋白還是一種新的酶, 還有待于進(jìn)一步研究。

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Extraction of YC-2 from Sinonovacula constricta and its antioxidant activity

ZHAO Yan-jing1, PEI Bo1, HU Hong2, WANG Ying3
(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;2. LianYunGang Higher Vocational Technical College of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222005,China; 3. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Jul., 30, 2009

Sinonovacula constricta; protein; separation and purification; antioxidant activity

Protein YC-2 was isolated from Sinonovacula constricta by water extraction, ammonia sulphate precipitation (80% saturation), ion exchange chromatography, and gel chromatography, and concentrated by freeze drying. SDS-PAGE and the thiobarbituric acid (TBA) method were used to identify various components and their antioxidant activities in Sinonovacula constricta extracxts. We found that YC-2, a dimeric proteins with a 61 ku large subunit and a 45 ku small subunit, had a high oxidation resistance, the removal rate on ? OH being 99.7 % at 0.627 g/L.

S185

A

1000-3096(2010)06-0034-05

2009-07-30;

2009-11-20

江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(HS07014); 江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)基金)——企業(yè)博士創(chuàng)新項(xiàng)目(BK2009641); 淮海工學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動基金( KQ07018)

趙艷景(1976-), 女, 河北保定人, 博士, 講師, 研究方向： 海洋生物活性物質(zhì), 電話： 13851263305, E-mail： zhaoyanjing1976@163.com

(本文編輯: 康亦兼)