鄧顯文, 謝芝勛, 劉加波, 龐耀珊, 謝志勤, 謝麗基, 董建寶

(廣西獸醫(yī)研究所, 廣西 南寧530001)

應(yīng)用二溫式PCR檢測診斷愛德華氏菌病

鄧顯文, 謝芝勛, 劉加波, 龐耀珊, 謝志勤, 謝麗基, 董建寶

(廣西獸醫(yī)研究所, 廣西 南寧530001)

根據(jù)愛德華氏菌(Edwardsiella)的16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物, 用二溫式PCR對(duì)6株愛德華氏菌均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的576 bp產(chǎn)物, 而對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、熒光假單胞菌(Pseudcmonas fluoroscercs)、柱狀屈撓桿菌(Cytophaga columnaris)、鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococci)、弧菌(Vibrio)、大腸桿菌(Escherichia colibacillus)和沙門氏菌(Salmonella)等10種病原體的擴(kuò)增, 結(jié)果全為陰性。該二溫式PCR可以檢測到1 pg的愛德華氏菌DNA模板和48個(gè)菌體。本實(shí)驗(yàn)建立的二溫式PCR為愛德華氏菌病的早期診斷與有效的防治提供了快速檢測方法, 對(duì)水產(chǎn)品的食品安全有重要的意義。

愛德華氏菌(Edwardsiella); 二溫式PCR; 檢測

愛德華氏菌(Edwardsiella)是目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有極大危害的病原菌,在已知愛德華氏菌屬(Edwardsiella Ewing and Mcwhorter 1965)中, 記述有遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、鲇魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictalur)和保科愛德華氏菌(Edwardsiella hoshinae)共3個(gè)種[1]。愛德華氏菌所引起的魚類傳染病不僅具有流行廣、發(fā)病率及死亡率高等特點(diǎn), 而且能引起多種魚類感染發(fā)病[2],同時(shí)由于集約化養(yǎng)殖, 導(dǎo)致魚類愛德華氏菌病等病害發(fā)生增多,已引起水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高度重視。目前, 愛德華氏菌病原分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測等傳統(tǒng)方法都無法快速檢測鑒別愛德華氏菌, 不能適應(yīng)規(guī)?；B(yǎng)殖的需要, 因此應(yīng)用特異、快速、敏感的聚合酶鏈反應(yīng)式(PCR)檢測愛德華氏菌技術(shù)就顯得非常重要。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)愛德華氏菌的16S rDNA基因序列, 設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物, 建立了二溫式 PCR快速檢測診斷愛德華氏菌的方法,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

草魚嗜水氣單胞菌(H5)、溫和氣單胞菌(0392)、熒光假單胞菌(武漢大學(xué))、柱狀嗜纖維菌(03135)、歐曼遲緩愛德華氏菌(03134) 均從中國農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物病原庫購買; 羅非魚遲緩愛德華氏菌(Etgx0601)[3],斑點(diǎn)叉尾遲緩愛德華氏菌(Etgx0704)、斑點(diǎn)叉尾鲇魚愛德華氏菌(Eigx0501, Eigx0602,Eigx0703)[4]、羅非魚嗜水氣單胞菌(AGX1,AGX4)[5]、鏈球菌、河弧菌、大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌由本室分離鑒定并保存。

1.2 試劑與儀器

PCR試劑盒PMD18-T試劑盒購自大連寶生生物技術(shù)有限公司; 100 bp DNA ladder購自北京天為時(shí)代科技有限公司; DNA片斷回收試劑盒購自BioDev公司; PCR儀購自美國Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。

引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)愛德華氏菌株的16S rDNA基因(DQ985469), 設(shè)計(jì) 1對(duì)引物 XZE7b,XZE8, 其中XZE7b與16S rDNA基因的38～56位核苷酸相同, XZE8與16S rDNA 基因的613～596位的核苷酸互補(bǔ)。這對(duì)引物可擴(kuò)增出長度為576 bp的DNA片段。并通過 blast驗(yàn)證, 該引物由上海生物工程中心合成, 引物序列如下：

XZE7b： 5′-GCT TGC TTT CTC CGC TGA C-3′XZE8： 5′-CTC TAG CTT GCC AGT CTT-3′

1.3 DNA抽提

將菌株分別接種于LB培養(yǎng)基, 30℃培養(yǎng)24～48 h至變混濁時(shí), 離心收集菌體, 用PBS緩沖液洗滌2次后, 用適當(dāng)TE緩沖液懸浮沉淀, 參照文獻(xiàn)[6]方法抽提其DNA, 對(duì)照菌(毒)株的DNA的抽提則按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

在100 μL的反應(yīng)體系中含： 25 mmol MgCl25 μL,10×PCR buffer 10 μL, 10 mmol dNTP×2 μL, Taq 聚合酶5單位0.5 μL, 上游引物和下游引物各300 μg,模板各 5 μL。

1.5 PCR各反應(yīng)條件的優(yōu)化

以愛德華氏菌株培養(yǎng)物抽提的DNA為模板, 對(duì)PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化, 以確定最佳的PCR模式。

1.6 PCR特異性試驗(yàn)

將已提取的愛德華氏菌、歐曼嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、嗜纖維菌的DNA以及對(duì)照菌(毒)株的DNA分別加入到含有XZE7b, XZE8引物的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增, 檢測其特異性。

1.7 PCR的敏感性

測定Etgx0601愛德華氏菌株模板的DNA含量后, 按10倍遞增稀釋, 同時(shí)加入到最佳的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增, 檢測其敏感性。取培養(yǎng)好的菌液按10倍遞增稀釋,從每管中吸取 2 μL稀釋菌液直接加入到最佳的 PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增, 檢測其敏感性, 同時(shí)從10-6, 10-7倍稀釋管中分別取0.1mL進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.8 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測序

用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物, 將PCR產(chǎn)物克隆至PMD18-T, 用PCR快速鑒定, 陽性克隆菌送大連寶生生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化

通過對(duì)PCR的引物濃度、各反應(yīng)溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化, 最后確定 PCR中引物的最佳工作濃度分別XZE7b, XZE8各為300 μg; PCR的最佳反應(yīng)模式為 94℃變性 5 min, 然后進(jìn)入 94℃變性1 min, 65℃退火 1.5 min的循環(huán), 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后再經(jīng)65℃延伸10 min后, 于4℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用該程序?qū)鄣氯A氏菌株DNA及對(duì)照菌毒株DNA分種類進(jìn)行病原體(嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、嗜纖維菌、鏈球菌、 河弧菌)的 PCR擴(kuò)增, 結(jié)果愛德華氏菌株只擴(kuò)增出576 bp一條帶, 而其他對(duì)照菌毒株均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶, 愛德華氏菌 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 愛德華氏菌PCR特異性試驗(yàn)Fig. 1 PCR specifically amplifies the target Edwardsiella DNA1.100 bp DNA ladder; 2. 歐鰻遲緩愛德華氏菌; 3. 羅非魚遲緩愛德華氏菌; 4～6.斑點(diǎn)叉尾鲇魚愛德華氏菌; 7. 斑點(diǎn)叉尾遲緩愛德華氏菌; 8. 溫和氣單胞菌; 9. 熒光假單胞菌; 10. 柱狀嗜纖維菌; 11. 鏈球菌; 12, 13. 羅非魚嗜水氣單胞菌; 14. 弧菌;15. 大腸桿菌; 16. 沙門氏菌; 17.葡萄球菌1.100 bp DNA ladder; 2. Edwarsiella tarda in European eels (Anguillia anguillia); 3. Etgx0601; 4～6. Eigx0501, Eigx0602, Eigx0703;7. Etgx0704; 8. Aeromonas sobria; 9. Pseudcmonas fluoroscercs;10. Cytophaga columnaris; 11. Streptococcus; 12,13. AGX1, AGX4;14. Vibrio; 15. Escherichia colibacillus; 16. Salmonella; 17. Staphylococci

2.3 PCR的敏感性擴(kuò)增結(jié)果

愛德華氏菌PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果及菌體敏感性試驗(yàn)結(jié)果分別見圖 2和圖 3。經(jīng)過敏感性測定,PCR最低能檢出1pg 愛德華氏菌株DNA模板(圖2);經(jīng)10-7倍稀釋管中取0.1mL進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)為24個(gè)菌落, 即每毫升原菌液中含 2.4×109個(gè)菌, PCR最低能檢出48個(gè)菌體(圖3)。

圖2 愛德華氏菌PCR的敏感性試驗(yàn)Fig. 2 Detection limit of Edwardsiella DNA by PCR1. 100 bp DNA ladder; 2. 10 ng; 3. 1 ng; 4. 100 pg; 5. 10 pg; 6. 1 pg;7. 100 fg; 8. 10 fg; 9. 1 fg

圖3 愛德華氏菌PCR的菌體敏感性試驗(yàn)Fig. 3 Detection limit of Edwardsiella by PCR 1. 100 bp DNA ladder; 2. 4.8×106個(gè)菌; 3. 4.8×105個(gè)菌; 4. 4.8×104個(gè)菌; 5. 4.8×103個(gè)菌; 6. 4.8×102個(gè)菌; 7. 4.8×10個(gè)菌; 8. 4.8個(gè)菌; 9. 0個(gè)菌1. 100 bp DNA ladder; 2. 4.8×106 bacteria; 3. 4.8×105 bacteria;4. 4.8×104 bacteria; 5. 4.8×103 bacteria; 6. 4.8×102 bacteria;7. 4.8×10 bacteria; 8. 4.8 bacteria; 9. 0 bacteria

2.4 測序結(jié)果與序列分析

經(jīng)測序與序列Blast比對(duì)分析, 證明了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與設(shè)計(jì)大小 576 bp 相符, DNA序列與引物設(shè)計(jì)模板(DQ985469)16S rDNA基因?qū)?yīng)片段的同源性為100%。

3 討論

魚類集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致魚類愛德華氏菌病等病害增多, 遲鈍愛德華氏菌還是一種重要的人畜共患病的病原菌, 是愛德華氏菌屬中唯一感染人的菌種[7]。人們通過接觸帶有遲鈍愛德華氏菌的動(dòng)物或水產(chǎn)品甚至觀賞性魚類都有可能受到感染[8]。目前, 魚類愛德華氏菌的傳統(tǒng)診斷方法包括病原分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測等方法, 但這些傳統(tǒng)方法都無法快速鑒別愛德華氏菌, 不能適應(yīng)規(guī)模化養(yǎng)殖的需要。因此本試驗(yàn)建立的能簡便、快速、特異、敏感地檢測鑒定愛德華氏菌, 便于在漁業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的二溫式 PCR,對(duì)于在魚類愛德華氏菌病的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果, 切斷其傳播途徑有重要意義。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)針對(duì)愛德華氏菌株 16S rDNA基因序列保守區(qū)域的 1對(duì)引物對(duì)魚類愛德華氏菌分離株進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增結(jié)果均能擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)大小相符的576 bp條帶, 該片斷測序結(jié)果與原參照序列基因組成一致, 而該P(yáng)CR對(duì)其他10種病原體則均不能擴(kuò)增出任何條帶, 說明本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)愛德華氏菌株DNA的擴(kuò)增是特異的。該二溫式PCR的敏感性最低可檢測到1 pg的魚類愛德華氏菌株總DNA,用菌液直接加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增最低能檢出 48個(gè)菌體, 如此高的特異性和敏感性, 提示該技術(shù)不但可以用于對(duì)該病的診斷, 也可用于表面健康的帶毒魚的檢疫和感染初期或潛伏期的魚的檢測及環(huán)境監(jiān)測。研究表明該方法可以有效地預(yù)防和治療魚類的愛德華氏菌病,以確保魚類養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展。

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Detection of Edwardsiella by two-temperature PCR

DENG Xian-wen, XIE Zhi-xun, LIU Jia-bo, PANG Yao-shan ,XIE Zhi-qin, XIE Li-ji,DONG Jian-bao
(Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning, 530001, China)

Dec., 26, 2007

Edwardsiella; two-temperature PCR; detection

One pair of primers were designed and synthesized according to the published sequence of the 16S rDNA of Edwardsiella. A two-temperature polymerase chain reaction method was developed for detection of Edwardsiella. DNAs isolated from six Edwardsiella strains were amplified by the two-temperature PCR, leading to the PCR products of 576 bp. But the other 10 pathogens, such as Aermonas hydrophila, Aermons sobria, Pseudomonas fluorescens, Cytophaga columnaris, Streptococcus, Staphylococci, Vibrio, Escherichia colibacillus and Salmonella,failed to show any positive results. It was found that as little as 1 pg of Edwardsiella DNA and 48 bacteria were sufficient to be detected by this method. This two-temperature PCR provides a rapid diagnostic method for early identification and control of Edwardsiella in the field of aquatic food safety.

Q789

A

1000-3096(2010)03-0032-03

2007-12-26;

2009-07-09

廣西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(0428001-2)

鄧顯文(1963-), 男, 廣西賀州人, 副研究員,學(xué)士, 主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究; 謝芝勛, 通信作者, E-mail： Xiezhixun@126.com

(本文編輯： 劉珊珊)