徐先棟, 謝珍玉, 王世鋒, 宣雄智, 周永燦

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院, 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 ?？?570228)

致病溶藻弧菌脂多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚毒性和免疫原性的影響

徐先棟, 謝珍玉, 王世鋒, 宣雄智, 周永燦

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院, 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 ?？?570228)

以熱酚水抽提法提取致病溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粗脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS), 并將不同濃度的溶藻弧菌粗LPS通過腹腔注射法接種點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides), 研究該LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚毒性和免疫原性的影響, 并同弱致病溶藻弧菌粗LPS及高純度大腸桿菌(Escherichia coli)LPS對(duì)石斑魚的刺激效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明： 溶藻弧菌致病株和弱致病株粗LPS均對(duì)石斑魚具有比較強(qiáng)的毒性, 溶藻弧菌LPS對(duì)石斑魚的免疫原性隨LPS濃度的增高而增強(qiáng), 高純度大腸桿菌LPS對(duì)石斑魚的免疫原性效果要優(yōu)于溶藻弧菌粗LPS。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus); 脂多糖; 毒性; 免疫原性

脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)是位于革蘭氏陰性菌(G-)細(xì)胞壁最外層的類脂多糖類物質(zhì), 是 G-病原菌致病物質(zhì)內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)[1], 同時(shí), LPS也具有良好的免疫原性, 可以刺激增強(qiáng)受免機(jī)體的免疫力[2～4], 為魚用免疫制劑的研究和應(yīng)用提供了一條良好途徑。目前, 有關(guān) LPS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫原性影響的研究報(bào)道很多[5～8], 但將LPS的毒性及免疫原性結(jié)合起來研究報(bào)道較少, 為此, 本研究利用熱酚水抽提法[9]提取的海水養(yǎng)殖動(dòng)物常見病原菌——溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的LPS, 并以該LPS為研究對(duì)象, 對(duì)致病力不同的溶藻弧菌粗制 LPS的毒性進(jìn)行了初步的比較, 同時(shí), 也選擇了高純度大腸桿菌(Escherichia coli)作為對(duì)照, 比較溶藻弧菌粗制 LPS與高純度的大腸桿菌 LPS 對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)的免疫刺激效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌及LPS試劑

本實(shí)驗(yàn)采用的致病菌株 HN08155為 2006年 5月從海南陵水某石斑魚養(yǎng)殖魚排患病點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabarieus),體內(nèi)分離獲得的菌株, 經(jīng)分離純化, 生化鑒定, 及溶藻弧菌快速檢測(cè)試劑盒(專利號(hào)： ZL01130127.9, 中國科學(xué)院南海海洋研究所)鑒定和攻毒實(shí)驗(yàn)確定為致病性溶藻弧菌, Genbank登錄號(hào) FJ906748。弱致病菌株 HN07006為 2006年 6月從海南海口周邊海域水體中分離, 經(jīng)純化, 生化鑒定, 溶藻弧菌快速檢測(cè)試劑盒鑒定和攻毒實(shí)驗(yàn)確定為弱致病性溶藻弧菌, Genbank登錄號(hào)FJ906747。菌種于-80℃冰箱保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)石斑魚

實(shí)驗(yàn)用點(diǎn)帶石斑魚購自海南陵水養(yǎng)殖場(chǎng), 為體質(zhì)量50 g±10 g的無患病史的健康個(gè)體。試驗(yàn)魚在室內(nèi)玻璃水族缸(50 cm×40 cm×50 cm)中經(jīng)7 d充氣暫養(yǎng)無異常后按實(shí)驗(yàn)要求分組, 每個(gè)水族箱放養(yǎng)點(diǎn)帶石斑魚8尾, 每天定時(shí)投喂新鮮小雜魚1次, 投喂量為魚體質(zhì)量的1.0%, 實(shí)驗(yàn)水溫為28 ℃±2 ℃。

1.2 方法

1.2.1 脂多糖的提取

脂多糖的提取按改良的熱酚水抽提法[9]進(jìn)行,具體如下：

A. 經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液以5 000 r/min 離心5 min,沉淀稱濕質(zhì)量, 收集后置4 ℃保存;

B. 取5 g 細(xì)菌懸浮于15 mL濃度為50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0, 內(nèi)含5 mmol/L的EDTA)中,-80 ℃作用15 min, 室溫解凍, 反復(fù)凍融 5次;

C. 加入100 mg 溶菌酶, 4 ℃過夜, 再在37 ℃溫育30 min;

D. 加入 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0, 內(nèi)含5 mmol/L EDTA, 20 mmol/L MgCl2) 至 30 mL, 加入RNase和 DNase 加至終質(zhì)量濃度為 5 μg/mL, 懸液37 ℃溫育 3 h; 加入蛋白酶 K, 至終質(zhì)量濃度為5 μg/ mL, 50 ℃溫育 2 h;

E. 置于 70 ℃的水浴中平衡后, 加入相同體積的預(yù)熱至70 ℃的酚, 充分劇烈混合并作用20 ～ 30 min;

F. 用冰水浴快速冷卻15 min, 10 000 r/min離心(4 ℃ )15 min,離心后分3層(由上至下分別為含LPS的水層、含變性蛋白的酚層和含其他物質(zhì)的不溶層),小心吸取上層水相裝于透析袋;

G. 用蒸餾水透析3 d(4 ℃), 每天換水?dāng)?shù)次;

H. 聚乙二醇2 000濃縮為原來體積的1/4;

I. 1500 r/min離心 30 min, 棄沉渣, 收集上清,經(jīng)冷凍干燥后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂多糖的檢測(cè)

所分離的LPS先經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳, 再以Tsai 等[10]的方法銀染檢測(cè)。

1.2.3 LPS毒性試驗(yàn)

LPS毒性試驗(yàn)按以下方法進(jìn)行分組： 第1～7組為腹腔注射以滅菌磷酸緩沖液(PBS, pH7.2)配制的溶藻弧菌HN08155菌株粗制LPS溶液, 其質(zhì)量濃度分別為80、40、20、10、5、2.5和1.25 g/L; 第8組為腹腔注射以滅菌PBS配制的溶藻弧菌HN07006菌株粗制LPS溶液, 其質(zhì)量濃度為40 g/L; 第9組為腹腔注射購自 Sigma公司的大腸桿菌LPS溶液, 其濃度為2 g/L; 第10組為對(duì)照組, 腹腔注射無菌PBS。上述配制的各組LPS溶液經(jīng)65 ℃加熱10 min[6], 每組分別注射8尾點(diǎn)帶石斑魚, 注射劑量為0.1 mL/尾。每組設(shè)置1個(gè)重復(fù)(每組接種16尾石斑魚)。首次接種7 d后, 對(duì)存活的各組實(shí)驗(yàn)點(diǎn)帶石斑魚再以相同的方法加強(qiáng)注射1次。每天觀察, 統(tǒng)計(jì)各組點(diǎn)帶石斑魚的死亡率。

1.2.4 LPS免疫原性測(cè)定

第2次注射LPS 28 d后, 取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(即實(shí)驗(yàn)石斑魚數(shù)量≥5尾, 或加上重復(fù)組實(shí)驗(yàn)石斑魚數(shù)量≥10尾)[13]的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行 LPS免疫原性測(cè)定。每組隨機(jī)撈取5尾供試點(diǎn)帶石斑魚, 尾靜脈取血。每尾魚的血液分2份, 先取約50 μL添加肝素抗凝, 按沈萍等[11]方法測(cè)定吞噬細(xì)胞的吞噬活性; 剩余部分不添加肝素, 于室溫下傾斜放置 1 h后, 置4 ℃冰箱過夜, 1 000 r/min離心10 min分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆? 用于測(cè)定血清抗菌活性、溶菌活性和酚氧化酶(PO： Polyphenol oxidase)活性, 測(cè)定方法同王雷等[12]方法。

2 結(jié)果

2.1 LPS的提取及檢測(cè)

用 2216E培養(yǎng)液分別培養(yǎng) 2 L 溶藻弧菌HN08155菌株和HN07006菌株, 培養(yǎng)36 h后離心各得菌液45 mL。采用改良的熱酚水抽提法獲得粗LPS溶液各50 mL。分別取溶藻弧菌HN08155菌株粗制LPS溶液和HN07006菌株粗制LPS溶液10 μL, 經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)和銀染, 結(jié)果(圖 1)表明, 溶藻弧菌HN08155菌株粗制LPS和HN07006菌株粗制LPS存在明顯差異, 其中, HN07006菌株的LPS明顯可見8條分子質(zhì)量大小不一的條帶, 而HN08155菌株的 LPS除 2條明顯可辨的小分子質(zhì)量條帶外, 其他部分呈彌散狀態(tài)。

圖 1各膠孔處未見染色表明無殘留不溶于水的多糖類物質(zhì), 且 LPS提取過程中使用大量蛋白酶 K處理, 避免蛋白質(zhì)污染, 因而本實(shí)驗(yàn)所提的 LPS具有較高的純度。本實(shí)驗(yàn)所得溶藻弧菌HN08155菌株粗制LPS和溶藻弧菌HN07006菌株粗制LPS濃縮溶液各 30 mL, 經(jīng)冷凍干燥后, 分別獲得干燥的粉末512 mg和351.7 mg。

圖1 不同LPS的SDS-PAGE電泳檢測(cè)銀染結(jié)果Fig. 1 The silver-stain result of SDS-PAGE for different LPSs1. 溶藻弧菌HN08155菌株粗制LPS; 2. 溶藻弧菌HN07006菌株粗制LPS; 3.大腸桿菌(E.coli)LPS1. the rough LPS of V. alginolyticus HN08155; 2. the rough LPS of V. alginolyticus HN07006; 3. the LPS of E.coli

2.2 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的毒性

通過腹腔注射溶藻弧菌致病菌株HN08155和弱致病菌株 HN07006粗制 LPS溶液和大腸桿菌 LPS溶液, 檢測(cè) LPS溶液對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的毒性結(jié)果表明(表1), 溶藻弧菌致病菌株HN08155粗制LPS注射劑量在0.25 mg/尾以下時(shí), 實(shí)驗(yàn)點(diǎn)帶石斑魚100%成活;注射劑量達(dá)0.5 mg /尾以上時(shí), 實(shí)驗(yàn)石斑魚開始死亡;注射劑量達(dá)4 mg/尾以上時(shí), 死亡率達(dá)100%。溶藻弧菌弱致病性菌株 HN07006粗制 LPS注射劑量為 4 mg/尾時(shí), 實(shí)驗(yàn)石斑魚死亡率也達(dá)到 100%, 說明溶藻弧菌致病菌株 HN08155和弱致病菌株 HN07006粗制 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚均具有較強(qiáng)的毒性, 并且,實(shí)驗(yàn)中可觀察到點(diǎn)帶石斑魚瀕死前出現(xiàn)抽搐癥狀。大腸桿菌LPS的注射劑量為0.2 mg/尾時(shí), 實(shí)驗(yàn)點(diǎn)帶石斑魚未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2.3 吞噬細(xì)胞的吞噬活性

LPS經(jīng)毒性檢測(cè)后, 根據(jù)在數(shù)量上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原則(即實(shí)驗(yàn)石斑魚數(shù)量≥5尾, 或加上重復(fù)組實(shí)驗(yàn)石斑魚數(shù)量≥10尾)[13], 取實(shí)驗(yàn)組 4、組 6、組7、組9和對(duì)照組10進(jìn)行免疫活性測(cè)定, 其中, 各組吞噬細(xì)胞的吞噬活性的測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果表明,各實(shí)驗(yàn)組點(diǎn)帶石斑魚血液中吞噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。其中, 在溶藻弧菌致病性菌株HN08155粗制LPS的安全接種范圍內(nèi),點(diǎn)帶石斑魚血液吞噬細(xì)胞的吞噬活性隨該LPS的接種劑量增加而增強(qiáng); 溶藻弧菌致病性菌株 HN08155粗制LPS的接種量為1 mg/尾時(shí)(實(shí)驗(yàn)第4組), 對(duì)石斑魚血液吞噬細(xì)胞的吞噬活性與接種0.2 mg/尾的大腸桿菌LPS相當(dāng)。

2.4 血清的抗菌活性、溶菌活性及酚氧化酶活性

點(diǎn)帶石斑魚經(jīng)LPS加強(qiáng)免疫刺激28 d后, 其血清進(jìn)行溶菌活性、抗菌活性及酚氧化酶活性檢測(cè), 結(jié)果見表3和表4。由表3可見, 注射0.2 mg/尾大腸桿菌 LPS組各項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)為最強(qiáng), 顯示大腸桿菌 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚產(chǎn)生良好的免疫刺激效果, 注射1 mg/尾量的溶藻弧菌致病菌株HN08155粗制LPS組點(diǎn)帶石斑魚的效果次之, 接種低濃度(0.25 mg/尾和0.125 mg/尾)溶藻弧菌致病菌株HN08155粗制LPS組對(duì)石斑魚血清的溶菌活性、抗菌活性及酚氧化酶活性的刺激作用最差。

表1 不同LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的毒性Tab. 1 The lethalities of different LPSs on E. malabaricus

表2 點(diǎn)帶石斑魚血液中吞噬細(xì)胞吞噬活性比較Tab. 2 Comparison of phagocytic activities of leucocytes of E. malabaricus immunized by different LPSs

表3 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血清及抗菌活性和溶菌活性的影響Tab. 3 The influences of LPSs on serum antibacterial and lysozyme activities in E. malabaricus

表4 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血清酚氧化酶活性的影響Tab. 4 The influences of LPS on serum phenol oxidase (PO) activities in E. malabaricus

3 討論

已有研究表明, 不同來源的 LPS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物都具有較強(qiáng)的毒性, 在一定濃度范圍內(nèi), 隨著接種劑量的增加, 其致死率也隨著增加。葉劍敏等[13]以 17 mg/kg魚的劑量為40 ～ 70 g赤點(diǎn)石斑魚接種溶藻弧菌 LPS, 可造成 40%供試石斑魚死亡; 周永燦等[14]以嗜麥芽假單胞菌 LPS接種卵形鯧 , 結(jié)果表明該LPS對(duì)卵形鯧 (Trachinotus ovatus)最低致死劑量大于80 mg/kg; 陳昌福等[15]以魚害粘球菌(Myxococcus piscicola)LPS腹腔接種草魚, 結(jié)果表明該 LPS對(duì)50 ～100 g草魚造成傷害的劑量為5 mg/kg, 全致死劑量為 25 mg/kg; 張建設(shè)等[16]測(cè)定的副溶血弧菌 LPS對(duì)牙鲆的最低致死劑量為 60 mg/kg; 此外, 陳昌福等[17]以45 mg/kg 魚的劑量對(duì)鱖(Siniperca chuatsi)接種嗜水氣單胞菌 LP卻未發(fā)現(xiàn)中毒癥狀; Matsuyama等[18]以2 ～ 10 mg/kg的多種LPS接種鯉魚也未發(fā)現(xiàn)異常反應(yīng)。本研究用熱酚水抽提法提取的溶藻弧菌粗 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的毒性研究結(jié)果也表明, 該溶藻弧菌粗提 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚也具有較強(qiáng)毒性, 粗LPS的接種量為 9 mg/kg時(shí), 點(diǎn)帶石斑魚致死率為65.5%; 而粗LPS接種量為72 mg/kg時(shí), 受免點(diǎn)帶石斑魚的死亡率為100%。作者制備的溶藻弧菌粗LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的最低致死劑量為5 mg/kg, 其毒性與陳昌福等[15]制備的魚害粘球菌 LPS相當(dāng), 但強(qiáng)于葉劍敏等[13]制備的溶藻弧菌 LPS、周永燦等[14]制備的嗜麥芽假單胞菌 LPS、張建設(shè)等[16]制備的副溶血弧菌LPS、陳昌福等[17]制備的嗜水氣單胞菌LPS以及Matsuyama等[18]研究的多種LPS。

作者對(duì)致病性溶藻弧菌菌株HN08155粗制LPS和弱致病性溶藻弧菌菌株HN07006粗制LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的毒性差異研究結(jié)果表明, 盡管兩者SDS-PAGE 條帶的銀染結(jié)果存在明顯差異, 但它們對(duì)點(diǎn)帶石斑魚毒性相當(dāng), 以4 mg/尾的用量接種50 g左右的點(diǎn)帶石斑魚后, 兩者均可造成接種石斑魚100%死亡, 這說明溶藻弧菌LPS的2條分子質(zhì)量最小條帶不是其菌株毒力的主要成分, 同時(shí)也表明LPS不是溶藻弧菌關(guān)鍵毒力因子。

國內(nèi)外很多研究報(bào)道均表明, LPS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有良好的免疫保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明, 以 1 mg/尾的劑量對(duì)點(diǎn)帶石斑魚接種(實(shí)驗(yàn)第 4組)的 LPS后, 血液中白細(xì)胞吞噬活性、血清抗菌活性、溶菌活性及酚氧化酶活性與對(duì)照組相比均明顯增強(qiáng), 說明溶藻弧菌的 LPS也對(duì)提高點(diǎn)帶石斑魚非特異性免疫保護(hù)力作用顯著。但本研究結(jié)果也表明, 產(chǎn)生良好免疫保護(hù)作用的LPS劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也產(chǎn)生一定的毒性, 一般情況下, 在安全劑量范圍內(nèi)的 LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的免疫保護(hù)效果不強(qiáng), 因此, 應(yīng)用溶藻弧菌LPS作為免疫制劑需權(quán)衡其毒性和免疫保護(hù)作用的利弊, 這與鄢慶枇等[19]利用該菌的 LPS對(duì)大黃魚(Pseudosciaena crocea Richardson)毒性和免疫效果研究結(jié)果一致。不過, 簡(jiǎn)紀(jì)常等[5]利用3.2 mg/尾劑量的溶藻弧菌 LPS接種 40 ～ 70 g赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)的研究結(jié)果則表明, 該濃度的溶藻弧菌 LPS不但對(duì)赤點(diǎn)石斑魚沒有毒性, 還可誘導(dǎo)提高赤點(diǎn)石斑魚的非特異性免疫功能, 說明不同試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)溶藻弧菌LPS的敏感性可能存在差異。此外, 本研究采用低劑量(0.2 mg/尾)、高純度的大腸桿菌LPS刺激點(diǎn)帶石斑魚的結(jié)果也表明, 該LPS不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)帶石斑魚沒有明顯毒性, 比本研究制備的溶藻弧菌 LPS還有更好的免疫保護(hù)效果, 說明不同菌種來源的LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的毒性和免疫保護(hù)作用也可能存在差異。

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Toxicity and immunogenicity of LPS from pathogenic Vibrio alginolyticus to grouper, Epinephelus malabaricus

XU Xian-dong, XIE Zhen-yu, WANG Shi-feng, XUAN Xiong-zhi, ZHOU Yong-can
(Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province; College of Marine Science, Hainan University, Haikou 570228, China)

Apr., 20, 2009

Vibrio alginolyticus; lipopolysaccharides; toxicity; immunogenicity

In order to study the toxicity and immunogenicity of the LPS from pathogenic Vibrio alginolyticus to Epinephelus malabaricus, the crude LPS was extracted by hot phenol-water extraction, and was intraperitoneally injected to healthy groupers at different concentrations. It was found that crude LPSs from both the pathogenic strain and the weak pathogenic strain of V. alginolyticus were highly toxic to groupers. The immunogenicity of the crude LPS from V. alginolyticus to the groupers was enhanced at elevated concentrations of LPS. The immunogenicity of high purity LPS from E.coli to the groupers was better than the crude LPS from V. alginolyticus.

S942.5

A

1000-3096(2010)03-0047-05

2009-04-20;

2009-08-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30660144); 新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-05-0755); 海南大學(xué)2009年度科研項(xiàng)目(hd09xm57)

徐先棟(1982- ), 男, 江西鄱陽人, 碩士研究生, 研究方向：水生生物病害及其控制, 電話： 15270927610, E-mail： xuxd2009@163.com,周永燦, 通信作者, E-mail： zychnu@163.com

(本文編輯： 康亦兼)