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        渦流色譜技術在生物樣品分析中的應用

        2010-10-21 03:47:22周建良安婧婧
        色譜 2010年2期
        關鍵詞:雙柱渦流填料

        劉 朋, 周建良, 安婧婧, 李 萍

        (現(xiàn)代中藥教育部重點實驗室,中國藥科大學生藥學教研室,江蘇南京210009)

        渦流色譜技術在生物樣品分析中的應用

        劉 朋, 周建良, 安婧婧, 李 萍*

        (現(xiàn)代中藥教育部重點實驗室,中國藥科大學生藥學教研室,江蘇南京210009)

        生物樣品的復雜性使其在進行分析測定前必須經過處理。傳統(tǒng)的樣品前處理方法(如液-液萃取、固相萃取等)耗時長且操作繁瑣。渦流色譜作為在線萃取技術,可以實現(xiàn)生物樣品直接進樣,減少了樣品處理步驟,有效富集純化了分析物,是一種高通量、高選擇性的生物樣品前處理方法。為此,本文介紹了渦流色譜技術的原理及優(yōu)勢,并總結了不同渦流柱的特點及其在生物樣品分析領域中的應用情況。

        渦流色譜;樣品前處理;生物樣品

        Abstract:The complexity of biological fluids makes the sample p reparation necessary in the analytical process.The traditional techniques,such as liquid-liquid extraction and solid-phase extraction,are time-consuming and labor-intensive.Turbulent flow Chromatography(TFC),as an on-line direct injection technique,possesses the advantages of reducing sam p le p reparation steps and enabling the effective p re-concentration and clean-up of biological fluids.Therefore,it is a high-throughput and high-selectivity technique for biological sample pretreatment.In this review,the theory,advantages,characteristics and current status of TFC in bioanalysis are introduced and summarized.

        Key words:turbulent flow Chromatography(TFC);sample pretreatm ent;biological samples

        藥物研究過程中,生物樣品分析是其中的一個重要環(huán)節(jié)。生物樣品尤其是血液樣品分析時,最主要的問題是樣品中生物大分子如蛋白質、核酸等雜質的干擾。首先,蛋白質可能會與待測物結合,影響分析物的回收率;其次,如果直接進樣,生物大分子遇有機相易發(fā)生變性,變性后的大分子就會造成色譜柱堵塞及分析物在固定相上傳質效率下降等不利后果,從而使柱效降低、吸附容量下降、分析柱壽命縮短,最終會嚴重干擾小分子分析物的準確測定[1]。另外,生物樣品基質復雜,待測物含量往往很低。所有這些情況決定了分析過程中生物樣品的凈化和富集(樣品前處理)是一個不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

        傳統(tǒng)的生物樣品前處理方法主要包括蛋白質沉淀、液-液萃取(LLE)等。這些方法的靈敏度較低,易導致雜質與分析物的共沉淀和質譜檢測信號的抑制[2-6]。近些年發(fā)展起來的固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPM E)、膜萃取(超濾、微透析)等方法雖然提高了靈敏度,但是仍然需要繁瑣的樣品處理過程,耗時費力,不能滿足高通量分析的需要[7-9]。而渦流色譜(turbulent flow Chromatography,TFC)技術則可以在線處理生物樣品,速度快、選擇性好、靈敏度高,易于實現(xiàn)自動化,近年來在生物領域尤其是體內藥物分析中得到了廣泛的應用。為此,本文就渦流色譜的原理及其在生物樣品前處理中的應用進行了綜述。

        1 原理

        渦流色譜技術是利用大粒徑填料使流動相在高流速下產生渦流狀態(tài),從而對生物樣品進行凈化與富集。這一概念早在19世紀60年代就已經提出,Pretorius等[10]指出在基于開管柱的色譜分析中,相對于一般的層流式,流動相在渦流狀態(tài)下可以使分析時間明顯縮短。然而這項技術并沒有迅速應用至填充柱中,因為產生渦流態(tài)需要流動相具有高流速,會造成柱壓太大,在實際應用中難以實現(xiàn)[11]。直到1997年Q uinn和Takarew ski[12]才解決了這一技術難題。他們使用了大顆粒的烷基鍵合硅膠柱,使得其在高流速(7.6cm/s)下也可以保持低柱壓。在這樣高的流速下,流動相不再是層流式而是渦流式;溶劑前沿也不再是典型的拋物型,而變成了塞型(如圖1所示)。

        圖1 不同流速下流動相的流態(tài)Fig.1 F low p rofiles of m ob ile p hase a t d iffe ren t flow ra tes

        根據(jù)經典的范氏方程(Van D eem ter equation),當流速很高時,理論塔板高度會隨之增大,塔板數(shù)減小,分離效率降低。但是這里并不能用范氏方程來解釋,因為在渦流狀態(tài)下,溶質分子傳質加快,傳質阻抗減小,實際的塔板高度要比范氏方程預測的低得多。雖然其流速很高,但分離效率并沒有隨之降低。形成這種情況主要有兩方面的原因:一方面,在流動相中,溶質分子都存在濃度趨向均一的擴散,渦流狀態(tài)可以增大溶質在柱內的濃度梯度變化,使分子擴散加快;另一方面,高流速下的流動相會在柱內有回流和旋轉運動,從而形成旋渦,也會加快溶質分子從流動相到固定相的傳質過程[13]。在這種情況下,大分子的基質成分如蛋白質等,還未能擴散進入填料顆粒內部就已被洗出柱外,而小分子的待測物則可以保留下來,與基質分離?,F(xiàn)在常用一個無量綱的參數(shù)雷諾數(shù)(Reynolds num ber,Re)來說明這種流態(tài)。雷諾數(shù)是表征流體流動特性的一個重要參數(shù),Re=uρd/μ,其中u是流動相的線速度,ρ是流動相密度,d是柱內徑(開管柱)或柱填料顆粒粒徑(填充柱),μ是流動相的黏度系數(shù)。雷諾數(shù)越大,越容易產生渦流狀態(tài)。為此,渦流系統(tǒng)采用了大粒徑(20~60μm)填料,并使流動相在高流速下運行來得到較大的雷諾數(shù)。在開管柱中,一般認為臨界雷諾數(shù)為2 000,小于這個臨界值為層流狀態(tài),反之為渦流狀態(tài)。而在填充柱中,臨界雷諾數(shù)還存有爭議[13-15]。目前較一致的觀點是:(1)從層流態(tài)到渦流態(tài)的過程是漸變的,存在一個過渡狀態(tài);(2)填充柱的臨界雷諾數(shù)比開管柱低得多。對于填充柱中臨界雷諾數(shù)的問題,還需要流體動力學方面的進一步研究。

        當然,渦流色譜技術的快速分離能力是毋庸置疑的。隨著該技術的發(fā)展,已經出現(xiàn)了各種商品化的渦流色譜柱,其性能各有差異,對不同極性的化合物具有不同的萃取能力。目前商品柱主要分為4類:反相柱、正相柱、離子交換柱、混合模式柱,詳細的分類見表1。Asperger等[16]在測定水中痕量農藥時比較了硅膠填料柱Turbo C18、TurboPhenyl(粒徑均為50μm)和聚合物填料柱Oasis HLB(35μm)、Cyclone(50μm)的性能。結果表明,在保留能力、洗脫效率、洗脫體積等方面,聚合物填料柱都要優(yōu)于硅膠填料柱,更適于對痕量化合物的富集。Sadagopan等[17]評價了Cohesive Cyclone柱和Polar Plus柱,認為可根據(jù)化合物的親脂性質來選擇富集柱的類型,這樣可加快樣品分析方法的建立。

        表1 渦流色譜柱的主要類型Tab le1 M a in types of TFC colum ns

        2 應用

        渦流色譜已經發(fā)展成為一種直接進樣、快速凈化和分離生物樣品的前處理技術,它的主要應用模式有:單柱模式、雙柱模式和多柱模式。單柱模式中,渦流色譜柱直接與檢測器相連,主要用于凈化樣品;雙柱模式中,在渦流色譜柱和檢測器之間添加了分析柱,渦流柱主要用于對目標成分的富集;多柱模式中,多個渦流色譜柱通過切換閥與分析柱相連,可實現(xiàn)不同目的的高通量樣品分析。

        2.1 單柱模式

        該模式由單渦流色譜柱與檢測器組成。在進行分析時,樣品中的小分子待測物會保留在渦流柱上,生物大分子被高流速的流動相洗脫除去,然后更改流動相把保留在柱上的分析物直接洗脫至檢測器中進行定性定量分析,如圖2所示。單柱模式主要適用于單個化合物的分析。Ayrton等[18]運用該模式,對血清中的單一藥物進行了快速、直接分析。首先以4mL/m in的水相將血清樣品直接上樣于渦流色譜柱中,蛋白質和其他的生物大分子被洗脫,待測物在柱中富集。隨后降低流速,并提高有機相的比例,將保留于渦流柱上的化合物沖入質譜進行檢測,每個樣品分析時間僅需2.5m in,線性范圍為5~1 000 ng/mL。Z imm er等[19]比較了渦流色譜單柱模式、SPE、LLE3種樣品前處理方法,結果表明渦流色譜的樣品處理效果要好于自動SPE和手工LLE,且分析時間大大縮短。但是,當單柱模式用于多個化合物同時定性定量分析時,由于其分離效率有限,難以滿足高分辨、高靈敏分析的要求,此時則需要使用雙柱模式。

        圖2 單柱模式的渦流色譜Fig.2 S ingle-co lum n m ode of tu rbu len t flow chrom a tography

        2.2 雙柱模式

        該模式主要由單渦流色譜柱、切換閥、單分析柱以及檢測器組成,渦流色譜柱主要用于純化和富集待測物。首先,萃取用流動相將樣品帶入渦流柱,清除蛋白質等成分后,通過柱切換,分析用流動相將樣品從渦流柱沖入分析柱進行分離,隨后進入檢測器進行檢測,如圖3所示。與單柱模式相比,其優(yōu)勢明顯,該系統(tǒng)已廣泛用于生物樣品的在線分析。Jem al等[20]使用該模式對血清中的普伐他汀及其同分異構體進行了含量測定,通過添加分析柱,2種異構體可在2.8m in內得到很好的分離,普伐他汀的回收率為50%,其異構體回收率為90%。Herm an[21]使用渦流色譜雙柱模式建立了高通量藥物篩選的通用方法。該方法已經被用來篩選了1 000多種化合物,處理的生物基質包括血漿、尿液、腦勻漿、肝勻漿、腸液、腦脊液等,99%以上的分析實驗符合所需的靈敏度和重現(xiàn)性。渦流色譜柱還可以和手性柱聯(lián)用,如W u等[22]以沙丁胺醇旋光異構體為研究對象,建立了一種簡單、有效、高通量分析血漿中手性藥物的方法。該方法總分析時間僅8m in,線性范圍為2.5~2 500nmol/L,2種異構體基本達到基線分離。Krebber等[23]利用雙柱模式測定了多種食用動物的不同組織中恩氟沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的殘余量,目標物的回收率為72%~105%,這也是渦流色譜技術首次用于多種動物組織的分析。Jem al等[24]比較了渦流色譜雙柱模式與液-液萃取法,處理100個樣品,前者的處理時間僅為后者的1/4。

        圖3 雙柱模式的渦流色譜Fig.3 Coup led-co lum n m ode of tu rbu len t flow chrom a tography

        2.3 多柱模式

        該模式使用多個渦流色譜柱對樣品進行純化和富集。在應用過程中,渦流柱一般采取并聯(lián)方式,具體過程如圖4所示。渦流柱A首先進樣洗脫,當柱A與分析柱、檢測器相連對待測物進行分析時,渦流柱B用適當溶劑清洗及平衡。柱A的在線測定過程結束時,柱B開始進樣,從而縮短進樣循環(huán)時間,增大樣品分析通量。Hsieh等[25]使用雙渦流柱并聯(lián)-單分析柱-質譜聯(lián)用系統(tǒng),對血清中的GW572016(專利藥)進行了定量分析,進樣循環(huán)時間僅需0.8 m in;通過進一步增加切換閥和分析柱,進樣循環(huán)時間可減少到0.4m in。此方法適用于藥物的高通量體內過程評價研究。O ng等[26]比較了雙柱模式和多柱模式,結果發(fā)現(xiàn),采用雙柱模式,單次分析時間需要4m in;而采用雙渦流柱并聯(lián)模式,完成一次分析僅需2.08m in,分析速度提高了近1倍。但是,多柱模式殘留較高,達到0.24%;雙柱模式殘留則相對較低,小于0.04%。B ayliss等[27]使用4根渦流色譜柱和4通道多噴霧器質譜儀并行分析,組成了高通量分析系統(tǒng)。不同于上面提到的并聯(lián)閥切換系統(tǒng),該系統(tǒng)對4根渦流柱同時進樣分析,每小時可處理120個樣品,定量限達5ng/mL。M allet等[28]對渦流色譜的多種使用模式進行了比較,待測物為酸性藥物二氟尼柳和堿性藥物氯馬斯汀,基質為大鼠血漿,結果表明,雙柱模式比單柱模式的質譜峰更加尖銳,峰形好,信噪比高。多柱并聯(lián)模式和雙柱模式在峰形上沒有明顯差別,但分析時間短,適用于大量樣品的分析。然而多柱模式使用了多個切換閥和色譜柱,比起單柱模式易產生交叉污染,不過只要閥切換時間合適,就可以把污染降到最低。

        渦流色譜技術最大的特點是富集小分子化合物的同時除去生物大分子化合物,作者所在實驗室根據(jù)這一特點,設計了雙渦流柱串聯(lián)模式用于篩選靶蛋白結合成分,并已成功用于中藥復雜體系中活性成分群的篩選,其流程如圖5所示[29]。該系統(tǒng)的主要創(chuàng)新在于TFC技術的正反結合使用:渦流柱A的使用方式與一般情況相反,它將未能與靶蛋白結合的小分子雜質保留下來,靶蛋白與配體結合的復合物則被純化收集、洗脫至解離線圈并在線解離,使活性配體從靶蛋白上游離出來,然后進入渦流柱B(如圖5中的上圖所示)。渦流柱B的使用方式則與一般情況相同,解離后游離配體被富集在TFC柱的前端,而靶蛋白質則被洗脫至廢液,保留的配體進入LC-MS進行定性定量分析(如圖5中的下圖所示)。該模式為渦流色譜柱的使用開辟了新的方向。

        目前,上述提及的3種渦流色譜分析模式已廣泛用于生物樣品的分析,表2總結了3種模式在不同生物基質中的應用,包括對血漿[30-36]、血清[25,37]、尿液[38,40,41]以及其他生物基質(腦漿[26]、透析液[41]、組織[23]等)的分析。

        圖4 并聯(lián)多柱模式的渦流色譜Fig.4 Parallel configuration of multi-dimensional column mode of turbulent flow chromatography

        3 現(xiàn)存問題與發(fā)展趨勢

        與傳統(tǒng)的萃取技術相比,渦流色譜技術與液相色譜、質譜在線聯(lián)用可對復雜的生物樣品直接進樣測定,而不受樣品中蛋白質等大分子物質的干擾,分析速度快、效率高、靈敏度和選擇性好。目前,該技術已經在生物分析中得到了廣泛的應用。

        圖5 串聯(lián)多柱模式的渦流色譜Fig.5 Tandem configuration of multi-dimensional-column mode of turbulent flowchroma to graphy

        表2 渦流色譜在生物樣品分析中的應用Table2 Applications of TFC in the analysis of biological samples

        不過由于是直接進樣,污染物殘留就成為一個不可避免的問題。自動進樣器、色譜柱、切換閥等都可能會有殘留物,其中40%的污染來源于自動進樣器。因此在進樣時應注意定量環(huán)的量程,避免滿量程進樣,進樣結束后需仔細清洗進樣針和定量環(huán)[46]。而渦流柱的污染問題可采取反沖方式清洗殘余蛋白質、洗脫結束后用多種溶劑沖洗渦流柱等手段來加以解決[47]。G rant等[48]針對殘留問題使用了新型切換閥材料(PAEK)并改裝了自動進樣器,提高了除殘留效率,縮短了整體分析時間。渦流色譜技術的另一個缺點是柱壽命較短。Mallet等[28]使用渦流柱進樣200次(每次進樣量200μL)后,色譜峰發(fā)生變形,分離效率降低。這是由于生物樣品中的污染物在渦流柱中積累已達到飽和,堵塞了填料孔,使柱壓升高,分離效率下降。Zeng等[49]設計了新的清洗方法來延長渦流柱壽命。他們使用高濃度(15%)乙酸水溶液上樣來洗脫血漿樣品中的蛋白質,90%四氫呋喃溶液清洗渦流柱和分析柱以除去柱中殘留的脂質;進樣2 000次后,測定結果未發(fā)生顯著變化。

        隨著技術的發(fā)展,渦流色譜的應用也趨于多樣化。Fairhurst等[50]將渦流技術用于分子印跡色譜,然而在高流速下,印跡微球聚合物和非印跡微球聚合物在分離普萘洛爾異構體時沒有顯著的差異。不過微球型聚合物仍然表現(xiàn)出了較好的應用前景,在渦流條件下,該聚合物可以有效萃取血漿中的普萘洛爾,同傳統(tǒng)的C18色譜柱相比,基線更平穩(wěn)且無雜峰干擾。Zeng等[51]將渦流柱和整體柱聯(lián)用,渦流柱純化,整體柱分析,測定了血漿中的芬氟拉明、替馬西泮、奧沙西泮、它莫西芬等堿性藥物。由于渦流柱和整體柱都可以采用高流速,單個樣品分析過程僅用1.2m in,連續(xù)10h分析樣品407份,系統(tǒng)柱壓升高不到30%。在限進填料(RAM)中,渦流技術也得到了應用[52,53]。限進填料外表面涂覆親水性基團,利用體積排阻原理,使蛋白質等大分子不被保留排入廢液;內表面鍵合各種反相基團,可以吸附小分子分析物,但限進填料柱一般只采用常規(guī)流速。Vintiloiu等[52]制備了限進色譜柱(ADS,50mm×0.76mm,40~63μm),并使其在5mL/m in的高流速下達到渦流狀態(tài),從而大大縮短了分析時間,并具有良好的線性、重現(xiàn)性和回收率。由于限進填料表面的生物相容性,阻止了蛋白質和固定相中疏水基團的結合,使萃取柱壽命延長。另外,微渦流柱的出現(xiàn)也彌補了普通渦流柱壽命短的缺陷。這種色譜柱內徑更窄,一般為0.5mm,因此可以在低流速下達到渦流狀態(tài)。微渦流柱還可以降低溶劑消耗量,提高質譜靈敏度,減少殘留[54]。Chassaing等[47]使用微渦流柱進樣1 000次后,柱壓未升高且污染殘留影響不明顯。

        表2 (續(xù))Table2 (Con tinued)

        4 展望

        綜觀國外發(fā)表的有關渦流色譜技術的論文,雖然已取得了很大的進展,但是渦流色譜應用的樣品基質絕大部分局限在生物體液方面,尤其是血液樣品,分析物又多為化學藥物,其應用領域有待于進一步發(fā)掘。近幾年在應用基質方面已經有所擴展,有文獻報道應用渦流色譜對蜂蜜[55]和河水[16,56]中的化合物進行測定,但在分析物方面還沒有進一步拓寬的報道。當前中藥受到了越來越多的關注,為了闡明中藥的效應物質基礎和作用機制,中藥藥理學、中藥藥動學的研究快速發(fā)展起來。然而由于中藥的復雜性,樣品的前處理過程難度較大,對中藥成分中活性化合物的確定和篩選亦十分困難。在國家自然科學基金等項目的資助下,作者所在課題組正在嘗試將渦流色譜技術應用于中藥分析,旨在提高分析效率。相信隨著研究工作的不斷深入,渦流色譜技術的不斷發(fā)展,其在分析領域必將發(fā)揮出更大的潛力。

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        Application of turbulent flow chromatography in the analysis of biological samples

        LIU Peng,ZHOU Jianliang,AN Jingjing,LI Ping*
        (Key Laboratory of Modern Chinese Medicines,Ministry of Education,Department of Pharmacognosy,China Pharmaceutical University,Nan jing 210009,China)

        O658

        A

        1000-8713(2010)02-0168-07

        *通訊聯(lián)系人:李 萍,教授,研究方向為生藥活性成分與質量評價.Tel:(025)85391244,E-m ail:lip ing2004@126.com.

        “十一五”國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2009ZX09502-020)和中國藥科大學研究生創(chuàng)新計劃項目(No.02704006-522).

        2009-08-28

        DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00168

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