徐錦萍, 何 珩, 徐夢依, 曲燕華

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院,湖北武漢430030;2.武漢工程大學郵電與信息工程學院,湖北武漢430073)

反相高效液相色譜法測定飼料添加劑阿散酸中的阿散酸及摻假物質(zhì)對氨基苯磺酸

徐錦萍1＊, 何 珩2, 徐夢依1, 曲燕華1

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院,湖北武漢430030;2.武漢工程大學郵電與信息工程學院,湖北武漢430073)

建立了用于飼料添加劑阿散酸質(zhì)量控制的反相高效液相色譜法。采用的色譜條件:Waters Bondapak C18柱(150mm×4mm,5μm)分離,以甲醇-水(用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.9)(1∶4,v/v)作流動相,流速1.0mL/m in,紫外檢測波長為244nm。在優(yōu)化的色譜條件下,阿散酸和摻假物質(zhì)對氨基苯磺酸在3m in內(nèi)實現(xiàn)了基線分離。阿散酸和對氨基苯磺酸的線性范圍均為5～200m g/L,檢出限(S/N=3)分別為0.20m g/L和0.15m g/L。該方法簡便快速,適合飼料添加劑阿散酸的分析以及監(jiān)測對氨基苯磺酸摻假。

反相高效液相色譜法;阿散酸;對氨基苯磺酸;摻假物質(zhì);飼料添加劑

Abstract:A reversed-phase high performance liquid Chromatographic(RP-HPLC)method was established for the determination of arsanilic acid and sulfanilic acid as adulterant in the feed additives.The separation was carried out on a Waters Bondapak C18column,and methanol water(pH2.9adjusted by0.01mol/L phosphoric acid)(1∶4,v/v)was used as the mobile phase with a flow rate of1.0mL/m in.A diode array detector was used at244nm as the detection wavelength.Arsanilic acid and sulfanilic acid were separated within3m in.The linear ranges all were5-200m g/L and the detection limits(S/N=3)were0.20and0.15m g/L for arsanilic acid and sulfanilic acid,respectively.This method is simple and rap id,and suitable for the simultaneous determination of arsanilic acid and sulfanilic acid in feed additives.

Key words:reversed-phase high perform anceliquid Chromatography(RP-HPLC);arsanilic acid;sulfanilic acid;adulterant;feed additive

阿散酸,化學名稱為對氨基苯砷酸,是豬、雞飼料的添加劑,具有促進蛋白質(zhì)的合成,改變腸道細胞的代謝,增進皮膚卵黃素沉淀,并能抑制球蟲卵、支原體,抗大腸桿菌,起著生長促進劑的作用,能提高產(chǎn)蛋率和飼料效率[1]。目前市場上以阿散酸和阿散酸-碳酸鈣預混劑產(chǎn)品為主。近來,市場上發(fā)現(xiàn)有不法廠商在阿散酸添加劑中摻入更加價廉易得的非功能性物質(zhì)(如對氨基苯磺酸),以提高阿散酸的表觀含量,獲取不當利益。

有關(guān)阿散酸含量的測定方法文獻報道得較多。美國公職化學家協(xié)會推薦的分光光度法[2]僅限于在沒有磺胺類藥物存在的條件下使用,Aschbacher等[3]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)研究阿散酸在豬、雞體內(nèi)的代謝規(guī)律,Ruiz等[4]和Roerdink等[5]用流動注射分析法檢測了飼料和水中的阿散酸,王金榮等[6]采用HPLC檢測阿散酸,肖亞兵等[7,8]分別應用HPLC與固相萃取、等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時測定飼料中阿散酸等有機胂。目前尚未見采用HPLC同時測定阿散酸和對氨基苯磺酸的報道。本文采用反相高效液相色譜(RPHPLC)同時測定阿散酸和對氨基苯磺酸,為阿散酸的質(zhì)量監(jiān)控提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Agilent1100型高效液相色譜儀,配有二極管陣列紫外檢測器、20μL定量管;ZARY紫外分光光度計(瓦里安公司)。

阿散酸對照品:以98.1%阿散酸為原料,經(jīng)重結(jié)晶、干燥后,純度在99.5%以上。對氨基苯磺酸對照品:無水對氨基苯磺酸(分析純,上海試劑三廠),含量不低于99.8%。磷酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純;甲醇為色譜純。阿散酸試樣購自市場。

1.2 對照品與試樣溶液的制備

對照品溶液:精確稱取阿散酸和對氨基苯磺酸對照品適量,分別用少量的0.1mol/L氫氧化鈉溶液溶解,用蒸餾水定容配制成約1g/L的儲備液。各系列對照品溶液均以儲備液用水稀釋后得到。

試樣溶液:精確稱取阿散酸試樣約0.1g,用少量的0.1mol/L氫氧化鈉溶液溶解,用蒸餾水于100mL容量瓶中定容。將此液用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后作為試樣溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱:Waters Bondapak C18柱(150mm×4 mm,5μm);流動相:甲醇-水(用稀磷酸調(diào)pH為2.9)(1∶4,v/v),流速1.0mL/m in;檢測波長244 nm;柱溫為室溫;進樣量20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

分別取阿散酸和對氨基苯磺酸對照品溶液,以蒸餾水為空白,測定二者的紫外吸收光譜曲線。阿散酸和對氨基苯磺酸的最大吸收峰分別為244nm與249nm,且二者的吸收強度和光譜曲線形狀極為相近,幾乎重疊。由此可見,如果采用紫外分光光度法測定阿散酸的含量時,若阿散酸添加劑中摻入對氨基苯磺酸則造成阿散酸的分析結(jié)果偏高,即提高了阿散酸的表觀含量。因此較阿散酸更價廉易得的對氨基苯磺酸就有可能成為阿散酸的摻假物質(zhì)。本試驗選用244nm為檢測波長,并優(yōu)化其他的色譜條件使阿散酸和對氨基苯磺酸充分分離,確保阿散酸測定的準確性。

2.2 流動相的選擇

甲醇水溶液是反相分配色譜中最常用的流動相。選擇不同濃度的甲醇水溶液作流動相的實驗結(jié)果表明,隨著甲醇濃度的增大,對氨基苯磺酸與阿散酸的保留稍有減弱,分離度降低。本文最終選擇以甲醇-水(1∶4,v/v)為流動相。

流動相的pH對分離有明顯的影響。隨著流動相pH值的減小,阿散酸的保留時間減小明顯。在較低pH值(如pH1.9和2.1)的條件下,對氨基苯磺酸的色譜峰出現(xiàn)明顯分叉,其原因和機理有待進一步研究。流動相的pH值高于3.0時,阿散酸和對氨基苯磺酸已經(jīng)難以達到基線分離。實驗結(jié)果表明,本方法流動相的適宜pH范圍為2.6～3.0,本實驗選擇pH2.9。在1.3節(jié)所述的色譜條件下,阿散酸和對氨基苯磺酸在3m in內(nèi)達到較好的分離(見圖1)。

圖1 阿散酸和對氨基苯磺酸對照品混合溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a standard mixture ofsulfanilic acid and a rsanilic acid

2.3 工作曲線與檢出限

取質(zhì)量濃度為100m g/L的阿散酸、對氨基苯磺酸對照品溶液用水配制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合溶液,在1.3節(jié)所述的色譜條件下分別進行測定。以分析物的峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x,m g/L)進行線性回歸,得到的線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)如表1所示,由此可見該方法的工作曲線線性范圍較寬,且具有較高的檢測靈敏度。

2.4 精密度

取質(zhì)量濃度為100m g/L阿散酸和對氨基苯磺酸對照品溶液適量于容量瓶中定容,制備成質(zhì)量濃度均為10m g/L的溶液,按1.3節(jié)的色譜條件重復進樣6次。結(jié)果表明,阿散酸和對氨基苯磺酸峰面積測定值的相對標準偏差(RSD)分別為0.85%和1.03%,具有很好的重復性。

表1 阿散酸和對氨基苯磺酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限(S/N=3)Table1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges and detection limits(S/N=3)of a rsanilic acid and sulfanilic acid

2.5 實際樣品的測定

稱取市購的樣品,分別按1.2節(jié)所述的方法制備試樣溶液,測定阿散酸和對氨基苯磺酸的含量,結(jié)果見表2。表2的結(jié)果表明,有一個試樣中未摻入對氨基苯磺酸,另外4個試樣中均含有不同量的對氨基苯磺酸。

表2 阿散酸樣品中阿散酸和對氨基苯磺酸的含量(n=3)Table2 Con ten ts of a rsanilic acid and sulfanilic acid in a rsanilic acid samples(n=3)%

3 結(jié)語

本文采用RP-HPLC同時測定了阿散酸飼料添加劑中的阿散酸和對氨基苯磺酸,為監(jiān)測對氨基苯磺酸可能作為摻假物添加于阿散酸飼料添加劑中而影響后者的質(zhì)量提供了技術(shù)支持。方法簡單、可靠、易于操作,可以用于市場上所銷售的飼料添加劑阿散酸中阿散酸和摻假物對氨基苯磺酸的定性和定量分析。

致謝 感謝國家飼料檢測中心的何一帆先生在測試工作中給予的指導與幫助。

[1] Wang M,Xue F Q,Meng X Y.Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine(王米,薛飛群,孟新宇.上海畜牧獸醫(yī)通訊),2008(4):79

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[7] Xiao YB,W eiW,Gao J H,et al.Chinese Journal of Instrumental Analysis(肖亞兵,韋瑋,高建會,等.分析測試學報),2008,27(9):964

[8] Xiao YB,Gao J H,Zeng Y,et al.Chinese Journal of Instrumental Analysis(肖亞兵,高建會,曾宇,等.分析測試學報),2008,27(11):1206

Determination of arsanilicacid and sulfanilic acid as adulterant in feed additives by reversed-phase high perform anceliquid chromatography

XU Jinping1＊,HE Heng2,XU Mengyi1,QU Yanhua1
(1.School of Pharmacy,Tongji Medica l College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.College of Post and Telecommunication of Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0218-03

＊通訊聯(lián)系人:徐錦萍.E-m ail:jp1129@tom.com.

2009-07-30

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00218