陳 博，陳劍秋

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院普通外科，天津 300211）

缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是Semenza[1]最先于1992年在研究缺氧誘導的紅細胞生成素基因表達時被發(fā)現(xiàn)的，HIF-1是以異源二聚體蛋白的形式存在，由HIF-1α與HIF-1β兩個亞單位組成，其中HIF-1α氧依賴性較強，當周圍氧濃度下降時，HIF-1α表達增加，HIF-1β氧依賴性較弱，表達恒定，但在HIF-1中也必不可少，只有在兩個亞單位聚合并且發(fā)生適形變化后，與其要調(diào)節(jié)的下游因子或酶的缺氧反應元件（hypoxia response element，HRE）結(jié)合時才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)下游基因的表達，其中包括與血管形成相關(guān)的眾多基因，是組織缺血時重要的調(diào)節(jié)因子。本實驗以含HIF-1α質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染骨骼肌細胞，觀察細胞培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白的分泌，及其表達產(chǎn)物對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞的促增殖作用,為進一步向缺血組織內(nèi)注射含HIF-1α質(zhì)粒治療缺血性疾病提供體外實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 Wistar乳鼠（出生3 d內(nèi)）及大鼠（120 g）購自中國軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。質(zhì)粒 pHOX-EF1α-GFP（pHOX，8686 bp） 和 pHOXEF1α-HIF-1α-IRES-GFP(pHOX/HIF-1α,11360 bp)由瑞典Karolinska大學王豐博士惠贈；小鼠抗人橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體（ZM-0002）、小鼠抗人結(jié)蛋白單克隆抗體（ZM-0091）、兔抗人八因子相關(guān)抗原（FaⅧ）、FITC標記的羊抗兔Ig G抗體、羅丹明標記抗小鼠IgG購自北京中杉金橋科技有限公司；GENMED細胞核染色試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；大鼠VEGF(r)Elisa檢測試劑盒購自武漢博士德公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨骼肌細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 乳鼠頸椎脫位法處死，無菌狀態(tài)下取雙側(cè)大腿肌肉組織剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，37℃、100 r/min振蕩消化5次，每次10min；吸取上清液，移入預加5ml含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液15ml的離心管中并混勻；室溫下離心（1 000 r/min，5min），棄上清液，重懸細胞，經(jīng)100目不銹鋼細胞篩過濾后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi)置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d全量換液；倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并通過中間絲結(jié)蛋白免疫組化法、α－橫紋肌肌動蛋白免疫細胞化學法及透射電鏡法鑒定骨骼肌細胞。

1.2.2 大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及鑒定 頸椎脫位法處死大鼠,無菌狀態(tài)下取出胸腹主動脈,剝除外膜,切成1mm2大小組織塊,內(nèi)膜面朝下以1塊/cm2的間距鋪于培養(yǎng)瓶底；細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置貼壁2 h后加入10ml含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每3 d全量換液；倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài),第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學染色鑒定內(nèi)皮細胞。

1.2.3 pHOX/HIF-1α轉(zhuǎn)染骨骼肌細胞后誘導分泌VEGF的測定 實驗共分為3組：質(zhì)粒（pHOX/HIF-1α）轉(zhuǎn)染組、空載質(zhì)粒（pHOX）轉(zhuǎn)染組及空白對照（DMEM）組；轉(zhuǎn)染前1d將骨骼肌細胞以1.5×105/孔的密度接種到24孔板。1∶1將LipofectamineTM2000及質(zhì)?；靹?，質(zhì)粒1μg加入培養(yǎng)孔，對照組加入相同體積 DMEM，分別于轉(zhuǎn)染后 24、48、72、96 h 收集各孔中培養(yǎng)上清液，離心后以VEGF(r)ELISA檢測試劑盒測量其中VEGF濃度，各組每個時間點測6孔。

1.2.4 產(chǎn)物VEGF對血管內(nèi)皮細胞增殖的影響 取3~5代血管內(nèi)皮細胞，每孔5×103密度接種于96孔板內(nèi)。實驗組分別加入轉(zhuǎn)染后骨骼肌細胞分泌的含VEGF 10、25、50、100 pg（根據(jù)ELISA 結(jié)果計算加入體積）培養(yǎng)液上清，以DMEM補至200μl；對照組加入DMEM 200μl。分別于培養(yǎng)后第24、48、72 h去除培養(yǎng)液，按MTT法于490 nm處測吸光度(A)值，各組每個時間點測6孔。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌細胞原代培養(yǎng)及鑒定 剛分離出來的細胞呈圓形，24 h后細胞完全貼壁，細胞開始逐漸變大呈梭形，具有良好的折光性（圖1a）。培養(yǎng)約50 h后，細胞進入快速融合期，可見多個細胞融合成多核的肌管細胞，體積約為未融合細胞的3～5倍，核有數(shù)個至十幾個不等（圖1b）。培養(yǎng)3～5 d后肌管數(shù)目明顯增多，相互連接成網(wǎng)狀，并可見肌管細胞的短暫收縮現(xiàn)象。中間絲結(jié)蛋白免疫細胞化學檢測：70%～80%的細胞胞質(zhì)呈陽性反應（圖1c）。α－橫紋肌肌動蛋白免疫細胞化學法檢測：陽性細胞在熒光激發(fā)下顯示紅色熒光（圖1d）。電鏡鑒定:細胞體積大，直徑40～100μl之間，細胞核不規(guī)則，胞漿豐富，胞漿中有大量肌絲，同時可見大量次級溶酶體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張，線粒體豐富，細胞突起多（圖1e）。

2.2 血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)3～5 d，動脈植塊周圍可見細胞生長，呈短梭形或多角形（圖2a）。約 8～10 d 細胞融合成片（圖 2b），呈單層鑲嵌狀排列，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形，表現(xiàn)為“鋪路石樣”排列（圖2c）。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學鑒定：熒光顯微鏡下可見細胞的胞漿顯示為綠色熒光，細胞核為藍色熒光（圖2d）。

2.3 轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液中VEGF含量的測定

ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液中VEGF含量的測定結(jié)果見表1?？梢娹D(zhuǎn)染后各時間點轉(zhuǎn)染（pHOX/HIF-1α）組明顯高于相同時間點的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（pHOX）組和空白對照（DMEM）組（P＜0.05），而后兩者則無明顯區(qū)別。

表1 ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清液中VEGF 含量（pg/m l,）(n=6)

表1 ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清液中VEGF 含量（pg/m l,）(n=6)

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

24h 629.75±79.30 667.73±61.96 1308.40±102.00 84.986**2.37 4.80*5.29*72 h 640.45±54.36 681.18±29.49 1 802.3±96.71 334.651**3.48 4.93*6.84*48h 671.85±100.81 664.48±45.73 1449.2±69.86 42.426**2.56 5.67*5.77*組別DMEM(1)pHOX(2)pHOX/HIF-1α(3)F q 1:2 1:3 2:3 96h 620.30±63.18 635.78±32.22 1494.95±86.24 198.434**4.19 7.41*7.06*

2.4 MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染后上清液中VEGF對內(nèi)皮細胞增殖的影響 在加入MTT并培養(yǎng)后各組吸光度值測量結(jié)果見表2。加入VEGF 24 h后，10 pg組促增殖作用不明顯，而25、50、100 pg組內(nèi)皮增殖明顯加快,與對照組相比P<0.05。加入后48、72 h，各劑量組與對照組比較能顯著刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，并且各不同劑量組之間差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液中的VEGF能有效地促進原代培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的增殖。

表2 加入不同濃度VEGF培養(yǎng)血管內(nèi)皮后的吸光度值（n＝6, ）

表2 加入不同濃度VEGF培養(yǎng)血管內(nèi)皮后的吸光度值（n＝6, ）

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

48 h 0.041 7±0.011 7 0.061 7±0.016 0 0.083 3±0.008 2 0.101 7±0.011 7 0.121 4±0.006 3 16.694**5.97*6.59*10.03**9.48**8.49*8.64*13.45**5.76*7.48*6.09*24 h 0.031 7±0.011 7 0.043 3±0.010 3 0.060 0±0.008 9 0.078 3±0.007 5 0.093 3±0.018 6 25.998**4.84 6.46*9.89**0.12**6.35*7.87*9.07**5.98*7.81*7.76*72 h 0.058 3±0.014 7 0.081 7±0.014 7 0.103 3±0.018 6 0.130 0±0.014 1 0.167 6±0.006 3 36.699**6.61*7.43*13.95**12.41**8.16*8.58*11.06**7.94*8.39*8.19*DMEM組 (1)VEGF10 pg (2)VEGF25 pg (3)VEGF50 pg (4)VEGF100 pg(5)F q 1:2 1:3 1:4 1:5 2:3 2:4 2:5 3:4 3:5 4:5組別 吸光度（A）

3 討論

HIF-1通過調(diào)控其下游基因的表達來實現(xiàn)其功能，HIF-1做為轉(zhuǎn)錄因子，目前已知的受其調(diào)控的基因已超過60種[3]，涉及到細胞的代謝、自分泌、氧穩(wěn)態(tài)、能量維持及增生等方面。目前進行研究較多的HIF-1的靶基因主要包括以下種類：促紅細胞生成素（EPO）；VEGF，內(nèi)皮素-1（endothelin-1）；葡萄糖轉(zhuǎn)運子-1（glucose transporter-1，GLUT-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運子-3（glucose transporter-3，GLUT-3）和糖酵解酶等。其中許多在缺血組織的新血管形成過程中發(fā)揮重要作用。

現(xiàn)在研究已經(jīng)明確HIF-l對于VEGF的調(diào)控主要是通過作用于VEGF基因轉(zhuǎn)錄起始點上游大約1kb的5′側(cè)翼區(qū)域-28bp的HRE來實現(xiàn)的，VEGF基因的 HIF-1結(jié)合點序列為 5′-CACAG-3′和 5′-ATCGTGGG-3′。HIF-1結(jié)合點和上游的激活蛋白-1(activator protein l，AP-1)結(jié)合點共同構(gòu)成 HRE。HIF-1可與VEGF的DNA相結(jié)合，激活HIF-1α羧基端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，從而加強HIF-1α羧基端與P300/CBP的結(jié)合力，將轉(zhuǎn)錄信號傳遞給RNA序列，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性[4]。此外也有研究表明HIF-1α能誘導VEGF受體Flt-1的表達[5]，F(xiàn)lt-1表達增高使得VEGF的效應得到放大。同時研究發(fā)現(xiàn)低到中等水平表達VEGF的成肌細胞能誘導生成結(jié)構(gòu)正常的毛細血管網(wǎng)，而高水平表達的成肌細胞移植后則誘導血管瘤的生成，導致肌肉嚴重水腫并加速缺血肢體的壞死[6]。因此在VEGF誘導新生血管治療缺血性疾病時，控制VEGF的表達水平具有重要意義。而由于HIF-1α在正常氧濃度下迅速降解的特點使其有可能避免VEGF在局部過度表達的危險:當局部缺氧時HIF-1α局部積聚，可以誘導VEGF表達增加，而一旦局部的氧供應充足，則HIF-1α會迅速降解，失去對VEGF的誘導作用，使局部VEGF不會產(chǎn)生過量表達。

在本實驗中通過LipofectamineTM 2000陽離子脂質(zhì)體介導將pHOX/HIF-lα質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細胞，然后檢測細胞培養(yǎng)上清中VEGF 的含量, 轉(zhuǎn)染 HIF-lα24、48、72、96 h 后 VEGF蛋白的量分別為（1 308.40±102）、（1 449.20±69.86）、（1 802.30±96.71）和（1 494.95±86.24）pg/ml，明顯高于相同時間點的空載質(zhì)粒（pHOX）組和DMEM組（P<0.05），后兩組則無統(tǒng)計學差別，證明了HIF-1α轉(zhuǎn)染骨骼肌細胞后可以誘導VEGF高表達。進一步的實驗表明加入含VEGF的轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液后，除24 h、10 pg組外各組的吸光度值均較對照組增加，表現(xiàn)出明顯的促內(nèi)皮細胞增殖作用，且呈明顯的劑量依賴效應（各劑量組間比較P<0.05）。其中24 h、10 pg組與對照組無明顯差別的原因可能是VEGF劑量小且作用時間較短所致。

本實驗的最終設(shè)想是通過對缺血組織局部注射含HIF-1α的質(zhì)粒來促進局部的血管形成，改善局部缺血癥狀，現(xiàn)已證實將外源性含HIF-1α質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)骨骼肌細胞后可以誘導VEGF高表達，且轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液含有的VEGF對內(nèi)皮細胞具有明顯的促增殖作用，表明其誘導骨骼肌細胞合成的VEGF有正常功能。但本實驗是在相對簡單的體外環(huán)境中完成，對于在環(huán)境更為復雜的在體情況下將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨骼肌細胞后所能發(fā)揮的作用尚需進一步研究。

[1]SemenzaGL，WangGL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer ata site required fortranscriptional activation [J].Mol Cell Biol,1992,12（12）:5447

[2]Iyer NV,Leung SW,Semenza GL,et al.The human hypoxia-inducible factor 1alphagene:HIF-1α structureand evolutionary conservation[J].Genomics,1998,52（2）:159

[3]SemenzaGL.Targeting HIF-1 for cancer therapy[J].NatRev Cancer,2003,3（10）:721

[4]Kalio PJ,Okamoto K,O’Brien S,et al.Signal transduction in hypoxic cells:inducible nuclear translocation and recuitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factorr-1 alpha[J].EMBOJ,1998,17(22)：6573

[5]Manalo DJ,Rowan A，Lavoie T,etal.Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses tohypoxiaby HIF-1[J].B1ood,2005,105(2):659

[6]Masaki I,Yonemitsu Y,Yamashita A,etal.Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia:acceleration of limb loss by over expression of vascular endothelial growth factor but not of fibroblastgrowth factor-2[J].Circ Res,2002,90(9):966