楊 群，魏殿軍，何 屏，王巍巍，門 昆

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211）

白細(xì)胞介素-1(IL-1)是近年來研究比較多的前炎癥細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中具有調(diào)節(jié)作用，生物作用廣泛[1]。白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra）是IL-1家族的唯一一種天然拮抗劑，其結(jié)構(gòu)與IL-1相似,通過與Ⅰ型IL-1受體競爭結(jié)合而阻止IL-1效應(yīng)的發(fā)揮，已有許多學(xué)者關(guān)注其基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系。編碼IL-1Ra的基因定位于人類染色體的2q12-13上，該基因的第2號(hào)內(nèi)含子存在可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）多態(tài)性，可能影響IL-1Ra的表達(dá)，并與許多慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。IL-1Ra VNTR重復(fù)序列長86bp。以往的研究根據(jù)重復(fù)序列出現(xiàn)的次數(shù)不同發(fā)現(xiàn)5種等位基因：IL-1RNⅠ（4個(gè)重復(fù)體，410bp）、IL-1RNⅡ（2 個(gè)重復(fù)體，240bp）、IL-1RN III（5 個(gè)重復(fù)體 500bp）、IL-1RN IV（3 個(gè)重復(fù)體，325bp）和 IL-1RN V（6 個(gè)重復(fù)體，595bp），其中 III、IV、V 等位基因的發(fā)生頻率極低。國外有人報(bào)道該基因可變區(qū)的基因多態(tài)性與膿毒癥的保護(hù)作用相關(guān)，本文采用PCR技術(shù)觀察IL-1Ra基因多態(tài)性與膿毒癥的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例組 來自天津市第一中心醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院ICU病房膿毒癥病人90例，其中男60例，女 30例，平均年齡（53±15）歲，所有病例的診斷均符合1991年美國胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)（ACCP）和危重病醫(yī)學(xué)會(huì)（SCCM）聯(lián)席會(huì)議的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.1.2 對(duì)照組 隨機(jī)選取健康查體人群120例，男65例，女 55例，平均年齡（56±12）歲，且血常規(guī)、生化指標(biāo)均在參考范圍內(nèi),排除肝臟、腎臟、內(nèi)分泌和心血管疾病。所有研究對(duì)象均為漢族自然人群,且無血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取靜脈血2 ml，用EDTA-K3抗凝，采用經(jīng)典的酚氯仿法提取基因組DNA。于-20℃保存。

1.2.2 引物合成 參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,擴(kuò)增IL-1Ra基因第2號(hào)內(nèi)含子中包含VNTR的一段序列。上游序列為：5′-CTCAGCAACACTCCTAT-3′，下游序列為：5′-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3′（上海英俊公司合成）。

1.2.3 PCR PCR擴(kuò)增條件為25μl的體系中含有premix taq 12.5μl，上游引物0.5μl（50 pmol/L），下游引物0.5μl（50 pmol/L），模板DNA 3μl，ddH2O 8.5μl。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min→95℃變性40 s→55℃復(fù)性45 s→72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存,以上反應(yīng)均在基因擴(kuò)增儀（Long Gene公司產(chǎn)品）上完成。

1.2.4 基因分型 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳Goldview染色法檢測(cè)，以DL1000(大連寶生物生物工程有限公司產(chǎn)品)為DNA片段標(biāo)準(zhǔn)物,在紫外線下觀察結(jié)果并照相。將其中一個(gè)產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果表明引物序列及產(chǎn)物大小均與原設(shè)計(jì)相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)電泳結(jié)果得出兩組人群IL-1Ra的等位基因型別，某種等位基因在相應(yīng)人群中的百分?jǐn)?shù)為其基因頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。病例組與對(duì)照組間各等位基因及基因型頻率的比較用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果 我們?cè)趦山M人群中共發(fā)現(xiàn)IL-1RNⅠ/Ⅰ、IL-1RNⅠ/Ⅱ和IL-1RNⅠ/Ⅳ共3種基因型，未擴(kuò)增出IL-1RNⅣ和IL-1RNⅤ型（圖1）。

2.2 膿毒癥組和對(duì)照組IL-1Ra VNTR的分布 基因型及等位基因頻率在兩組人群中的分布（表1）均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,表明其基因頻率已達(dá)到遺傳平衡,在兩組人群中具有群體代表性?；蛐头植季訧L-1RNⅠ/Ⅰ型最為常見,等位基因的分布以Ⅰ型最為常見,其次為Ⅱ型,Ⅳ型較為罕見,未發(fā)現(xiàn)Ⅲ型和Ⅴ型。

2.3 IL-1Ra VNTR與發(fā)生膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)系 在表1中,對(duì)照組IL-1RNⅠ/Ⅱ基因型與膿毒癥組相比有較高的分布頻率(P<0.05)，且Ⅱ型等位基因在對(duì)照組也顯著增加（P<0.05），不攜帶Ⅱ型等位基因的基因型(Ⅰ/Ⅰ和Ⅰ/Ⅳ）和非Ⅱ型等位基因攜帶者（Ⅰ，Ⅳ）與攜帶Ⅱ型等位基因的基因型（Ⅰ/Ⅱ）和Ⅱ型等位基因攜帶者相比發(fā)生膿毒癥的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為4.3和4.0,這提示Ⅱ型等位基因在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有保護(hù)作用。

表1 IL-1RN基因型和等位基因的分布頻率[n(%)]

3 討論

膿毒癥是因感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，仍然是目前ICU病人死亡常見原因[5]，且不同患者表現(xiàn)出高度的差異，易感人群很容易發(fā)生炎癥反應(yīng)失控，迅速進(jìn)入膿毒癥狀態(tài)，提示這可能與某些特異性基因的存在或基因表達(dá)特性發(fā)生改變有關(guān)[6]。近年來,通過對(duì)臨床膿毒癥的炎癥相關(guān)因子的基因型相關(guān)分析,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNF、IL-1家族、IL-10等炎癥因子的相關(guān)表達(dá)基因，均存在膿毒癥相關(guān)的基因多態(tài)性[7]。Tomita等[8]研究表明IL-1RNⅡ攜帶者血漿中的IL-1Ra濃度較高,且IL-1RNⅡ攜帶者的單核細(xì)胞在體外LPS刺激后產(chǎn)IL-1Ra的濃度較高，因其與IL-1具有很大的相似性，故可以與IL-1受體競爭性結(jié)合，產(chǎn)生拮抗IL-1的多種生物學(xué)效應(yīng)，從而減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，這可能使其在許多由IL-1介導(dǎo)的疾病中發(fā)揮潛在的保護(hù)作用。Arnalich[9]分析了78例嚴(yán)重膿毒癥病人(其中27例死亡)及130個(gè)健康對(duì)照者的基因型,多重回歸分析發(fā)現(xiàn)不攜帶IL-1RNⅡ的膿毒癥病人死亡的危險(xiǎn)性增加6.47倍。李艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)不攜帶IL-1RNⅡ型等位基因的患者發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)比攜帶此基因的健康對(duì)照組提高了將近2倍，均提示IL-1RN基因多態(tài)性可能在炎癥及其感染的發(fā)病過程中有潛在作用。

在IL-1RaVNTR核心序列中含有3個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn),這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提示該VNTR多態(tài)性對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生可能造成影響。有資料表明,Ⅱ型等位基因與血漿中IL-1Ra的高表達(dá)相關(guān)。我們的研究中兩組共出現(xiàn)了3種等位基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，且以Ⅰ型為主，這基本上與南美黑人的一致。另外，不攜帶Ⅱ型等位基因的基因型（Ⅰ/Ⅰ和Ⅰ/Ⅳ）和非Ⅱ型等位基因攜帶者（Ⅰ，Ⅳ）與攜帶Ⅱ型等位基因的基因型（Ⅰ/Ⅱ）和Ⅱ型等位基因攜帶者相比發(fā)生膿毒癥的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為4.3和4.0。這提示Ⅱ型等位基因在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有保護(hù)作用。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)IL-1Ra VNTR多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展及該疾病的嚴(yán)重程度有相關(guān)性,Ⅱ型等位基因可能具有保護(hù)作用,同時(shí)也提示了炎癥反應(yīng)在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著積極的促進(jìn)作用。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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