李偉霞，李詠梅，李光明，杜文才，張 斌，程 彬，朱 澤

（天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，天津 300070）

Caco-2（the human colon carcinoma cell line）是一種人類結(jié)腸癌細胞系，近十幾年來Caco-2細胞作為一種口服藥物腸吸收的體外模型而被廣泛應(yīng)用[1-2]；其胞膜上ABCG2（the ATP-binding cassette transporter family G member 2）又稱乳腺癌耐藥蛋白（breastcancer resistance protein,BCRP），是一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，定位于腸上皮細胞的絨毛膜面，其功能是將進入腸上皮細胞內(nèi)的藥物或化合物外排，減少其在腸道的吸收，并導(dǎo)致如托泊替康、SN-38等多種抗腫瘤藥物耐藥，以及其它化合物或營養(yǎng)物質(zhì)的低生物利用度。如何逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的外排轉(zhuǎn)運作用，是當(dāng)前國內(nèi)外研究的重點和熱點。RNA interference(RNAi)是高效的特異性強的抑制基因表達的基因沉默技術(shù)。本研究中，我們設(shè)計合成了靶向ABCG2的shRNA，用表達shRNA的重組慢病毒感染Caco-2 TC7細胞，希望能夠用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi成功構(gòu)建持久、穩(wěn)定敲除ABCG2蛋白的Caco-2細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料 Caco-2 TC7細胞由美國University of Houston胡明教授惠贈；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸購自Sigma公司；Lipofectamine 2000和Trizol購自 Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、Bam HⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、SYBR green PCR kit、Premix Tag和RT-PCR kit購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒pVSVG、pCMV和pRNAT-u6.2由上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Caco-2 TC7細胞是Caco-2的亞克隆細胞，于含有HEPES、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Caco-2 TC7細胞隔天換液，當(dāng)細胞生長至95%融合時，用含EDTA的PBS平衡鹽溶液漂洗并用胰蛋白酶消化傳代。293T細胞、Hela細胞用含10%胎牛血清和100mg/ml鏈霉素及100U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。其培養(yǎng)均在37℃、5%CO2條件下進行。

1.2.2 慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.2.1 shRNA寡核苷酸鏈的設(shè)計合成和質(zhì)粒載體的構(gòu)建：根據(jù)人源ABCG2mRNA序列（NM_004827）選擇該基因 cDNA 序列的 829～850、1378～1399、1462～1483、1193～1212作為4個靶位點，依次命名為 sh1～sh4（表 1），用軟件 BLOCK-iTMRNAiDesigner設(shè)計合成相應(yīng)的互補的shRNA寡核苷酸單鏈，同時設(shè)計合成一對不靶向ABCG2基因的shRNA寡核苷酸單鏈shRNA/Negative作為對照。shRNA包含酶切位點（Bam HⅠ）、針對靶位點的干擾序列、loop環(huán)、干擾序列的反向互補序列、中止信號（TTTTTTCCAA）和酶切位點（XhoⅠ）。互補的shRNA寡核苷酸單鏈經(jīng)退火形成雙鏈，Bam HⅠ和XhoⅠ酶切表達GFP熒光的質(zhì)粒pRNAT-u6.2，用T4DNA連接酶連接退火形成的雙鏈與酶切后的質(zhì)粒載體，分別構(gòu)建成pRNAT-u6.2/Negative,pRNAT-u6.2/ABCG2-sh1,pRNAT-u6.2/ABCG2-sh2,pRNAT-u6.2/ABCG2-sh3和pRNAT-u6.2/ABCG2-sh4質(zhì)粒載體。

表1 ABCG2的靶序列

1.2.2.2 慢病毒載體的包裝和滴度測定：用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，以0.5×106/ml的細胞密度，接種于15 cm細胞培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞密度達60%～70%時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d將細胞培養(yǎng)液更換為不含抗生素的培養(yǎng)液。用無血清DMEM制備三質(zhì)粒DNA溶液：15μg包膜質(zhì)粒pVSVG、20μg包裝質(zhì)粒pCMV和30μg轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRNAT-u6.2/ABCG2-sh 或 pRNAT-u6.2/Negative，按照Lipofectamine 2000操作步驟將三質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)染293T細胞，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后吸除含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入PBS液漂洗，然后加入含10%血清的完全培養(yǎng)液15ml，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集293T細胞上清液。于4℃，4 000 r/min離心10min，以0.45μm濾器過濾后置于40ml超速離心管中，4℃、25 000 r/min離心120min；然后以預(yù)冷的PBS液重懸病毒沉淀，于4℃溶解過夜即得到病毒液Lv-ABCG2-sh1～sh4。同法獲得陰性對照病毒液Lv-Negative-sh。次日，以10μl每管分裝病毒液置于-70℃冰箱中保存。

接種Hela細胞于 6孔板，5×104個細胞/孔，培養(yǎng)24 h后，用倍比稀釋的病毒液感染Hela細胞，于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，用完全培養(yǎng)液代替病毒感染液繼續(xù)培養(yǎng)。感染第5天，提取Hela細胞基因組DNA，按照premix Ex TagTM(perfect real time)試劑盒，用real-time PCR檢測前病毒DNA的WPRE序列來測定病毒滴度（the transducing units titer TU/ml）。real-time PCR反應(yīng)條件如下：50℃2 min；95 °C 15min；95 °C 15 s，60 °C 1min，40 個循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參對照。WPRE、β-actin引物和探針序列見表2。

1.2.3 慢病毒感染Caco-2細胞 接種Caco-2細胞于3個6孔板，每孔2.5×105個細胞，實驗分陰性對照慢病毒Lv-Negative-sh和干擾慢病毒Lv-ABCG2-sh1～sh4共5組，每組3孔細胞。培養(yǎng)3 d后，根據(jù)病毒滴度，取適量體積的病毒原液，使病毒的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為 3，將病毒原液和培養(yǎng)液混合后加到細胞上，每孔加入1.5ml混合后的病毒液與終濃度為10μg/ml的Polybrene。輕輕晃動培養(yǎng)板混勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后吸掉病毒液，換上完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞表達熒光情況，感染第5天，收集細胞，檢測ABCG2的mRNA和蛋白的表達。

1.2.4 RT-PCR和real-time PCR檢測 用TRIzol試劑提取細胞總RNA，以隨機引物為逆轉(zhuǎn)錄引物，按照RT-PCR試劑盒合成cDNA并進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。以cDNA為模板，按照SYBR green PCR kit試劑盒進行realtime PCR檢測，real-time PCR反應(yīng)條件如下：50℃1min；95℃ 10min；95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s，40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參對照。ABCG2和βactin的PCR引物見表2。

表2 PCR引物序列

1.2.5 Western blotting檢測 用細胞裂解液冰上裂解實驗組細胞30min，13 000 r/min離心15min，收集上清作為樣品,Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。10%分離膠進行SDS-PAGE電泳后，用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，100V，2 h。封阻液封閉過夜，TBST洗膜后孵育特異性抗體，1∶1 000稀釋的一抗anti-ABCG2（antibody 6D170），1∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗：羊抗鼠IgG（ABCG2）。Tubulin作為內(nèi)參對照。ECLWestern blotting檢測試劑盒（Amersham，UK）顯色，暗室曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體包裝和滴度測定 三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察到293T細胞中表達綠色熒光，證實了GFP基因的表達。轉(zhuǎn)染48 h后再觀察，發(fā)現(xiàn)細胞中熒光強度較轉(zhuǎn)染24 h時有所增強，由此慢病毒載體由293T細胞包裝產(chǎn)生。通過用real-time PCR檢測前病毒DNA的WPRE序列的表達，測定出病毒滴度分別為：Lv-ABCG2-sh1 1.0×108TU/m l，Lv-ABCG2-sh2 1.2×108TU/ml，Lv-ABCG2-sh3 2.3×108TU/ml，Lv-ABCG2-sh4 1.5×108TU/ml。根據(jù)病毒滴度，計算感染每組Caco-2細胞所需病毒原液的體積，使病毒對細胞的感染復(fù)數(shù)MOI為3。

2.2 慢病毒感染后的Caco-2細胞中ABCG2mRNA和蛋白的表達下調(diào) RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析（圖1），以β-actin為內(nèi)參，和Lv-Negative-sh陰性對照組比較，real-time PCR檢測結(jié)果顯示：Lv-ABCG2-sh1、2、3、4 感染的細胞組 ABCG2 表達量分別下調(diào)11%、77%、2%和65%（圖2）,其中Lv-ABCG2-sh2具有靶向ABCG2最高的抑制效率。Western blotting分析結(jié)果顯示，與Lv-Negative-sh陰性對照組相比，重組慢病毒載體Lv-ABCG2-sh1、2、3、4能夠在蛋白水平抑制ABCG2的表達（圖3），而且該基因在蛋白水平的下調(diào)趨勢與在mRNA水平的變化趨勢一致。

2.3 慢病毒感染后的Caco-2細胞的熒光表達 慢病毒感染48 h后，倒置顯微鏡下可見Lv-Negativesh陰性對照組和Lv-ABCG2-sh1～sh4組的幾乎所有Caco-2細胞都表達熒光，并且各組之間沒有明顯區(qū)別，說明幾乎所有Caco-2細胞都成功感染了重組的慢病毒載體。對照組Lv-Negative-sh和實驗組Lv-ABCG2-sh2熒光圖片見圖4。

2.4 敲除ABCG2的Caco-2細胞模型的構(gòu)建 選取靶向ABCG2最高抑制效率的Lv-ABCG2-sh2感染的Caco-2細胞，用real-time PCR監(jiān)測Caco-2細胞中ABCG2在mRNA水平的表達來檢測慢病毒抑制作用的穩(wěn)定性。檢測結(jié)果表明，ABCG2的mRNA 23%的表達量可以持續(xù)至少15代（圖5）。此外，細胞經(jīng)過多個凍存和復(fù)蘇循環(huán)之后，該基因的mRNA表達水平仍然保持不變。這些結(jié)果證明重組慢病毒介導(dǎo)的RNAi能持久、穩(wěn)定地抑制基因表達。

3 討論

本研究中我們用重組的4種慢病毒敲除Caco-2細胞的ABCG2，并成功獲得持久基因沉默的、穩(wěn)定低表達ABCG2的Caco-2細胞。本實驗中的Lv-ABCG2-sh2感染的Caco-2細胞具有最低的ABCG2表達水平，經(jīng)驗證培養(yǎng)15代仍保持穩(wěn)定的低ABCG2表達水平，而且經(jīng)多次凍融后仍保持一致的ABCG2表達水平，說明慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi能夠達到長期、穩(wěn)定的沉默效果。先前有報道用化學(xué)抑制劑來抑制ABCG2蛋白的功能[3-4]，化學(xué)抑制劑的非特異性抑制和對細胞的毒性限制了其應(yīng)用。隨著RNAi技術(shù)的發(fā)展，又采用化學(xué)合成的siRNA[5]、質(zhì)粒[6]、腺病毒[7]介導(dǎo) RNAi敲除 ABCG2，然而由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對細胞的毒性、基因沉默的暫時性和宿主細胞的局限性，嚴重限制了這些RNAi方法的廣泛應(yīng)用。本實驗采用的慢病毒載體則克服了這些問題，慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)染宿主細胞，包括分裂和未分裂細胞，能將攜帶的目的DNA整合到宿主基因組上從而實現(xiàn)長期穩(wěn)定敲除效果。由于化學(xué)合成的siRNA、質(zhì)粒、腺病毒介導(dǎo)RNAi的暫時性，需要多次重復(fù)轉(zhuǎn)染才能保證實驗持續(xù)進行，而用慢病毒載體構(gòu)建的細胞系則可以長期多次應(yīng)用，因此慢病毒介導(dǎo)RNAi又是一種經(jīng)濟便捷的RNAi方法。

在構(gòu)建慢病毒具有較高敲除率方面，我們應(yīng)用軟件BLOCK-iTMRNAi Designer設(shè)計合成靶向ABCG2 cDNA 序列（NM_004827）的 829～850、1378～1399、1462～1483、1193～1212 靶位點的 4 對 shRNA序列，構(gòu)建成相應(yīng)的4種重組慢病毒，感染Caco-2細胞，4種重組慢病毒的敲除效率各不相同，其中靶向1378～1399位點的慢病毒具有最高的敲除效率77%。由于實驗中病毒對細胞的感染復(fù)數(shù)相同（MOI＝3），這說明干擾效率的不同源于shRNA敲除能力的不同。如何預(yù)測shRNA的敲除效率還沒有明確的方法[8]，4種重組慢病毒Lv-ABCG2-shRNA敲除效率的不同，可能是由于靶向同一基因的不同靶區(qū)域而設(shè)計的shRNA序列不同[9]。這與國外一篇報道的結(jié)果是一致的[10]，其研究中用靶向ABCG2 cDNA 序 列 （NM_004827） 的 1225～1245、938～958、2007～2027、1403～1423、833～853 靶位點的 5 種重組慢病毒，敲除Caco-2細胞的ABCG2，5種病毒的敲除效率從54%到97%不等，其中靶向1403～1423位點的慢病毒具有最高的敲除效率97%。比較兩研究中ABCG2的靶位點的不同敲除效率及最高敲除效率，推測序列1378～1423可能是最佳的敲除ABCG2的靶點范圍，這對應(yīng)用RNAi技術(shù)敲除ABCG2的靶點選擇具有重要的指導(dǎo)作用。

綜上所述，我們應(yīng)用靶向ABCG2基因的重組慢病毒感染Caco-2細胞，首次成功構(gòu)建了持久、穩(wěn)定敲除ABCG2的Caco-2細胞模型。該細胞模型不僅用于體外研究腸道中ABCG2對口服藥物化合物吸收的作用，而且對于口服藥物的篩選及提高營養(yǎng)物質(zhì)的口服生物利用度和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等研究具有重要意義。

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