劉 賓，劉 穎，義志忠，賴毅東，彭喜春，吳希陽,*

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.東莞市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 東莞 523120)

適體在抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

劉 賓1，劉 穎1，義志忠2，賴毅東2，彭喜春1，吳希陽1,*

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.東莞市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 東莞 523120)

目前雖然已有氯霉素、新霉素等抗生素抗體應(yīng)用于食品檢測(cè)中，但作為半抗原，抗生素抗體制備困難?？股胤N類繁多，抗體使用成本高，大樣本篩查困難，靈敏度低等缺陷限制了抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用。而DNA或RNA適體被稱作化學(xué)抗體，可以高特異、高親和力地同靶分子結(jié)合。與傳統(tǒng)免疫抗體相比，在篩選制備、穩(wěn)定性及應(yīng)用等方面都顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文對(duì)適體的發(fā)現(xiàn)、特點(diǎn)及篩選方法進(jìn)行綜述，介紹適體在抗生素及其他小分子檢測(cè)中的主要應(yīng)用技術(shù)，并對(duì)適體的檢測(cè)應(yīng)用進(jìn)行展望。

適體；抗生素；傳感器；酶聯(lián)檢測(cè)；aptazyme

Abstract：Although it is difficult to immunize animals with antibiotics as half-antigens for antibody generation, immunoassay techniques have become the most popular methods for detecting antibiotics in foods and environment, such as commercially available chloramphenicol and neomycin test kits. Nevertheless, actual applications of immunoassay techniques are limited due to the wide variety of antibiotics, high cost of preparing antibodies against some antibiotics, difficulties in large-scale screening of samples and low sensitivity of these techniques. Aptamers, also named chemical antibody, are single stranded DNA or RNA ligands,which can be bound to different targets from a huge library of molecules containing randomly created sequences with high specificity and affinity. Aptamers have some advantages over conventional immune antibodies, such as easyin vitroselection by their target molecules, the possibility of chemical synthesis and modification and high stability. This paper describes the finding history of aptamers, methods for selecting them, their characteristics and techniques established based on them for the detection of antibiotics and other small molecules. Furthermore, application perspectives of the aptamers based detection techniques are proposed.

Key words：aptamers；antibiotics；sensors；enzyme-linked immunosorbent assay；aptazyme

抗生素在畜禽的飼料添加劑中被廣泛使用，并在動(dòng)物基本治療中濫用，使得動(dòng)物源性食品中抗生素殘留問題成為食品安全關(guān)注的焦點(diǎn)之一。人體攝入含有抗生素殘留食品后，可能導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性增加，造成人體微生物環(huán)境平衡的紊亂和失調(diào)，情況嚴(yán)重的還會(huì)造成中毒反應(yīng)或致畸致殘。

目前抗生素檢測(cè)方法主要包括微生物法、理化法、免疫法。微生物法簡單直觀，但測(cè)定時(shí)間長且結(jié)果誤差較大。理化法是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測(cè)定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、比色法、熒光分光光度法等，雖然敏感性較高，但需要昂貴的設(shè)備，檢測(cè)程序較復(fù)雜，費(fèi)用較高。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是免疫檢測(cè)法的主要形式，具有操作簡單、靈敏、特異、快速、不需要昂貴的儀器等優(yōu)點(diǎn)。ELISA法檢測(cè)抗生素有諸多優(yōu)點(diǎn)，特別是抗體針對(duì)特定抗生素的特異性和高靈敏度是其他方法所不能比擬的。但ELISA不可避免地存在一些缺陷：對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，分析分子質(zhì)量很小的化合物或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。由于多數(shù)抗生素屬于半抗原，導(dǎo)致抗體的制備困難，成本高，應(yīng)用范圍受到免疫原性限制，無法直接通過動(dòng)物免疫得到相應(yīng)抗體，極大限制了ELISA在抗生素檢測(cè)中的應(yīng)用?；谶@些原因，尋求抗體的有效替代物成為分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。其中，作為單鏈小分子RNA、DNA的適體分子(aptamer)具有抗體無可比擬的優(yōu)越性，而且成為了藥物篩選、診斷、基因治療各領(lǐng)域最具潛力的分子工具[1-2]。

表1 寡核苷酸適體與抗體的比較[5-6]Table 1 Differences between aptamers and antibodies

1 適體概述

寡核苷酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)[3-4]從體外篩選得到的，能與相應(yīng)配體專一性緊密結(jié)合的一類單鏈寡核苷酸，又稱為適體(aptamer)。適體與靶分子的親和力非常高[3](解離常數(shù)可達(dá)nmol/L級(jí)或pmol/L級(jí))，而且特異性極強(qiáng)(可分辨抗生素分子中一個(gè)羥基的不同)。

1.1 適體特性

寡核苷酸適體不但和抗體一樣能與靶分子高效、專一地結(jié)合，而且具有許多連抗體都無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，見表1。

1.2 抗生素適體

抗生素種類眾多，且大部分屬于半抗原，作為免疫原獲得每一種抗生素的抗體比較困難。而食品中所含抗生素殘留非常復(fù)雜，嘗試篩查每種抗生素的成本很高，且無法同步檢測(cè)。如表1所述，由于單鏈核酸可形成三維結(jié)構(gòu)的多樣性以及適體與配體之間相互作用力的多樣性，理論上自然界中的絕大多數(shù)物質(zhì)(各種有機(jī)小分子、生物大分子、細(xì)胞器、細(xì)胞、甚至是整個(gè)組織等)都可以篩選到相應(yīng)的核酸適體[1]，得到相應(yīng)適體后可化學(xué)合成，使用成本低。所以適體可以廣泛的應(yīng)用于食品中各種抗生素的檢測(cè)。迄今為止，已有多種抗生素的適體序列發(fā)表，見表2。

表2 部分抗生素適體Table 2 Selected aptamers for antibiotics

2 適體的分析應(yīng)用

核酸適體在很多領(lǐng)域都有應(yīng)用。根據(jù)適體的特性，已經(jīng)應(yīng)用于治療、診斷和新藥研發(fā)方面，而適體的高親合力、嚴(yán)格的識(shí)別能力和反應(yīng)的特異性，以及其靶分子范圍的廣泛性，使得適體非常適合檢測(cè)和診斷[16]。適體與靶分子的結(jié)合類似抗原與抗體形成的復(fù)合物，其結(jié)合信號(hào)可以通過多種方式表現(xiàn)，可通過標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)合信號(hào)，如酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記與生物素標(biāo)記，另外還可應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)、傳感器、熒光偏振、分子燈塔以及毛細(xì)管電泳等檢測(cè)手段，其應(yīng)用的廣泛性遠(yuǎn)勝過抗體[17-18]。

適體作為檢測(cè)方法中的識(shí)別分子或報(bào)告分子，已有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，如環(huán)境中有害物質(zhì)的檢測(cè)，食品中化學(xué)物質(zhì)和微生物檢測(cè)，以及凝血酶、生長因子的診斷應(yīng)用等[19-21]。作為食品安全監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)，抗生素的適體法檢測(cè)也有報(bào)道。根據(jù)適體與靶分子結(jié)合后傳出信號(hào)和檢測(cè)手段的不同，本文將分3類介紹已經(jīng)發(fā)表的基于適體的檢測(cè)方法。

2.1 適體生物傳感器

傳感器是一種能夠連續(xù)和可逆地進(jìn)行分子識(shí)別的裝置，適體能與靶分子高特異性、高親和力的結(jié)合，可以作為核酸適體傳感器中的識(shí)別分子。以適體為基礎(chǔ)的新型生物傳感器和生物分析方法在近年有較大進(jìn)展。相對(duì)傳統(tǒng)的抗體，作為識(shí)別元件的適體在生物傳感器中應(yīng)用展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。適體分子小、化學(xué)穩(wěn)定性高、成本低，更重要的是適體用于傳感器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)，更加靈活、方便，引導(dǎo)了新型高靈敏度和選擇性生物傳感器的方向[1]。

相對(duì)于抗體，適體應(yīng)用于傳感器有很多優(yōu)勢(shì)。作為DNA的適體通常有更高的化學(xué)穩(wěn)定性。另外，適體可耐受重要的構(gòu)想改變，而且不影響與靶分子的結(jié)合，這為具有高靈敏度和選擇性的新型生物傳感器的設(shè)計(jì)提供了更大的靈活性。適體的靶分子不受免疫原性限制，特別是對(duì)抗生素一類的小分子[5]。目前已經(jīng)篩選出K+、ATP、多肽和蛋白，甚至是細(xì)胞和細(xì)菌的適體[22-25]，為以適體為基礎(chǔ)的新型生物傳感器應(yīng)用到診斷、反生物恐怖、環(huán)境檢測(cè)和食品分析等領(lǐng)域提供了理論基礎(chǔ)[26]。

根據(jù)信號(hào)收集方法的不同，適體生物傳感器分為電化學(xué)、光學(xué)和壓電晶體適體傳感器，其中光學(xué)和電化學(xué)傳感器的應(yīng)用較多。

2.1.1 光學(xué)適體傳感器

光學(xué)適體傳感器又包括光纖適體生物傳感器、消失波光纖生物傳感器、表面等離子共振適體傳感器、熒光適體傳感器4種形式，已有研究分別用于新霉素B、凝血酶、生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、人IgE的檢測(cè)，其中熒光適體傳感器的應(yīng)用最廣[26-29]。

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)[11]屬于光學(xué)傳感器技術(shù)的一種，通常是將適體分子固化在以石英或玻璃為載體的金屬(通常為金)膜表面，加入待測(cè)目的物，兩者的結(jié)合使金屬膜與溶液界面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。如果固定入射光角度，就能根據(jù)共振角的改變程度對(duì)待測(cè)目的物進(jìn)行定量分析，該方法無需標(biāo)記，十分方便。

de-los-Santos-alvarez等[11]利用SPR技術(shù)設(shè)計(jì)了新霉素B檢測(cè)的傳感器。新霉素B適體為RNA，為防止RNA酶的降解，先將該適體2’位甲基化。新霉素B通過化學(xué)反應(yīng)固定到金傳感器表面，而不是傳統(tǒng)傳感器中固定適體在上面，當(dāng)適體溶液流過傳感器表面時(shí)，電阻光譜會(huì)發(fā)生變化。樣品中新霉素B的含量越高，與固定的新霉素B結(jié)合的適體就越少，所檢測(cè)到的光信號(hào)就越低，反之越高。用表面等離子共振技術(shù)所制作的生物傳感器，檢測(cè)修飾后的適體對(duì)靶分子的親和力沒有明顯的減弱，檢測(cè)新霉素B的線性范圍為10nmol/L～100μmol/L，結(jié)果表明適體傳感器可以高靈敏度地檢測(cè)抗生素類。

熒光適體生物傳感器主要是用熒光基團(tuán)標(biāo)記核酸適體，基于目標(biāo)分子和核酸適體作用后產(chǎn)生的熒光偏振或者熒光強(qiáng)度的改變來檢測(cè)目標(biāo)分子；或者將熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別標(biāo)于核酸適體上，通過將目標(biāo)分子引入到體系中后熒光信號(hào)的改變來實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定量分析。Su等[30]利用熒光標(biāo)記的核酸適體(FDNA)和猝滅劑修飾的一小段互補(bǔ)寡核苷酸(QDNA)設(shè)計(jì)了一個(gè)開關(guān)裝置(圖1)。當(dāng)目標(biāo)分子(ATP)不存在時(shí)，核酸適體與QDNA 雙鏈結(jié)合，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)接觸引起熒光猝滅；而當(dāng)目標(biāo)分子存在時(shí)，核酸適體將優(yōu)先和目標(biāo)蛋白分子形成復(fù)合物，QDNA從熒光標(biāo)記的核酸適體表面解離出來，熒光信號(hào)得到極大的增強(qiáng)。ATP濃度越高，信號(hào)強(qiáng)度越大。

圖1 熒光法檢測(cè)ATP示意圖[30]Fig.1 Scheme for ATP detection by the method of fluorescence

2.1.2 電化學(xué)適體生物傳感器

電化學(xué)適體生物傳感器是由固定了適體的電極和電化學(xué)活性識(shí)別元素構(gòu)成。首先在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH值和離子強(qiáng)度條件下將適體固定到電極表面，將待測(cè)目的物加入電極表面，目的物與適體作用，從而導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)的變化；然后通過檢測(cè)電極表面電活性識(shí)別元素的電信號(hào)，達(dá)到識(shí)別和鑒定靶物質(zhì)的目的[30-32]。

Kim等[33]篩選出土霉素的DNA適體，并發(fā)明了電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)土霉素。首先將ssDNA固定至金交叉陣列(interdigitated array，IDA)的電極芯片上，以Fe(CN)6－3為轉(zhuǎn)能器，當(dāng)土霉素存在并隨濃度的變化時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同大小的電流，以此定量土霉素的濃度。此傳感器檢測(cè)土霉素濃度的線性范圍為1～100nmol/L。delos-Santos-lvarez 等[34]選用 FIS(faradaic impedance spectroscopy)作為信號(hào)換能器，檢測(cè)牛奶中的新霉素B，線性范圍為25～2500μmol/L，50μmol/L時(shí)回收率為102%，200μmol/L時(shí)為109%。

圖2 適體電化學(xué)傳感器示意圖Fig.2 Scheme for an aptamer based electrochemical sensor

Baker等[35]設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)傳感器，用于可卡因的檢測(cè)。由圖2可知，先將一段可卡因的核酸適體固定在金電極上，在核酸適體的另一段標(biāo)記電活性基團(tuán)MB。沒有目標(biāo)分子存在的情況下，MB是遠(yuǎn)離電極的；而可卡因存在下，該核酸適體與可卡因分子結(jié)合，因?yàn)镚-四聚體等結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)變化，MB接觸到電極表面，引起電信號(hào)的改變。根據(jù)MB的電化學(xué)信號(hào)的大小就可以得知可卡因的濃度。該方法靈敏度高，選擇性好，有望發(fā)展成一種手提式的電化學(xué)檢測(cè)裝置。

2.2 適體在色譜檢測(cè)中應(yīng)用

由于高親和力和特異性，免疫抗體是親和色譜中應(yīng)用最廣的親和配體，在分離純化和檢測(cè)分析中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在親和色譜中，免疫抗體存在著一些明顯的局限性：抗體固相化困難；體積大，固相表面覆蓋率低；抗體易失活，受緩沖溶液影響大。與抗體相比，核酸適體具有很多優(yōu)點(diǎn)，可以克服免疫抗體在親和色譜中的局限性。這些優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在容易固定化、容易保持構(gòu)象、固定相表面的覆蓋率高、穩(wěn)定性高、變性后容易復(fù)性等。相對(duì)于免疫抗體，適體在色譜檢測(cè)方面應(yīng)用的前景更加廣闊。核酸適體親和色譜充分發(fā)揮了適體與親和色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被應(yīng)用于小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞的分離和檢測(cè)。

Cruz-aguado等[36]篩選出可特異性識(shí)別赭曲霉素A(ochratoxin A)的DNA適體，構(gòu)建了DNA適體親和柱用于檢測(cè)小麥樣品中的赭曲霉素A。他們將赭曲霉素A的DNA適體共價(jià)鍵合在瓊脂糖樹脂上，然后填充在微柱中，制備了DNA適體親和柱。該親和柱能有選擇性地將赭曲霉素A從含有甲醇的小麥樣品的萃取液中富集，樣品中的干擾物則被淋洗去除。被吸附的赭曲霉素A可以被含有20%甲醇的1mmol/L EDTA和10mmol/L Tris(pH9)的緩沖液有效地洗脫，通過熒光光譜檢測(cè)洗脫得到赭曲霉素A，小麥樣品中赭曲霉素A的含量為0.47μg/kg。

2.3 Aptazyme檢測(cè)方法

近年美國Ellington等[4]在具有變構(gòu)效應(yīng)的核酶結(jié)構(gòu)中插入適體序列重組構(gòu)建成新的酶，稱為aptazyme，其催化活性受適體的專一性配體控制，即當(dāng)配體結(jié)合至適體區(qū)，aptazyme 酶活性增強(qiáng)[37-38]。aptazyme將適體和變構(gòu)核酶(allosteric ribozyme)相結(jié)合，重組成為新的富有吸引力的分子開關(guān)，既具有適體的特異性識(shí)別能力又具有核酶催化活性，可以作為分子開關(guān)用于檢測(cè)[39-40]。

aptazyme研究尚處于起步階段，目前主要是對(duì)錘頭型變構(gòu)核酶和L1連接酶進(jìn)行重組構(gòu)建，已用于ATP、FMN、茶堿等分子的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到nmol/L級(jí)[39,41-42]?；赼ptazyme檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)有很多優(yōu)越性，但現(xiàn)有的aptazyme 實(shí)驗(yàn)大都以同位素作為示蹤劑，通過檢測(cè)放射活性推知靶分子含量。事實(shí)上，基于aptazyme方法同免疫測(cè)定法一樣，也可通過不同報(bào)告分子(如酶、熒光素等)標(biāo)記設(shè)計(jì)多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ健?/p>

aptazyme作為適體檢測(cè)應(yīng)用的一種手段，可以借鑒上述研究應(yīng)用到食品中抗生素的檢測(cè)。相對(duì)于傳感器、酶聯(lián)檢測(cè)，有一定的優(yōu)勢(shì)。但目前對(duì)于aptazyme的研究還處于初級(jí)階段，aptazyme仍有許多不足之處尚待完善。

3 適體檢測(cè)應(yīng)用的前景

目前適體在檢測(cè)抗生素等小分子方面的應(yīng)用主要在傳感器領(lǐng)域，而利用其代替抗體應(yīng)用于酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)抗生素等小分子的技術(shù)少有報(bào)道。通過生物素-親和素系統(tǒng)可以固定標(biāo)記了生物素的適體或小分子，然后通過競(jìng)爭(zhēng)法、酶反應(yīng)信號(hào)的方法檢測(cè)目標(biāo)分子。生物素-親和素系統(tǒng)的穩(wěn)定性和適體同靶分子之間的高親和力，以及酶標(biāo)記信號(hào)放大作用，使得酶聯(lián)適體方法具有理論上的可能性，并可以研制成為試劑盒，使用更為方便、快捷，相對(duì)傳統(tǒng)的試劑盒，其成本低、靈敏度更高、特異性更強(qiáng)。因?yàn)樽R(shí)別分子適體性質(zhì)穩(wěn)定，變性后可以復(fù)性，使得酶聯(lián)試劑盒的重復(fù)使用成為可能，有可能給檢測(cè)試劑盒帶來一場(chǎng)革命。

抗生素種類多，制備抗體困難，且食品、環(huán)境等含有的抗生素非常復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)財(cái)。如果針對(duì)復(fù)雜的抗生素分別篩選其適體則容易的多，因此在大樣本篩查各種抗生素時(shí)，適體法更有潛力。相信在不久的將來，適體方法將取代傳統(tǒng)抗體成為抗生素乃至其他小分子、大分子檢測(cè)的重要手段。

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Advances in the Applications of Aptamers in Antibiotic Residue Detection

LIU Bin1，LIU Ying1，YI Zhi-zhong2，LAI Yi-dong2，PENG Xi-chun1，WU Xi-yang1,*
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. Dongguan Supervision Testing Institute of Quality and Metrology, Dongguan 523120, China)

Q503

A

1002-6630(2010)17-0452-05

2009-12-22

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20677023)；東莞市高等院校科研機(jī)構(gòu)科技計(jì)劃項(xiàng)目(200910810176)

劉賓(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：caisanrenju@163.com

*通信作者：吳希陽(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?、微生物。E-mail：tkentwu@jnu.edu.cn