何萬領，李曉麗

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003)

幾種有機化合物對三價鐵生物有效性及毒性的影響

何萬領，李曉麗

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003)

研究幾種有機化合物對鐵生物有效性和毒性的影響。用葡萄糖、乳糖、抗壞血酸或草酸與1.5mmol/L三價鐵的混合溶液分別孵育Caco-2細胞24h后，用細胞吸收鐵量作為鐵有效性指標，通過3-(4,5)-二甲基-2-(2,5)-二苯基溴化四氮唑藍(MTT)比色、乳酸脫氫酶(LDH)滲漏及細胞堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性分析評價鐵對細胞的毒性。結果表明，F(xiàn)e3+-葡萄糖、Fe3+-乳糖和Fe3+-抗壞血酸混合物鐵生物有效性較FeCl3顯著(P＜0.05)提高了2.57、4.08、4.52倍，F(xiàn)e3+-草酸使鐵生物有效性降低了18.73%。Fe3+-抗壞血酸顯著增加了細胞MTT吸收(P＜0.05)，并顯著降低了LDH滲漏(P＜0.05)，而Fe3+-乳糖顯著促進了LDH滲漏(P＜0.05)。與去離子水相比，F(xiàn)eCl3顯著降低了細胞SOD(P＜0.01)和AKP(P＜0.01)活性，而添加有機化合物對兩種酶活性有促進作用；比較而言，抗壞血酸對細胞SOD、GSH-Px和AKP活性均有顯著的促進作用(P＜0.05)。

有機化合物；三價鐵；生物有效性；毒性

Abstract：In order to explore the effects of organic compounds on the bioavailability and toxicity of ferric salts, the media containing 1.5 mmol/L ferric chloride alone (as a control) or its respective mixtures with glucose, lactose, ascorbic acid and oxalic acid were used to incubate Caco-2 cells for 24 h, and after completion of the incubation, intracellular iron concentration characterizing bioavailability was measured and the cellular toxicity of ferric was assessed by MTT, lactate dehydrogenase(LDH) leakage, alkaline phosphatase (ALK) activity, superoxide dismutase (SOD) activity, glutathione peroxidase (GSH-Px)activity assays. Compared with the control medium, the cells incubated in the media containing ferric chloride/glucose, ferric chloride/lactose or ferric chloride/scorbic acid mixtures showed 2.57, 4.08 and 4.52-fold increases in iron bioavailability, respectively.However, the presence of oxalic acid in the control medium resulted in a decrease of iron bioavailability of the cells by 18.73%.Compared with the control medium, the cells incubated in the medium containing ferric chloride/ascorbic acid complex exhibited a significantly higher MTT absorbance (P＜0.05) but a lower LDH leakage (P＜0.05); in contrast, the medium containing ferric chloride/lactose mixture significantly improved LDH leakage (P＜0.05). In addition, ferric chloride exhibited a reduction effect on the activities of SOD and ALK (P＜0.01) when compared with deionized water. However, respective additions of these organic compounds could improve the activities of SOD and ALK. On the other hand, the medium containing ferric chloride/ascorbic acid mixture had a promoting effect on the activities of SOD, ALK and GSH-Px (P＜0.05).

Key words：organic compound；ferric；bioavailability；toxicity

鐵是人體必需的微量元素，在體內(nèi)主要參與氧運輸和能量代謝。然而，鐵缺乏在世界范圍卻普遍存在[1-2]。膳食鐵強化是解決人體鐵缺乏的重要措施之一，但鐵強化劑選擇不當或鐵添加量過多往往會造成鐵中毒。鐵強化劑的生物有效性決定其補鐵效果，同時與鐵毒性密切相關[3-4]。研究認為，鐵生物有效性和毒性除與鐵強化劑種類、鐵水平及鐵價態(tài)有關外，還與食物中的化學組成密切相關[4-6]。因此，研究食物中某些化學成分對鐵生物有效性和毒性的影響，對解決人體鐵缺乏及預防鐵中毒具有重要的參考價值。本實驗利用Caco-2細胞體外模型研究葡萄糖、乳糖、抗壞血酸及草酸對三價鐵生物有效性和毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Caco-2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

DMEM培養(yǎng)液、胰酶/EDTA液、D-Hank＇s液、青霉素、鏈霉素 美國Gibco公司；標準胎牛血清 杭州四季青生物有限公司；氯化鐵(分析純) 天津金匯太亞化學試劑有限公司；二甲基亞砜 Sigma分裝；25cm2正方斜口培養(yǎng)瓶、96孔和24孔培養(yǎng)板 Corning公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

二氧化碳培養(yǎng)箱 德國Kendro Laboratory Products GmbH 公司；TE2000U倒置顯微鏡 日本Nikon 公司；680型酶標儀 美國 Bio-Rad公司；MTT 美國Sigma公司；AA-7003型原子吸收光譜儀 東莞市常平邦鑫偉業(yè)儀器制造廠。

1.2 細胞培養(yǎng)

Caco-2細胞被用于實驗前經(jīng)過20～43代的傳代培養(yǎng)。Caco-2細胞生長在25cm2的斜口培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液采用DMEM液，并含有10%胎牛血清、1g/100mL非必需氨基酸、20mmol/L的2-[4-(2-羥乙基)-1-對二氮己環(huán)]-乙磺酸(HEPES)、2mmol/L的L-谷氨酸鹽、100U/mL青霉素G和100μg/mL鏈霉素。然后，將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃，5%二氧化碳及95%相對濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中。每2～3d換一次培養(yǎng)液，到細胞完成貼壁融合后(或細胞長滿90%以上培養(yǎng)瓶底壁)，用胰酶/EDTA溶液將細胞從瓶壁消化掉，加新鮮培養(yǎng)液，充分吹打，使細胞混懸。將細胞懸液分別轉(zhuǎn)入96孔和24孔培養(yǎng)板中，放二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞生長達到貼壁融合后，將培養(yǎng)液撤出。將預先配制好的三價鐵及與有機物混合的溶液分別加入各孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別測定培養(yǎng)液中細胞代謝產(chǎn)物，細胞酶活性和細胞內(nèi)鐵含量。

1.3 鐵溶液配制

準確稱取三氯化鐵溶解于去離子水中，用0.22μm濾膜過濾除菌，配制成三價鐵貯備液。吸取鐵貯備液，用去離子水稀釋至鐵濃度為1.5mmol/L的實驗液；同時取鐵貯備液分別與葡萄糖、乳糖、抗壞血酸、草酸按照1:10和1:20的物質(zhì)的量比配制成鐵濃度為1.5mmol/L的Fe3+-有機物混合液；去離子水作為空白對照。

1.4 細胞鐵吸收測定

準確吸取各鐵溶液1.0mL加入培養(yǎng)孔中，每個鐵處理設置6個重復，對照組為去離子水，將細胞培養(yǎng)板重新置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。細胞經(jīng)鐵處理后，吸出培養(yǎng)液，用D-Hank’s液沖洗兩次，每次2mL。將培養(yǎng)板放入超聲波振蕩器中破碎15min，此過程在4℃冷室內(nèi)進行[7]。用2mL去離子水充分沖洗細胞入5mL塑料離心管中。取部分通過考馬斯亮藍法測定細胞蛋白質(zhì)。其余細胞處理液于100℃，烘干24h，加入5mL濃硝酸，同時滴加5滴體積分數(shù)為30%的雙氧水，在80℃條件下消化，消化殘留物用1.4mol/L的硝酸溶液溶解，用去離子水定容至5mL。用原子吸收光譜儀測定消化液中鐵含量。

1.5 細胞活力測定

采用3-(4,5)-二甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑藍(MTT)吸收比色實驗。Caco-2細胞經(jīng)鐵溶液處理后，除去培養(yǎng)液，用D-Hank’s液沖洗細胞兩次。加0.4mg/mL MTT溶液0.2mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。小心將MTT溶液吸出，然后往各孔中加1mL二甲基亞砜(無菌態(tài))。將培養(yǎng)板置37℃恒溫振蕩器中振蕩10min后，用酶標儀于波長552nm處測定吸光度[8]。

1.6 乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)漏滲

LDH存在正常細胞的線粒體內(nèi)，當細胞膜受到損壞時活細胞死亡，LDH便從細胞漏滲入培養(yǎng)液。細胞經(jīng)鐵溶液處理后，吸取培養(yǎng)液，利用LDH檢測試劑盒，用分光光度計于波長540nm處測定吸光度[9]。

1.7 細胞酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)和堿性磷酸酶(AKP)活性測定均采用試劑盒。

1.8 數(shù)據(jù)分析及處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003；采用DPS3.01統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較，以P＜0.05為顯著水平，實驗結果用“平均數(shù)±標準差”表示；圖表制作使用Sigmaplot10.0。

2 結果與分析

2.1 Fe3+-有機物對鐵生物有效性的影響

不同有機物對三價鐵生物有效性的影響見圖1。與氯化鐵組相比，葡萄糖、乳糖和抗壞血酸分別使鐵生物有效性顯著(P＜0.05)提高了2.57、4.08、4.52倍，以抗壞血酸效果最好。相反，草酸的添加對三價鐵生物有效性有一定抑制作用，但差異不顯著。Fe3+-草酸使鐵生物有效性降低了18.73%。

圖1 Fe3+-有機物對鐵生物有效性的影響(鐵與結合物物質(zhì)的量比為 1∶10)Fig.1 Effect of the presence of organic compounds on ironbioavailability (10∶1 ferric-to-organic compound molar ratio, hereinafter the same)

2.2 Fe3+-有機物對Caco-2細胞活性的影響

圖2 Fe3+-有機物對Caco-2細胞活性的影響Fig.2 Effect of the presence of organic compounds on the viability of Caco-2 cells

圖2顯示為Fe3+-有機物結合對Caco-2細胞MTT吸收的影響。結果表明，F(xiàn)e-抗壞血酸組Caco-2細胞MTT吸光度顯著(P＜0.05)高于空白對照組、FeCl3組和其他鐵有機物復合組，且隨著抗壞血酸含量增加，MTT吸光度顯著增加(P＜0.05)。Fe-葡萄糖復合對Caco-2細胞生活能力無顯著影響。Fe-乳糖復合可降低細胞MTT吸收，尤其是鐵與乳糖物質(zhì)的量比為1:20時，細胞MTT吸收顯著降低(P＜0.05)。Fe-草酸顯著降低了Caco-2細胞MTT吸光度(P＜0.05)。

2.3 Fe3+-有機物對Caco-2細胞膜透性的影響

圖3 Fe3+-有機物對Caco-2細胞膜透性的影響Fig.3 Effect of the presence of organic compounds on the membrane permeability of Caco-2 cells

三價鐵及與有機物結合對Caco-2細胞LDH漏滲的影響見圖3。與空白對照組相比，1.5mmol/L的三價鐵增加了Caco-2細胞LDH的漏滲(P＞0.05)，尤其是三價鐵與乳糖結合時，可顯著提高細胞LDH的漏滲(P＜0.05)，且隨乳糖水平增加而顯著增加(P＜0.05)。相反，三價鐵與抗壞血酸結合可顯著降低細胞LDH漏滲(P＜0.05)。三價鐵與葡萄糖或草酸結合對Caco-2細胞LDH漏滲無顯著影響。

2.4 Fe3+-有機物對Caco-2細胞酶活性的影響

三價鐵及與有機物結合對Caco-2細胞抗氧化酶(SOD和GSH-Px)和標志性酶(AKP)活性的影響見表1。結果表明，三價鐵極顯著的降低了Caco-2細胞SOD酶活性(P＜0.01)；而有機物可降低三價鐵對Caco-2細胞內(nèi)SOD的消耗，且隨著葡萄糖、乳糖、抗壞血酸和草酸添加水平的增加，細胞SOD活性逐漸增加；而相對于空白對照組(去離子水)，F(xiàn)e-葡萄糖和Fe-乳糖組可顯著降低細胞SOD活性(P＜0.05)，F(xiàn)e-抗壞血酸和Fe-草酸組細胞SOD活性無顯著改變。與FeCl3相比，F(xiàn)e-葡萄糖和Fe-乳糖組可降低Caco-2細胞GSH-Px活性，而Fe-抗壞血酸結合可顯著提高GSH-Px活性(P＜0.05)，F(xiàn)e-草酸結合對其影響不大。三價鐵及與有機物結合對Caco-2細胞標志性酶(AKP)活性影響表明，三價鐵及與有機物結合均顯著降低了Caco-2細胞AKP活性(P＜0.05)。但三價鐵與有機物結合后均不同程度的降低了三價鐵對Caco-2細胞AKP活性的影響，且Fe-抗壞血酸和Fe-草酸組合效果最好(P＜0.05)。

表1 Fe3+-有機物對Caco-2細胞酶活性的影響Table 1 Effect of the presence of organic compounds on the activities of SOD, ALK and GSH-Px in Caco-2 cells

3 結論與討論

3.1 有機化合物對鐵生物有效性的影響

鐵生物有效性指的是能被生物體吸收利用并具有生理功能的部分，在實踐中可通過含量、吸收、化學形態(tài)或生理功能的改善來評價鐵生物有效性的高低。研究認為，鐵生物有效性易受食物組成成分的影響，如半胱氨酸[10]、部分有機酸[11]、抗壞血酸[12]、某些糖類[13]等對鐵吸收均有不同程度的促進作用；而植酸[14]、單寧酸[15]、植物纖維[16]、多酚類[17]、磷[18]、草酸[19]等卻對鐵吸收有抑制作用。本研究結果表明，抗壞血酸、乳糖和葡萄糖對三價鐵生物有效性有顯著的促進作用?？箟难岷腿樘蔷哂羞€原性，能夠?qū)⑷齼r鐵還原成二價鐵[12,20]，而二價鐵是腸道主要吸收形式。葡萄糖分子中含有游離的醛基，在氧化劑存在時，能被氧化成糖酸，從而降低溶液pH值，而弱酸條件有利于鐵的吸收[7,12]。本研究表明，草酸能降低三價鐵生物有效性，這一結果與早期的研究一致[11]。盡管草酸可降低溶液pH值，研究表明2mmol/L和4mmol/L的草酸可使中性溶液pH值降低為6.3和5.1，但草酸更容易與鐵結合成難溶的草酸鹽，從而降低鐵的有效性[11]。

3.2 有機結合物對鐵毒性的影響

MTT吸收量分析是免疫學細胞毒性測定的重要指標，由Mosmann首次應用于細胞免疫學。MTT反映細胞對外來刺激的敏感性，也是評價細胞存活率的重要指標[20]。本研究結果表明，三價鐵對Caco-2細胞生存能力無顯著影響，這一結果與早期的研究相同[4]。Fe-抗壞血酸結合顯著地提高了Caco-2的生存能力，表明抗壞血酸的還原作用并未使轉(zhuǎn)化的二價鐵量達到毒害作用。同時LDH漏滲表明，抗壞血酸保護了細胞膜免受三價鐵及其他氧化物的氧化損傷。MTT分析和LDH漏滲表明，乳糖盡管對鐵生物有效性是有利的，但乳糖卻促進三價鐵的毒性，尤其是乳糖水平較高時，F(xiàn)e-乳糖結合毒性更強。本研究還表明，F(xiàn)e-草酸結合盡管對Caco-2細胞膜透性無顯著影響，但卻降低了細胞的生存能力，具體機制并未見報道。本研究認為，有可能是草酸與鐵結合形成難溶性沉淀，覆蓋于細胞層表面，從而影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)及MTT的吸收所致。

三價鐵及其有機結合物對Caco-2細胞酶活性的影響表明，三價鐵離子顯著降低了細胞SOD和AKP活性，而鐵與有機物結合卻在一定程度上提高了酶活性。無機鐵離子被認為性質(zhì)極不穩(wěn)定，可誘導細胞膜脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生氧化自由基。對大鼠的研究表明，無機鐵離子可使大鼠體內(nèi)氧化產(chǎn)物提高，而導致自由基增多，破壞體內(nèi)的抗氧化體系平衡[21]。而三價鐵與有機物結合可提高鐵的穩(wěn)定性，降低三價鐵離子的氧化損失作用和產(chǎn)生自由基的概率。但有機物與三價鐵的結合能力是不同的，本研究表明，抗壞血酸、草酸與鐵的結合能力大于葡萄糖和乳糖，表現(xiàn)為Fe-抗壞血酸和Fe-草酸處理組細胞SOD、GSH-Px和AKP活性高于Fe-葡萄糖和Fe-乳糖組。

總之，抗壞血酸、葡萄糖、乳糖均有提高三價鐵有效性的作用，尤其以抗壞血酸效果最好，草酸對三價鐵生物有效性的影響不顯著?？箟难峥娠@著降低三價鐵毒性，草酸、高水平乳糖與三價鐵結合可顯著降低細胞的生存能力。

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Effects of Organic Compounds on Bioavailability and Toxicity of Ferric Salts

HE Wan-ling，LI Xiao-li
(College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

TS201.2

A

1002-6630(2010)17-0355-04

2010-01-06

河南科技大學博士啟動基金項目(09001406)；河南省教育廳自然科學項目(2010B230001)；國家自然科學基金項目(20677051)

何萬領(1976—)，男，副教授，博士，主要從事微量元素與生物健康研究。E-mail：hwling674@yahoo.com.cn