朱 盼，陳紅兵,*，胡純秋，李 欣，羅春萍,3

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330047 )

基于表位預(yù)測的花生過敏原Arah6免疫交叉反應(yīng)性研究

朱 盼1,2，陳紅兵1,2,*，胡純秋1,2，李 欣1,2，羅春萍1,2,3

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330047 )

為了探討花生過敏原Arah6與其他同源蛋白之間的交叉反應(yīng)，通過各種生物信息數(shù)據(jù)庫(Genbank，DiscoTope)以及網(wǎng)絡(luò)工具及軟件(BLAST，NPS@和Protean，Clustal x，PyMOL)，開展基于表位預(yù)測的Arah6交叉免疫反應(yīng)性研究。結(jié)果表明：肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118區(qū)域可能是Arah6的線性表位優(yōu)勢區(qū)域；Arah6的構(gòu)象型表位優(yōu)勢區(qū)有4個，它們存在的區(qū)域為AA1～13、35～51、53～59、89～105；基于線性表位預(yù)測的15種蛋白質(zhì)與Arah6可能具有交叉反應(yīng)性，其中4種(Arai6，conglutin，Arad6和conglutin 8)發(fā)生交叉反應(yīng)的概率為100%；基于構(gòu)象型表位預(yù)測的17種蛋白質(zhì)與Arah6可能具有交叉反應(yīng)性，其中4種(Ara i 6，conglutin，Arad6和conglutin 8)發(fā)生交叉反應(yīng)的概率為100%。本結(jié)果對進一步了解Arah6的過敏性以及指導(dǎo)開展食品中Arah6的免疫學(xué)檢測具有重要作用。

Arah6；花生過敏；表位；交叉反應(yīng)；預(yù)測

Abstract：In order to explain cross-reactivity between peanut allergen Arah6 and other homologous proteins, various kinds of bioinformationcal databases, including Genbank and DiscoTope, and net tools/software, including BLAST, NPS@, Protean,Clustal x and PyMOL, were used for the epitope analysis between these proteins. It was indicated that the linear epitopes on Arah6 existed with high probability in the regions of AA10－15, 45－48, 53－60 and 116－118, and the conformational epitopes in the regions of AA1－13, 35－51, 53－59 and 89－105. According to the prediction of linear epitopes, there were fifteen proteins might cross-react with Arah6, and the possibility of cross-reactivity of four of them (Ara i 6, conglutin, Ara d 6 and conglutin 8) was 100%. However, according to the prediction of conformational epitopes, the number of proteins could cross-react with Arah6 with high probability was 17, and the possibility of cross-reactivity of four of them (Ara i 6, conglutin,Ara d 6 and conglutin 8) was 100%. These investigations will be beneficial for understanding peanut Arah6 allergy and help to develop an approach for the immunologic detection of Arah6 in foods in the future.

Key words：Arah6；peanut allergy；epitopes；cross-reactivity；prediction

花生廣泛存在于各類食品中，花生過敏是一類較普遍的食物過敏反應(yīng)[1]，食品中極少量的花生過敏原便會產(chǎn)生嚴重的變態(tài)反應(yīng)，有時可引起過敏性休克并危及生命，嚴重影響了部分過敏人群的生活質(zhì)量[2]。目前國際免疫聯(lián)合會命名小組委員會認可的花生過敏原有11種[3]，其中，Arah6是一種主要的過敏原，屬于2S白蛋白家族，與花生中另一主要過敏原Arah 2的氨基酸序列有59%的同源性[4]。另外，抗原表位是免疫交叉反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]，可分為線性表位和構(gòu)象型表位。線性表位由肽鏈上連續(xù)的5～7個氨基酸組成[6]，主要識別過敏原中特定的氨基酸序列。目前公認，在氨基酸數(shù)目超過80的蛋白質(zhì)中，若序列同源性大于30%或有6個連續(xù)相同的氨基酸序列，則認為蛋白之間可能存在交叉反應(yīng)[7]。構(gòu)象型表位則是由蛋白中不連續(xù)氨基酸序列通過折疊等方式形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)而發(fā)生作用，占抗原表位中的90%[8-9]。通過蛋白質(zhì)序列同源性和軟件分析，利用已知蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬未知蛋白三維結(jié)構(gòu)[8]，經(jīng)對比分析，可以預(yù)測具有相同/相似構(gòu)象結(jié)構(gòu)蛋白的交叉反應(yīng)性。

迄今為止，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)包括表位的預(yù)測使用了很多生物信息庫和軟件。如，GenBank數(shù)據(jù)庫是世界上著名的生物信息數(shù)據(jù)庫，是由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)維護的一級核酸序列數(shù)據(jù)庫[10]，其中的BLAST工具主要用于序列對比和同源性分析。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)是目前最主要的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫之一，其包含了大量的抗原抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及相關(guān)信息[6]。而SWISS- MODEL是一個有注解的基于同源建模的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)服務(wù)器[11]，可提供蛋白質(zhì)三維建模服務(wù)，任秀艷等[12]用此軟件成功完成了HrpNEa蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測。另外，DNAStar軟件是一種用于DNA和蛋白質(zhì)分析的生物軟件，其中Protean主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，黎明等[13]采用此軟件成功預(yù)測了豬傳染性胃腸炎病毒的二級結(jié)構(gòu)和B細胞抗原表位。ABCpred則采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測線性表位，預(yù)測敏感性約為67%，特異性約為64%[6,14]，而且李明才等[15]采用此方案對與預(yù)測所得到的人白細胞介素-33蛋白的B細胞抗原表位結(jié)果進行最終驗證。值得關(guān)注的是，DiscoTope是通過蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來預(yù)測構(gòu)象表位的一種新功能軟件[16]，紀濱等[17]采用此軟件成功預(yù)測了H5N1亞型禽流感HA蛋白抗原的非線性B細胞表位，并通過了實驗鑒定。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，將花生過敏原Arah6進行氨基酸序列分析，預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)、線性表位、構(gòu)象型表位，從而預(yù)測交叉反應(yīng)，對進一步了解Arah6的過敏性以及指導(dǎo)開展食品中Arah6的免疫學(xué)檢測具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 花生過敏原Arah6DNA序列來源

通過GenBank檢索花生過敏原Arah6的基因序列，該基因在GenBank的登錄號為AAD56337。應(yīng)用DNAStar軟件推導(dǎo)出該基因的氨基酸序列。

1.2 Arah6氨基酸序列同源性分析

利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析Arah6氨基酸序列，預(yù)測同源性蛋白。

1.3 基于Arah6線性表位的免疫交叉反應(yīng)預(yù)測方案

1.3.1 Arah6蛋白的線性表位預(yù)測

利用NPS@網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://npsa-phil.ibcp.fr/ cgibin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_server.html)和DNAStar生物分析軟件(Gamier-Robson方法)中的protean軟件對Arah6蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。Protean軟件采用Kyte-Doolittle等方案預(yù)測Arah6的親水性(hydrophilicity)[18]，Emini法預(yù)測表面可及性(accessibility)[19]，Jameson-Wolf法預(yù)測抗原性(antigenicity)[20]，Karplus-Schulz法預(yù)測蛋白柔韌性(flexibility)[21]，綜合各因素，預(yù)測Arah6可能的線性表位區(qū)。

1.3.2 基于線性表位的免疫交叉反應(yīng)預(yù)測

根據(jù)已知的Arah6表位區(qū)，在同源蛋白中，利用軟件Clustalx進行多序列對比分析，查找相同/相似表位區(qū)域，預(yù)測可能與目的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)。

1.4 基于Arah6構(gòu)象型表位的免疫交叉反應(yīng)預(yù)測方案

1.4.1 Arah6三維結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測構(gòu)象型表位

利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/) 模擬Arah6的PDB構(gòu)象圖，并在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫DiscoTope[22](http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope)中預(yù)測其空間構(gòu)象型表位。

1.4.2 基于構(gòu)象型表位的交叉反應(yīng)預(yù)測

結(jié)合各蛋白的序列，利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫S W I S SMODEL模擬其PDB構(gòu)象圖，并在DiscoTope中預(yù)測構(gòu)象型表位，與目的蛋白對比，預(yù)測免疫交叉反應(yīng)。在預(yù)測中，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫DisoTope是實現(xiàn)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測構(gòu)象型表位的一種新方法[6]，本工作中選定特異性表位默認閾值－7.7，此時預(yù)測的特異性為75%，敏感性為47%。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生過敏原Arah6的氨基酸序列

根據(jù)GenBank中登錄號位AAD56337(Arah6)的DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列如下：AHASAMRRERGR QGDSSSCERQVDGVNLKPCEQHIMQRIMGEQEQYDSYNFGS TRSSDQQQRCCDELNEMENTQRCMCEALQQIMENQCD GLQDRQMVQHFKRELMNLPQQCNFGAPQRCDLDVSGGRC。

2.2 Arah6氨基酸序列同源性分析

利用GenBank網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫對Arah6進行BLAST分析，具體結(jié)果見表1。

表1 Arah6的同源序列BALST分析結(jié)果Table 1 Homology sequences comparison of Arah6 using BALST

通過BLAST分析得知：能與Arah6發(fā)生交叉反應(yīng)的蛋白主要來自于不同花生種屬以及大豆、羽扇豆、大麥、黑麥、蓖麻等，共34種，見表1。表中1～3號蛋白與目的蛋白的相似度高達90%以上，且4～17號蛋白的相似度均在40%以上，它們均來自于花生，而花生是羽扇豆制品中的主要組成成分，這就大大增加了花生過敏的嚴重性和普遍性。

2.3 基于Arah6線性表位的免疫交叉反應(yīng)預(yù)測結(jié)果

2.3.1 Arah6蛋白二級結(jié)構(gòu)和特性分析及其線性表位的預(yù)測結(jié)果

2.3.1.1 蛋白二級結(jié)構(gòu)和特性分析

用NPS@網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對該基因的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖1所示，對應(yīng)相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

圖1 NPS@預(yù)測Arah6二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Prediction analysis for secondary structure of Arah6 using NPS@

表2 NPS@預(yù)測Arah6二級結(jié)構(gòu)結(jié)果Table 2 Location of four secondary structural classes of Arah6 predicted using NPS@

利用Protean軟件對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)及蛋白特性再次進行預(yù)測，結(jié)果如圖2所示，對應(yīng)相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

圖2 Protean法預(yù)測的Arah6二級結(jié)構(gòu)參數(shù)及蛋白特性Fig.2 Prediction analysis for secondary structure, antigenicity, hydrophilicity,surface prodability and flexibility of Arah6 using Protean appraoch

表3 Protean法預(yù)測的Arah6二級結(jié)構(gòu)及相關(guān)預(yù)測指數(shù)的區(qū)域定位Table 3 Predicted location of four secondary structural classes and regions corresponding to 4 specific indexes of Arah6 using Protean approach

2.3.1.2 預(yù)測的Arah6線性表位

通過比較，用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器NPS@預(yù)測得到的結(jié)果與Protean軟件預(yù)測得到的結(jié)果基本相似，具有一定的可行性。當(dāng)肽段位于β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域[23-24]，且親水性＞0，抗原指數(shù)＞0，表面可及性＞1時，即預(yù)測為優(yōu)勢B細胞抗原表位[25]；且線性表位至少應(yīng)由3～5個氨基酸組成。綜合各參數(shù)可推導(dǎo)出Arah6的線性抗原表位優(yōu)勢區(qū)域為AA10～15，45～48，53～60，116～118(圖3深色方框區(qū)域)。

2.3.2 基于線性表位對比的交叉反應(yīng)預(yù)測

利用Clustal X對BLAST分析的結(jié)果進行多序列對比分析。結(jié)果顯示：與Arah6具有完全相同的線性表位的蛋白質(zhì)有4種，分別為Ara i 6、落花生conglutin、Ara d 6、conglutin 8(圖3，其余圖略)，它們與目的過敏原蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的概率為100%；蔓花生conglutin和2S protein 1擁有2個與目的蛋白完全相同的線性表位；另外，擁有1個完全相同的線性表位的蛋白有9種，分別為表1中序號為7～15的蛋白質(zhì)，它們多為不同花生亞種、羽扇豆科和大豆中的部分蛋白質(zhì)，它們在很大程度上與目的蛋白可能發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖3 線性表位(方框標示區(qū)域)對比分析Fig.3 Comparisons of linear epitopes between different proteins

2.4 基于Arah6構(gòu)象型表位的免疫交叉反應(yīng)預(yù)測結(jié)果

2.4.1 預(yù)測的Arah6構(gòu)象型表位區(qū)

利用DiscoTope網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測得Arah6的構(gòu)象型表位區(qū)有6個，用PyMOL軟件繪制出來，如圖4(彩色區(qū)域)所示，這6個表位區(qū)域在氨基酸序列中的位置分別為 AA1～13(紅色)、16～17(綠色)、35～51(藍色)、53～59(黃色)、86(紫色)、89～105(青色)。由于 AA16～17、86區(qū)域所含的氨基酸數(shù)目太少，無法構(gòu)成構(gòu)象型表位，故應(yīng)剔除。綜合考慮，Arah6的構(gòu)象型表位區(qū)只有4個。

圖4 Arah6的空間構(gòu)象(灰色區(qū)域)和構(gòu)象性表位區(qū)域(深色區(qū)域)Fig.4 Conformational epitopes on Arah6

2.4.2 基于構(gòu)象型表位對比預(yù)測交叉反應(yīng)

相同方法分別預(yù)測各蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象型表位所在區(qū)域，并用PyMOL繪圖，與目的蛋白進行對比分析。具有相同或相似的構(gòu)象，即可發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖5 不同蛋白相同/相似構(gòu)象型表位對比圖Fig.5 Conformational epitope comparison among different proteins

結(jié)果顯示：與Arah6(圖5R)具有相同的構(gòu)象型表位(青色區(qū)域)的蛋白只有4種，分別為Ara i 6、落花生 conglutin、Ara d 6、conglutin 8(圖 5A～D)，它們與目的過敏原蛋白質(zhì)發(fā)生交叉免疫反應(yīng)的概率為100%；與目的蛋白具有相似構(gòu)象型表位區(qū)域的蛋白有13種，分別為表1中序號分別為5～15(圖5E～O)、17(圖5P)和21(圖5Q)的蛋白，它們在一定程度上也可能與Arah6發(fā)生交叉反應(yīng)。

3 討 論

近年來，隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，已有許多分子生物學(xué)軟件用于蛋白質(zhì)的分析，線性表位和構(gòu)象型表位的預(yù)測則是其中主要部分。關(guān)于線性表位的預(yù)測，目前被認可有效的方法主要包括二級結(jié)構(gòu)方案、親水性方案、可及性方案、可塑性方案、抗原性方案[23,26-27]，但一般采用多種參數(shù)綜合分析的方法。研究表明，在進行抗原線性表位預(yù)測時，運用生物信息軟件和互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器，采用多種方案綜合分析可提高實驗的成功率，增強實驗的目的性[26,28]。本研究采用Protean軟件和NPS@服務(wù)器預(yù)測了Arah6的線性表位，并用ABCpred對結(jié)果進行了驗證，此法預(yù)測所得的B細胞線性表位區(qū)準確率達到73.9%。

由于已知晶體結(jié)構(gòu)的抗原-抗體復(fù)合物數(shù)量較少、抗原-抗體結(jié)合機理研究不夠清楚以及預(yù)測算法設(shè)計的困難性等方面原因，構(gòu)象型表位預(yù)測的研究一直比較緩慢，遠遠落后于線性表位預(yù)測的研究[29]。但生物信息學(xué)軟件DiscTope是目前新開發(fā)出的一種用于預(yù)測B細胞構(gòu)象型表位的Web軟件，它在95%特異度條件下，可正確識別構(gòu)象型表位中的15.5%的殘基，而普通線性表位預(yù)測方法在同等特異度條件下，只能識別約11%的殘基[22]。本研究中采用DiscTope軟件對目的蛋白進行了預(yù)測，得到了它的構(gòu)象型表位分布優(yōu)勢區(qū)域。并通過繪圖軟件PyMOL對各相關(guān)蛋白的相關(guān)區(qū)域進行對比分析，結(jié)果表明擁有相同/相似的構(gòu)象型表位優(yōu)勢區(qū)域即可與Arah6發(fā)生交叉反應(yīng)。盡管如此，該結(jié)論最好通過抗體篩選噬菌體肽庫等工作來進行實驗驗證[22]。

本研究基于生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，分別從序列同源性分析、線性表位預(yù)測對比分析、構(gòu)象型表位預(yù)測對比分析三個不同層次上對Arah6的交叉反應(yīng)進行了預(yù)測。結(jié)果顯示：Ara i 6、落花生conglutin、Ara d 6和落花生conglutin 8在序列同源性、線性表位和構(gòu)象型表位上都與Arah6有很高的相似性，它們與目的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的概率為100%；構(gòu)象型表位相似且線性表位相同的蛋白質(zhì)，如Ara d 2.01、Arah 2.01、seed storage protein SSP2、白羽扇豆conglutin delta seed storage protein等，它們在理論上也能與目的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，線性表位相同而構(gòu)象型表位不同的蛋白也可能與目的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，如羽扇豆科conglutin delta、大豆napin-type 2S albumin 1、大豆2S albumin pre-propeptide等。

總之，本實驗利用生物信息學(xué)方法，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，對花生蛋白質(zhì)過敏原Arah6的交叉反應(yīng)性進行了預(yù)測，從理論上闡述了Arah6與其他同源蛋白的免疫交叉反應(yīng)性。

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Immunologic Cross-reactivity of Peanut Allergen Arah6 on the Basis of Epitope Prediction

ZHU Pan1,2，CHEN Hong-bing1,2,*，HU Chun-qiu1,2，LI Xin1,2，LUO Chun-ping1,2,3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Q517

A

1002-6630(2010)17-0318-05

2010-06-10

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標導(dǎo)向項目(SKLF-MB-200807)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)項目([2004]234號)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-08-07-04)

朱盼(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：xingmeng903@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com