王 陶，李 文

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

正交法優(yōu)化酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵工藝

王 陶，李 文

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

以麩皮為基本原料，對黑曲霉TW012產(chǎn)酸性植酸酶的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高酸性植酸酶的產(chǎn)量。依據(jù)單因素試驗和正交試驗確定酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件為：氮源(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、pH5.0、含水量70%、30℃發(fā)酵5d，此時酸性植酸酶的酶活力可達(dá)346.576U/g干基，較優(yōu)化前提高了23.77%。

酸性植酸酶；固態(tài)發(fā)酵；工藝；正交試驗

Abstract：The production process of acidic phytase based on the use of wheat bran as fermentation substrate in solid-state fermentation byAspergillus nigerTW012 was optimized using single factor method and orthogonal array design in this study.The optimum fermentation conditions were found to be:ammonium sulfate content in medium 1.6%, medium initial pH 5.0,medium water content 70%, fermentation temperature 30 ℃, and fermentation cycle 5 days. Under these optimum conditions,the maximum acidic phytase activity in the final fermentation product reached up to 346.576 U/g dry matter, 23.77% higher than before optimization.

Key words：acidic phytase；solid-state fermentation；technology；orthogonal array design

植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解為肌醇與磷酸(磷酸鹽)的一類酶的總稱[1]。廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和飼料工業(yè)中[2-5]。它能使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，從而減少飼料中磷的添加量，降低對環(huán)境的污染[6]；它還可破壞植物性飼料或食品中植酸與礦物元素及蛋白質(zhì)的親和力，提高礦物元素生物利用率和蛋白質(zhì)的消化率，從而提高食品的營養(yǎng)價值和畜牧生產(chǎn)效益[7-10]。

植酸酶來源廣泛，包括植物、動物和微生物。由于來源于微生物的植酸酶作用范圍和穩(wěn)定性較好，易規(guī)模化生產(chǎn)，近幾年的研究大都集中在微生物來源植酸酶[11]。根據(jù)最適pH值的不同，植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶[12]，而酸性植酸酶，包括有組氨酸酸性植酸酶(H A P)、紫色酸性植酸酶(PAP)、β-螺旋植酸酶(BPP)[13]；適用于胃pH值呈酸性的單胃動物以及少數(shù)魚類如虹鱒等[14]，其酶促反應(yīng)的pH值有效作用范圍在2.5～5.5之間，能有效作用于單胃動物的消化道，并對選擇底物(如植酸) 具有高度特異活性[15]。目前，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的研究較少，還未見利用正交法優(yōu)化酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵工藝的報道?？紤]到固態(tài)發(fā)酵具有投資少、耗能低、工藝簡單和無“三廢”等優(yōu)點，研究酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵工藝，以提高植酸酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸性植酸酶產(chǎn)生菌黑曲霉TW012由徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院實驗室保存。

植酸鈉(相應(yīng)分析純補(bǔ)充純度級別) Sigma公司；鉬酸銨(分析純) 合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠；三氯乙酸(分析純) 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DL-5低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：查氏合成培養(yǎng)基：NaNO33.0 g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL；固體培養(yǎng)基：麩皮100g、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 6 %的(NH4)2SO4溶液165mL，pH 5. 2～5. 5。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

將接種后的斜面于28℃培養(yǎng)3d。

1.4.2 固體培養(yǎng)

250mL錐形瓶裝10g固體培養(yǎng)基，接入3環(huán)斜面活化后的黑曲霉孢子，28℃條件下靜置培養(yǎng)4d。

1.5 粗酶液的制備

將100mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的CaCl2溶液加入培養(yǎng)后的錐形瓶中，置于200r/min搖床上振蕩、抽提1h，過濾，取5mL濾液于4000r/min離心5min，得到植酸酶粗酶液。

1.6 單因素試驗

氮源種類對產(chǎn)酶的影響：固定其他條件，考察質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%的硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、牛肉膏對酶活力的影響，確定最佳氮源。

氮源添加量對產(chǎn)酶的影響：在最佳氮源的基礎(chǔ)上，考查其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.4%、1.0%、1.6%、2.0%、2.2%時對酶活力的影響，確定最佳氮源添加量。

培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響：固定其他條件，考查培養(yǎng)基初始pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時對酶活力的影響，確定最佳培養(yǎng)基初始p H值。

培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響：固定其他條件，考查培養(yǎng)溫度分別為24、26、28、30、32、35℃時對酶活力的影響，確定最佳培養(yǎng)溫度。

培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響：固定其他條件，考查培養(yǎng)時間分別為3、4、5、6、7d對酶活力的影響，確定最佳培養(yǎng)時間。

培養(yǎng)基含水量對產(chǎn)酶的影響：固定其他條件，考查培養(yǎng)基含水量分別為60%、66%、70%、73%、77%、80%時對酶活力的影響，確定最佳培養(yǎng)基含水量。

1.7 正交試驗

以培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間以及培養(yǎng)基含水量4個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗，確定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸性植酸酶的最佳條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.8 分析檢測

1.8.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將4.0mmol/L磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH 5.0的乙酸緩沖液配制)用乙酸緩沖液稀釋成濃度為0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，分別吸取0.2mL標(biāo)準(zhǔn)磷溶液，加入0.8mL 6.25mmol/L植酸鈉溶液，37℃保溫30min，加入 1mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，再加入1mL 硫酸亞鐵鉬酸銨顯色液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%鉬酸銨和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.7%硫酸亞鐵以體積比4:1混合)，靜置10min后在波長700nm處測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)空白為先在標(biāo)準(zhǔn)磷溶液中加入1mL 5%的TCA 使酶失活，再加入同體積的底物保溫。以無機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出直線回歸方程。

1.8.2 粗酶液中植酸酶活力的測定

0.2 mL的酶稀釋液加入0.8mL 6.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 5%的 TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入1mL硫酸亞鐵鉬酸銨顯色液，靜置10min后在波長700 nm處測定吸光度。對照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 5%的TCA使酶失活，再加入同體積的底物保溫。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力。

酶活力單位定義：以37℃、pH5.0條件下，1min從6.25mmol/L植酸鈉溶液中水解釋放lμmol無機(jī)磷所需要的酶量定義為一個酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 磷酸二氫鉀溶液濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of K2HPO4

由圖1可知，磷酸氫二鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度之間有良好的線性相關(guān)關(guān)系，回歸方程為y=0.0028x－0.0043，相關(guān)系數(shù)R=0.9989。

2.2 氮源種類對產(chǎn)酶的影響

表2 氮源種類對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響(±s)Table 2 Effect of nitrogen source type on acidic phytase production(±s)

表2 氮源種類對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響(±s)Table 2 Effect of nitrogen source type on acidic phytase production(±s)

氮源 空白 硫酸銨 硝酸鈉 硝酸銨 尿素 牛肉膏酶活力/198.330±2.211297.717±1.315251.073±2.406208.484±1.068226.875±1.542282.521±1.672(U/g)

由表2可見，在含氮量相同的條件下，硫酸銨作氮源產(chǎn)酶效果較好。這可能是由于發(fā)酵的固體基質(zhì)麩皮中有一定的含氮量，但無機(jī)氮源較易被菌體利用，使菌體快速生長，以消耗培養(yǎng)基中釋放的無機(jī)磷，解除無機(jī)磷對植酸酶活力的反饋抑制。因此，后續(xù)實驗中使用硫酸銨作氮源。

2.3 氮源添加量對產(chǎn)酶的影響

圖2 培養(yǎng)基的含氮量對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.2 Effect of medium nitrogen content on acidic phytase production

由圖2可見，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%時，植酸酶的酶活力最高。氮源添加量過低，無法保證產(chǎn)植酸酶所需的氮元素，菌體生長受限，產(chǎn)酶受影響；氮源添加量過高，反而導(dǎo)致不適的碳氮比，會抑制酶的活性，因此，氮源添加量控制在1.6%。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.3 Effect of medium initial pH on acidic phytase production

由圖3可知，產(chǎn)酶的最適初始pH值約為5.0，處于酸性植酸酶的有效作用范圍(2.5～5.5)之間，這也與此酶是酸性植酸酶是相一致的。

2.5 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on acidic phytase production

溫度通過影響細(xì)胞膜的流動性以及生物大分子的活性來影響微生物的生物活性。由圖4可見，隨著培養(yǎng)溫度的升高，所產(chǎn)植酸酶的酶活力也隨之升高，但是溫度過高，菌體生長受影響，會導(dǎo)致所產(chǎn)酶的酶活力下降，在30℃時，酶活力最高。

2.6 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

圖5 培養(yǎng)時間對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.5 Effect of fermentation time on acidic phytase production

由圖5可見，發(fā)酵前期，主要是菌體細(xì)胞在生長，到了發(fā)酵的后期，主要是產(chǎn)酶，發(fā)酵終止時間應(yīng)在酶活力最高時?？紤]到前期主要是細(xì)胞生長，從發(fā)酵第3天開始測定酸性植酸酶的酶活力，直到第7天結(jié)束，其規(guī)律顯示在第5天時達(dá)到產(chǎn)酶最高峰。

2.7 培養(yǎng)基含水量對產(chǎn)酶的影響

由于麩皮的含水量不能滿足黑曲霉TW012的生長需求，因此需要附加水分，培養(yǎng)基的含水量為60%、66%、70%、73%、77%、80%時，酶活力變化如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)基含水量對黑曲霉TW012產(chǎn)植酸酶酶活力的影響Fig.6 Effect of medium moisture content on acidic phytase production Table3 Orthogonal array layout and experimental results

由圖6可見，隨著培養(yǎng)基含水量的增加，酶活力先提高后下降，這可能是由于培養(yǎng)基含水量過低不利于菌體細(xì)胞的生長，含水量過高一方面會導(dǎo)致空氣中氧分壓降低，另一方面導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)部溶氧不足，影響菌體細(xì)胞的透氣性，也不利于菌體細(xì)胞的生長代謝。所以培養(yǎng)基含水量控制在66%左右為宜。

2.8 正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，為考查各因素之間的交互作用，選擇不同pH值、溫度、培養(yǎng)時間以及培養(yǎng)基含水量為影響因素，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗，因素水平如表2所示，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal array layout and experimental results

由表3可知，各因素對酸性植酸酶活性的影響次序為C＞A＞D＞B，即培養(yǎng)時間＞pH值＞培養(yǎng)基含水量＞溫度，其最優(yōu)方案為A1B2C2D3，即培養(yǎng)基的pH值為5.0、溫度為30℃、含水量為70%的條件下發(fā)酵5d。

將正交試驗優(yōu)選組合A1B2C2D3和試驗設(shè)計中的最優(yōu)組合A1B2C2D2分別進(jìn)行實驗，平行3次，結(jié)果為：A1B2C2D3的植酸酶平均酶活力為346.576U/g，A1B2C2D2的酶活力為336.32U/g。差異顯著性分析結(jié)果表明，兩種組合的酶活力在α=0.05水平有顯著性差異。因此，正交優(yōu)選組合為較優(yōu)工藝，即最優(yōu)的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)基含水量為70%的條件下發(fā)酵5d。

2.9 產(chǎn)酶曲線

圖7 黑曲霉TW012固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)植酸酶曲線Fig.7 Tim-course curve of acidic phytase production

在最佳發(fā)酵條件下，黑曲霉TW012產(chǎn)酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵的進(jìn)程見圖7，隨著時間的推移，酶活逐漸增大，培養(yǎng)5d時，所產(chǎn)植酸酶的酶活力最高，為346.576 U/g，較優(yōu)化前提高了23.77%，以后酶活力略有下降，有可能是隨發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)基的條件越來越不適合產(chǎn)酶。

3 結(jié) 論

通過單因素及正交試驗確定黑曲霉TW012產(chǎn)酸性植酸酶固態(tài)發(fā)酵的最適宜條件為：以麩皮為基質(zhì)，氮源(NH4)2SO4添加量1.6%，培養(yǎng)基pH5.0，含水量70%，溫度30℃，發(fā)酵時間5 d。最優(yōu)條件下，酶活力達(dá)346.576U/g。

麩皮作為一種廉價的資源，被廣泛應(yīng)用于飼料和養(yǎng)殖業(yè)中，利用黑曲霉TW012固態(tài)發(fā)酵此類物質(zhì)生產(chǎn)酸性植酸酶工藝簡單、成本低；同時可以釋放其中的磷，減少對環(huán)境的污染，具有重要意義。本實驗通過發(fā)酵條件優(yōu)化，黑曲霉TW012固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸性植酸酶的酶活力較優(yōu)化前提高了23.77%。

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Orthogonal Array Optimization of Acidic Phytase Production by Solid-state Fermentation

WANG Tao，LI Wen
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

S816.7；Q933

A

1002-6630(2010)17-0286-04

2010-06-16

國家自然科學(xué)基金項目(10605027)；徐州工程學(xué)院青年課題(XKY2009122)

王陶(1976—)，男，講師，博士，研究方向為離子束生物工程學(xué)和資源微生物學(xué)。E-mail：wangtaohf@126.com