孫瑞秋，趙婧，閆宏博，李慶章，高學軍

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

GLGI技術鑒定奶山羊乳腺中的κ-酪蛋白基因

孫瑞秋，趙婧，閆宏博，李慶章，高學軍

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

采用GLGI技術擴增本實驗室構建的Long-SAGE標簽庫中的κ-酪蛋白基因。使用SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit通過RT-PCR把奶山羊乳腺組織中的mRNA逆轉錄成cDNA,分別用3’RACE和5’RACE擴增κ-酪蛋白基因的3’端和5’端。擴增產物經TA克隆后轉化大腸桿菌，隨機挑取陽性克隆后進行測序分析。通過序列比對、拼接，獲得全長的κ-酪蛋白基因。應用GLGI技術成功獲得了完整的奶山羊乳腺CSN3序列，為CSN3結構分析和功能研究奠定了重要基礎。

GLGI，RACE，κ-酪蛋白基因

0 引言

Long-SAGE技術是一種高通量分析基因表達譜的方法，但長度僅為17 bp的標簽序列很難精確地定位到單基因。采用GLGI（generation of longer cDNA fragments from SAGE tags for gene identification)技術可將Long-SAGE標簽擴增至數百個堿基以上，較長的cDNA片段有利于基因結構分析和功能研究。

1988年Frohman等[1]發(fā)明了cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends,RACE)，其實質是長距PCR，是一種應用通用引物和特異引物從低豐度轉錄本中快速擴增已知表達序列標簽（expressed sequence tags,ESTs)5′和3′末端的簡單有效的方法。

Shekar等[2]發(fā)現κ-酪蛋白基因在哺乳動物的泌乳過程中是必不可少的[3]。CSN3基因與產奶量、乳脂率和乳蛋白量顯著相關[4]。本研究在優(yōu)化GLGI條件的基礎上，擬擴增并鑒定本實驗室構建的奶山羊泌乳期乳腺組織的相關Long-SAGE標簽庫κ-酪蛋白基因。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

冷凍離心機（Z300-K），PCR儀（LabCycler，Senso-Quest），凝膠成像系統(tǒng)（ChampGel 6000）。

1.1.2 主要試劑

SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit，LA克隆試劑盒、EX Taq酶等，TOP10感受態(tài)細胞，膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒，引物等。

1.1.3 LongSAGE標簽

17bp的LongSAGE標簽選自東北農業(yè)大學動物生物化學與分子生物學實驗室建立的奶山羊乳腺上皮細胞泌乳期的LongSAGE標簽文庫，檢索證實為高表達多重匹配標簽并符合PCR引物設計要求。

1.2 方法

（1）總RNA的提取與檢測。用Trizol法從奶山羊乳腺上皮細胞組織中提取總RNA，用甲醛變性電泳檢測總RNA。

（2）cDNA的合成與驗證。分別根據SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit逆轉錄合成3’cDNA和5’cDNA，以GAPDH作為內參照進行PCR檢測cDNA。

（3）RACE條件擴增3’端。以RT-PCR產物3’cDNA為模板，κ-酪蛋白基因的特異標簽序列（GSP）為上游引物CSN3：5’-CATGCGCAGGCTCATCAAAGA-3’。試劑盒中所含的通用引物（UPM）為下游引物。

PCR反應體系（25 μL總反應）：

PCR反應條件：

（4）DNA克隆、鑒定和測序：PCR產物回收后，將其與pMDTM18-T載體連接。將4μL的連接產物轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，并涂布于含有氨芐青霉素抗性的平板上，37℃培養(yǎng)10～16 h。隨機挑取克隆菌落后增菌，提取質粒并進行質粒PCR鑒定，鑒定后的陽性質粒送到英俊公司測序。

（5）數據分析。測序結果經BLAST檢索進行同源性分析。

（6）5’RACE引物的設計。用Primer5.0軟件，在已測出的3’端序列中設計新的5’端引物。κ-酪蛋白基因引物為CSN3:5’-TTGGTCTCAGATGCACTCGCAATCG-3’。以5’cDNA為模板，UPM為下游引物，進行PCR反應，反應體系和條件同上。挑選陽性質粒測序。

（7）序列分析。將克隆測序得到的3’端序列與5’端序列進行拼接,得到完整cDNA序列,將所得序列在NCBI進行BLAST比對,以確認該序列與其它物種該基因的同源性。另外,在DNAstar軟件上進行同源比對,并用Cluster W算法進行聚類分析得到系統(tǒng)發(fā)生樹[5]。

2 結果

2.1 總RNA檢測結果

電泳顯示28S帶亮度約是18S帶的2倍，表明RNA的完整性（圖1）。

圖1 奶山羊乳腺組織的總RNA電泳

2.2 RT-PCR檢測結果

GAPDH檢測cDNA的電泳顯示269 bp處有單一清晰的條帶（圖2），表明cDNA完整。

圖2 RT-PCR檢測結果

圖2中，1為DNA Marker DL2000，2為空白對照，3和4為GAPDH驗證3’cDNA，5和6為GAPDH驗證5’cDNA。

2.3 κ-酪蛋白基因的3’RACE和5’RACE擴增結果

3’RACE的瓊脂糖凝膠電泳圖顯示485 bp處出現一條單一的亮帶（圖3），5’RACE的電泳圖顯示672 bp處出現一條清晰的特異性條帶（圖4）。

圖33 ’RACE擴增結果

圖45 ’RACE擴增結果

ACGCGGGGGGTTCCTTACAGTTGAAAGGC CAACTGAATCTACTGCCAAGCAAGAGCTGACG GTCACAAGGAAAGGTGCAATGATGAAGAGTTT TTTCCTAGTTGTGACTATCCTGGCATTAACCC TGCCATTTTTGGGTGCCCAGGAGCAAAACCAG GAACAACCGATATGCTGTGAGAAAGATGAAAG ATTCTTCGATGACAAAATAGCCAAATATATCC CAATTCAGTATGTGCTGAGTAGGTATCCTAGT TATGGACTCAATTACTATCAACAGAGACCAGT TGCACTAATTAATAGTCAATTTCTGCCATACC CATATTATGCAAAGCCAGTTGCAGTTAGGTCA CCTGCCCAAACTCTTCAATGGCAAGTTTTGCC AAATACTGTGCCTGCCAAGTCCTGCCAAGACC AGCCAACTACCCTGGCACGTCACCCACACCCA CATTTATCATTTATGGCCATTCCACCAAAGAAA GATCAGGATAAAACAGAAATCCCTGCCATCAAT ACCATTGCTAGTGCTGAGCCTACAGTACACAGT ACACCTACCACCGAAGCAATAGTGAACACTGTA GATAATCCAGAAGCTTCCTCAGAATCGATTGCG AGTGCATCTGAGACCAACACAGCCCAAGTTACT TCAACCGAGGTCTAAAAACTCTAAGGAGACATC AAAGAAGACAACGCAGGTCTAGCTGAAACCAAA TGACTACTTCAAACTTTCCTTTGGCCAGTTGTC TGCCTTCAGTGAACAGAGAGTATGATTTTCACA GATCCAGCTCCTTTCTCATCTCCTCTTACATTT TACATTTATGCCGCATTTAGTTTTTTGATTCCT GCATAATAAAGCCAATCAAATAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

2.4 κ-酪蛋白基因的3’端序列和5’端序列拼接后的結果

經克隆測序,將所得序列進行拼接得到1條長894 bp的cDNA片段。

2.5 比對結果

mRNA序列在NCBI上進行同源比對,發(fā)現所得CSN3序列與大羚羊的κ-酪蛋白mRNA（99%）、綿羊（95%）、牛（96%）、山羊（92%）高度同源。

用DNAstar軟件將該基因序列進行同源性分析（圖5），并將該基因各物種的核苷酸序列進行多序列比對,然后作系統(tǒng)發(fā)生樹分析,發(fā)現奶山羊CSN3基因在分子進化上首先與山羊聚為一類,然后與綿羊聚在一起，最后與牛和大羚羊聚在一起(圖6)。

圖5 5個物種CSN3基因核酸序列同源性比較

圖6 Cluster W作系統(tǒng)發(fā)生樹分析

3 結果與討論

本研究利用GLGI技術[6,7]，將17 bp的SAGE標簽前面加識別的堿基位點CATG作為5’端引物，3′端使用的是單一堿基dA、dG或dC與Oligo-dT結合的錨定引物進行第1次PCR擴增，只有與SAGE標簽相匹配的序列才能退火并擴增。在第2次循環(huán)中，只有5′端OligodA的前一堿基與錨定的Oligo-dT相匹配的序列才能擴增，而單純的Oligo-dA與Oligo-dT結合的片段因處于錨定狀態(tài)則受抑制，因而最終得到的是含有SAGE標簽的長片段DNA擴增產物，產物長度為200～1 000 bp[8,9]。

GLGI可以有效地解決tag特異性不足的問題，能夠作出十分精確的全基因表達頻譜；可以用來研究基因在轉錄過程中3’端的剪切修飾問題；對于一些實驗方法不能得到的低豐度基因，若采用GLGI技術，則可以獲得大量新基因。所以GLGI不但克服了SAGE技術[10]遇到的一些問題，而且又是SAGE的一個很好的補充，這兩種方法的有機結合將是從整體水平分析基因表達的最有效的方法[11]。

SMART（switching mechanism at 5'end of the RNA transcript）技術的出現是一個新的里程碑。SMART法所需起始材料少，試驗過程快速簡單，全長比例也較高，目前已有商品化的試劑盒出售，國內大都采用這種方法構建cDNA SMART法文庫[12-16]。其原理為：擴增標簽的下游序列利用真核生物mRNA具有polyA尾巴的特性，在與其匹配的Oligo dT外側加上特定的接頭序列，逆轉錄后獲得3’端連有特地接頭的cDNA并,以其為模板，Long-SAGE標簽加CATG識別序列作為基因特異性引物（GSP）和接頭特異性引物分別為上下游引物擴增獲得標簽特異性cDNA片段。擴增標簽的上游序列利用逆轉錄酶的末端轉移酶活性，逆轉錄反應達到第一鏈cDNA的5’末端時會自動加3～5個dC，dC低溫退火后與連有特定寡核苷酸序列（接頭）的Oliogo dG配對，以其為模板，分別以與特定接頭特異性引物和標簽作為上下游引物擴增標簽的5’cDNA片段。擴增產物經TA克隆后轉化大腸桿菌，隨機挑取陽性克隆后進行測序分析，通過序列比對、拼接即可獲得較長甚至全長的cDNA片段。

降落PCR[17]是一種設計多循環(huán)以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低，從而達到最佳擴增條件的方法，反應過程中起始退火溫度高于Tm值，隨著循環(huán)的進行，退火溫度逐漸降低到Tm值，從而確保第一個引物-模板雜交事件發(fā)生在最互補的反應物之間，退火溫度最終低于Tm值。退火溫度的范圍可跨越15℃，從高于Tm（5℃）至低于Tm（10℃）左右，條件允許的話退火溫度可以1℃或0.5℃遞降。盡管退火溫度最終會降低到非特異性雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何擴增，在剩余循環(huán)中將超過任何非特異性產物的擴增量[18]。

本研究首次克隆得到奶山羊乳腺中CSN3的mRNA全長序列（894 bp）。完善了NCBI網站上公布的山羊CSN3序列，獲得了完整的CSN3序列，為CSN3結構分析和功能研究奠定了重要基礎[19，20]。

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Identification of κ-casein gene by GLGI technique in long-sAGE tags of dairy goat mammary gland

SUN Rui-qiu,ZHAO Jing,YAN Hong-bo,LI Qing-zhang,GAO Xue-jun
(The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China)

An optimized procedure of GLGI was adopted to amplify κ-casein gene sequence in Long-SAGE tags of dairy goat mammary gland.SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit was used to mRNA of dairy goat mammary gland tissue reverse transcribe to cDNA by RT-PCR.3′and 5’cDNA fragments of κ-casein gene were extended by 3’RACE and 5’RACE respectively.Products of PCR were T/A-cloned and transformed to E.coli.Positive colonies were sequenced.Total length κ-casein gene was obtained by sequence contrasting and splicing.Complete CSN3 sequence of dairy goat mammary gland were successfully identified by applying this high-throughput procedure,which established a basis for further structural and functional analysis of CSN3.

GLGI;RACE;κ-casein gene

Q93-33

A

1001-2230（2010）12-0004-04

2010-07-12

黑龍江省國際合作項目，東北農業(yè)大學創(chuàng)新團隊項目（CXT005-1-1）。

孫瑞秋(1985-)，女，碩士研究生，研究方向為泌乳生物學與乳腺生物功能調控。

李慶章