毛健，王豪，蘇米亞，王蔭榆，蔡濤

(1、食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2、光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436)

開菲爾中生物活性物質(zhì)的益生作用

毛健1，王豪2，蘇米亞2，王蔭榆2，蔡濤2

(1、食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2、光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436)

開菲爾是通過(guò)開菲爾粒中的細(xì)菌和酵母發(fā)酵形成的乳制品，具有特殊的風(fēng)味特征。在發(fā)酵過(guò)程中形成的肽和胞外多糖具有生物活性作用，體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示開菲爾具有抗癌、抗突變以及抗菌等功效。本文在綜述了開菲爾中復(fù)雜的微生物及發(fā)酵過(guò)程中所形成的多種生物活性物質(zhì)的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)了其對(duì)機(jī)體帶來(lái)的一系列顯著益生功能。

開菲爾；生物活性物質(zhì)；益生作用

0 引言

開菲爾（Kefir）是一種源自于高加索山脈、具有特殊風(fēng)味的發(fā)酵乳制品，擁有悠久的使用歷史。許多世紀(jì)以前，高加索地區(qū)牧民發(fā)現(xiàn)新鮮的山羊乳或牛乳在隨身攜帶的皮袋中會(huì)自然發(fā)酵形成一種起泡性飲料[1]，經(jīng)長(zhǎng)期使用后皮袋中會(huì)形成些許不規(guī)則顆粒，即為開菲爾粒。此后人們便直接將開菲爾粒添加到牛乳中進(jìn)行發(fā)酵。

如今，開菲爾在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，該產(chǎn)品具有爽快的酵母風(fēng)味，其中少量的乙醇和CO2賦予其特有的酒香味及殺口感，因此開菲爾被譽(yù)為發(fā)酵乳中的香檳[2]。雖然發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多種多樣的風(fēng)味物質(zhì)促成了開菲爾獨(dú)特的口味，但可能并不是所有的人都能適應(yīng)這種風(fēng)味的發(fā)酵乳。有報(bào)道稱添加果味物質(zhì)，或者優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程（如添加某些乳球菌、乳桿菌或酵母菌）可一定程度上增加開菲爾的接受度[3]。

在日常膳食中攝入開菲爾可帶來(lái)多重益生作用，據(jù)報(bào)道其擁有抑菌，免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤以及降膽固醇等作用[4-7]。開菲爾中除了包含大量的益生菌外，還含有L-乳酸，乙醛，3-羥基-2-丁酮，雙乙酰等風(fēng)味物質(zhì)[8]，且在發(fā)酵過(guò)程中，維生素B1，B12，鈣，氨基酸，葉酸和維生素K等營(yíng)養(yǎng)因子的含量都有不同程度的上升[9]。

雖然開菲爾中的CO2含量與其它飲料相比相對(duì)較低，但由于開菲爾中的酵母菌會(huì)在保質(zhì)期內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，持續(xù)產(chǎn)生的CO2易導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生脹包，因此開菲爾包裝的耐壓強(qiáng)度要求較高，且需具有一定的柔韌性，才能確保產(chǎn)品不受CO2分壓增加的影響[10，11]。

1 開菲爾中的功能性成分

功能性食品目前受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞，其中的活性成分可提供益生作用并在一定程度上增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗。益生菌食品作為最受關(guān)注的功能性食品之一，主要包含以下幾種生物活性物質(zhì)：益生菌菌體本身（包括活菌和死菌），發(fā)酵過(guò)程中形成的微生物代謝產(chǎn)物（胞外多糖、細(xì)菌素等），以及食品基質(zhì)的降解產(chǎn)物（生物活性肽等）。以下是開菲爾中三類主要的功能性成分：

1.1 益生菌

開菲爾粒（Kefir Grains,簡(jiǎn)稱KG）是生產(chǎn)開菲爾的發(fā)酵劑，不同地區(qū)的KG菌相組成是有差別的，其中包含有多種乳酸菌（乳桿菌，乳球菌，明串珠菌），醋酸菌以及酵母菌等益生菌（詳見表1和圖1）。一般來(lái)說(shuō)，KG中以乳酸菌數(shù)量和種類最多，其次是酵母菌和醋酸菌，但發(fā)酵條件的改變可能會(huì)影響到菌群的分布模式[12]。

KG中幾種同型發(fā)酵的乳桿菌，特別是馬乳酒樣乳桿菌和高加索奶乳桿菌可產(chǎn)生大量的水溶性多糖，即開菲爾多糖，具有一定的生物保健作用。酵母菌在發(fā)酵乳品的生產(chǎn)中同樣扮演著重要的角色，比如合成氨基酸和維生素等生長(zhǎng)必需因子[13]。此外，KG中的酵母可為其中細(xì)菌的生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境[11]，這取決于KG中微生物菌群間的共生關(guān)系，這種共生體系有利于維持菌種間的相互穩(wěn)定及菌株的生理功能。當(dāng)菌種間的共生平衡被打破后，菌株的生長(zhǎng)性能和生化活性都會(huì)發(fā)生降低。Garrote等[14]觀察到，通過(guò)添加開菲爾假絲酵母，有助于發(fā)揮菌株間的共生效應(yīng)，增強(qiáng)高加索奶乳桿菌在乳中的生長(zhǎng)能力。同時(shí)，有研究觀察到某些種類的酵母菌定位于開菲爾粒的表面，還有些則棲居于開菲爾粒內(nèi)部，不同位置的酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮的作用可能不同[15]。

表1 開菲爾粒/開菲爾中的菌相分布

1.2 胞外多糖

圖1 KG掃描電子顯微鏡圖（A、C：內(nèi)表面；B、D：外表面）

乳酸菌胞外多糖(LAB EPS）是指乳酸菌在其生長(zhǎng)、代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的黏液或莢膜多糖。除了可以改善產(chǎn)品的質(zhì)地如口感和黏稠度外，還具有多種潛在的生理功能。分泌EPS的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬等[16]，但是這些EPS在結(jié)構(gòu)和組成上是不同的。開菲爾多糖（Kefiran）最初是從開菲爾粒中分離得到的一種EPS，單糖組分分析顯示該多糖中D-葡萄糖和D-半乳糖的量濃度比為1∶1[17]。開菲爾多糖在冷水中溶解很慢，熱水中可迅速溶解并在2%濃度下形成黏稠狀液體，而羧甲基化開菲爾多糖的黏度比開菲爾多糖高出14倍，具有開發(fā)成食品級(jí)增稠劑的潛力[18]。有鑒于開菲爾多糖所具備的多種功能作用，很多研究者都在對(duì)其產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化，如Mitsue等將能產(chǎn)生開菲爾多糖的馬乳酒樣乳桿菌和德氏有孢球擬酵母進(jìn)行優(yōu)化復(fù)配，在50 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵7 d后，開菲爾多糖的產(chǎn)量可高達(dá)3 740 mg/L[19]。

1.3 生物活性肽

許多微生物擁有蛋白酶和肽酶，可以水解培養(yǎng)基或乳中的蛋白質(zhì)，釋放的肽和氨基酸可作為生長(zhǎng)因子維持微生物的正常代謝[20，21]。在開菲爾粒中，益生菌所分泌的蛋白酶和肽酶可將蛋白質(zhì)分解成幾段長(zhǎng)度不一的生物活性肽，具有潛在的功能作用，而且其種類和含量比普通發(fā)酵乳中更為豐富。在對(duì)土耳其開菲爾乳酸菌的研究中，Yuksekdag等發(fā)現(xiàn)21株乳球菌中有13株具有很強(qiáng)的蛋白水解能力[22]，F(xiàn)arnworth等則發(fā)現(xiàn)大部分開菲爾活性肽的分子量≤5000 ku[23]。

2 開菲爾的益生作用

在東歐，關(guān)于開菲爾益生作用的研究已有很長(zhǎng)一段歷史。開菲爾易于消化，其代謝產(chǎn)物對(duì)胃腸道疾病，代謝異常疾病，心血管疾病、免疫性疾病等均有一定的療效。據(jù)報(bào)道，開菲爾含有抑制癌細(xì)胞增殖的莢膜多糖和溶解癌細(xì)胞的四碳二羧酸，可降低癌癥的發(fā)病率。同時(shí)，開菲爾益生菌對(duì)大腸桿菌，沙門氏菌等病原菌均有強(qiáng)烈的抑制作用，經(jīng)常食用開菲爾制品可在人體胃腸道中保持有益菌群的優(yōu)勢(shì)作用。目前，針對(duì)開菲爾益生作用的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：

2.1 刺激免疫系統(tǒng)

免疫調(diào)節(jié)作用可能是益生菌所發(fā)揮的多種功能性作用中較為常見的一種益生機(jī)制，這不僅與其菌體本身有直接聯(lián)系，還與發(fā)酵過(guò)程或消化過(guò)程中所形成的活性物質(zhì)有關(guān)，如某些寡肽表現(xiàn)出多種生理功能活性，其中就包括免疫系統(tǒng)刺激作用[24]。

Thoreux等[25]采用開菲爾飼喂6月齡的幼鼠，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)黏膜免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)；與對(duì)照組相比，霍亂毒素特異性IgA抗體的產(chǎn)生水平也明顯提高。Thoreux等認(rèn)為開菲爾對(duì)黏膜免疫系統(tǒng)有輔助調(diào)節(jié)作用，這可能來(lái)源于開菲爾中益生菌的細(xì)胞壁組分。

KG中的EPS也可能表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)功能。Murofushi等[26]從開菲爾粗多糖中純化制備出一種水溶性多糖來(lái)喂養(yǎng)小鼠，觀察到小鼠腫瘤增生速率顯著下降，研究稱這與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)有關(guān)，且多糖的使用劑量直接決定了免疫調(diào)節(jié)效果。此外，F(xiàn)urukawa等[27]也發(fā)現(xiàn)KG中一種水溶性多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，研究顯示，該多糖與荷瘤小鼠腸淋巴結(jié)細(xì)胞（PP Cell）共培養(yǎng)的混合物上清可促進(jìn)正常小鼠脾細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)脾細(xì)胞中脂多糖（LPS）和植物血球凝集素P（PHAP）的有絲分裂活性。他們認(rèn)為開菲爾多糖可通過(guò)刺激PP細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌水溶性免疫因子，提高正常小鼠中胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞的有絲分裂響應(yīng)水平，該EPS對(duì)免疫系統(tǒng)的效果取決于宿主本身的健康程度。

先天性免疫可保護(hù)機(jī)體組織和循環(huán)系統(tǒng)免受病原體侵害，是免疫反應(yīng)中的第一條防御線，其中巨噬細(xì)胞在治療感染的過(guò)程中起著重要作用。開菲爾可調(diào)節(jié)小鼠的免疫應(yīng)答，增加腸道和支氣管黏膜的IgA+細(xì)胞數(shù)，同時(shí)增強(qiáng)腹膜和肺部巨噬細(xì)胞的吞噬活性[28-29]。Gabriel Vinderola等[30]通過(guò)研究先天性免疫細(xì)胞（腹膜巨噬細(xì)胞和派伊爾結(jié)黏附細(xì)胞）所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，評(píng)價(jià)了開菲爾中兩部分功能物質(zhì)（F1：開菲爾菌體；F2：開菲爾發(fā)酵上清）的免疫調(diào)節(jié)能力。實(shí)驗(yàn)中連續(xù)喂食小鼠F1或F2七天后，可上調(diào)腹膜巨噬細(xì)胞中TNFα及IL-6的產(chǎn)生水平，派伊爾結(jié)細(xì)胞因子如IL-1α、IL-6、IL-10等也都得到促進(jìn)。此外，與F1相比，F(xiàn)2可誘導(dǎo)并顯著增加派伊爾結(jié)黏附細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞的所占比例。研究結(jié)果稱，F(xiàn)1和F2在體內(nèi)可作為生物治療物質(zhì)發(fā)揮作用，能刺激先天性免疫系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞增殖，下調(diào)Th2型免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫響應(yīng)，同時(shí)減少胞內(nèi)病原體所引起的感染。

開菲爾還具有抗過(guò)敏和抗炎癥效果，對(duì)過(guò)敏性支氣管哮喘的治療具有潛在療效。Lee MY等[31]采用卵清蛋白(OVA)致敏、激發(fā)大鼠產(chǎn)生氣道炎癥和氣道重塑，建立哮喘動(dòng)物模型來(lái)研究開菲爾的藥理學(xué)作用。在使用卵清蛋白激發(fā)大鼠之前，預(yù)先對(duì)大鼠胃部注射開菲爾（50 mg/kg）并作用1 h，發(fā)現(xiàn)開菲爾可顯著抑制由卵清蛋白所誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)（AHR）；此外，胃部?jī)?nèi)注射開菲爾還可明顯抑制炎癥細(xì)胞總數(shù)的增加，肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞的增加也受到抑制。肺泡灌洗液中Th2型細(xì)胞因子，諸如IL-4、IL-13，總免疫球蛋白E也降低到了正常水平。組織學(xué)研究顯示，開菲爾除了可顯著阻遏肺部嗜酸粒細(xì)胞增多，還對(duì)氣道中桿狀細(xì)胞黏液的高分泌具有抑制作用。

2.2 抑制腫瘤增生

Shiomi等首次報(bào)道了KG中的一種水溶性多糖（分子量約為1 000 ku）具有抗腫瘤作用[32]，研究顯示口服或腹腔注射該多糖后，小鼠體內(nèi)艾氏癌細(xì)胞的擴(kuò)散及惡性毒瘤-180的增生得到了有效抑制。Murofushi等[26]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，開菲爾多糖與兩種癌細(xì)胞系共育42 h后，細(xì)胞毒性明顯降低；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，該水溶性多糖經(jīng)口服后可到達(dá)小鼠的脾臟和胸腺中，通過(guò)T細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)基于胸腺依賴性和非胸腺依賴性的抗原響應(yīng)，增強(qiáng)免疫活性。

開菲爾多糖還可顯著抑制Lewis肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且即便在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移后，通過(guò)服用大劑量的KG多糖仍可達(dá)到抗腫瘤效果[33]。除水溶性多糖外，一種含KG菌群的非水溶性多糖也可顯著抑制高移植性B16黑素瘤的轉(zhuǎn)移[34]，研究稱水溶性多糖是通過(guò)刺激腸道相關(guān)淋巴組織分泌淋巴因子激活巨噬細(xì)胞，從而抑制腫瘤增生；而含有開菲爾菌體的非水溶性多糖則是通過(guò)增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活性來(lái)發(fā)揮作用。

Furukawa等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠接種Lewis肺癌腫瘤后，采用插管法喂食開菲爾（2 g/kg體重）9 d，要比普通酸奶更能有效抑制腫瘤增生。雖然平均存活時(shí)間沒有變化，但是服用開菲爾的荷瘤小鼠與未服用開菲爾的荷瘤小鼠相比，其遲發(fā)型超敏反應(yīng)得到了有效改善[6]。此外，小鼠服食開菲爾（100～500 mg/kg體重）后還可抑制艾氏腹水癌細(xì)胞的增殖[35]，Cevikbas等[36]則發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠腹腔注射開菲爾濾液（經(jīng)過(guò)濾除去KG）后，可殺滅或抑制由7,12-二甲基苯并蒽誘導(dǎo)的梭形細(xì)胞肉瘤增生。

Hosono等[37]從蒙古開菲爾中分離出了鏈球菌、乳桿菌和明串珠菌，體外實(shí)驗(yàn)顯示這些菌株可與氨基酸熱解產(chǎn)物牢固結(jié)合，而氨基酸熱解產(chǎn)物是一種普遍存在于食品中的潛在誘變劑。Miyamoto等[38]同樣也報(bào)道了3株于德國(guó)開菲爾中分離到的產(chǎn)黏乳鏈球菌乳脂亞種具有顯著的去致突變效應(yīng)，能與某些已知的誘變劑牢固結(jié)合。Yoon等[39]采用經(jīng)典的致癌物質(zhì)篩選法-艾姆斯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離自開菲爾中的乳桿菌對(duì)誘變劑2-硝基芴有很強(qiáng)的抗突變能力。Liu等[40]也評(píng)估了開菲爾發(fā)酵牛奶及發(fā)酵豆奶的抗突變能力，發(fā)現(xiàn)其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌中的各種誘變劑如亞硝基胍、4-硝基喹啉所誘導(dǎo)的突變具有很強(qiáng)的抑制能力。

此外，Liu等[41]還研究了KG發(fā)酵牛奶和發(fā)酵豆奶對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤增生的影響，在飼喂開始前先對(duì)小鼠注射0.2×108的肉瘤180細(xì)胞，而后持續(xù)30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)束后將腫瘤取出并稱重。與對(duì)照組相比，開菲爾豆奶和開菲爾牛奶均能顯著抑制體內(nèi)腫瘤增生，而喂食未發(fā)酵豆奶的小鼠體內(nèi)腫瘤體積沒有減小。腫瘤顯微觀察顯示，腫瘤細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致腫瘤增生速度下降的直接原因。Liu等認(rèn)為開菲爾中益生菌本身或發(fā)酵過(guò)程中形成的胞外多糖可誘導(dǎo)抗瘤免疫響應(yīng)的發(fā)生。Genistein（酪氨酸蛋白激酶抑制劑）對(duì)腫瘤有抑制作用，但在該研究中并未發(fā)現(xiàn)genistein水平有任何變化。

Guven等[42]認(rèn)為開菲爾還可選擇性保護(hù)機(jī)體組織器官，他們發(fā)現(xiàn)灌胃開菲爾的小鼠與四氯化碳（一種可誘導(dǎo)氧化損傷的肝毒素）接觸后，其肝臟和腎臟中丙二醛含量顯著降低，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性，且抗氧化效果要強(qiáng)于維生素E，能有效保護(hù)機(jī)體免遭氧化損傷。Liu等[40]也發(fā)現(xiàn)開菲爾發(fā)酵乳，包括發(fā)酵牛乳及發(fā)酵豆乳均可顯著增強(qiáng)DPPH自由基的清除能力，并可抑制亞油酸的過(guò)氧化，具備很強(qiáng)的還原能力。

2.3 緩解乳糖不耐癥

國(guó)內(nèi)有較大部分人群由于缺乏β-半乳糖苷酶（或乳糖酶），導(dǎo)致不能有效消化乳糖。然而有研究顯示，乳糖消化不良者可以飲用含大量益生活菌的酸奶。酸奶的緩沖體系可維持其中益生菌的細(xì)胞活性及其細(xì)胞壁完整性。因此，酸奶菌種（尤其是嗜酸乳桿菌）中β-半乳糖苷酶的活性在從胃部到上胃腸道的傳輸過(guò)程中可得到有效保護(hù)[43]。與純牛乳相比，發(fā)酵乳在胃腸道中的運(yùn)輸時(shí)間更短，可減少乳糖不耐癥的發(fā)生幾率[44]。

Hertzler等[45]采用含6株乳酸菌和1株酵母菌的商用發(fā)酵劑生產(chǎn)的開菲爾可以有效降低成年乳糖消化不良患者的氫氣呼出量，同時(shí)腹部脹氣現(xiàn)象也得到明顯改善。De Vrese等[46]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，與服食熱滅活的開菲爾相比，服食含有活性KG的開菲爾后，豬血清半乳糖濃度明顯上升；且添加了開菲爾的食物中β-半乳糖苷酶活性為4.4 U/L，可有效水解腸道中的乳糖，促進(jìn)乳糖吸收。

2.4 抗菌作用

乳酸菌可產(chǎn)生廣譜的抗菌物質(zhì)，包括有機(jī)酸（乳酸和乙酸）、二氧化碳、過(guò)氧化氫、乙醇、雙乙酰和抗菌肽等（細(xì)菌素），它們不僅能減少食源性致病菌和污染菌所引發(fā)的疾病，而且可預(yù)防并治療胃腸道功能紊亂和陰道感染[47，48]。

Garrote等[49]檢測(cè)了KG發(fā)酵乳上清對(duì)G-菌和G+菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)G+菌更易受到開菲爾上清的抑制，該上清中含有大量的乳酸和乙酸；當(dāng)往牛乳中添加與開菲爾上清中相同濃度的乳酸和乙酸后，會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，有鑒于此，他們認(rèn)為開菲爾發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸有明顯的抑菌作用，即使在發(fā)酵早期作用同樣明顯。

KG雖然可以抑制金黃色葡萄球菌，克雷伯氏肺炎桿菌以及大腸桿菌的生長(zhǎng)，但不會(huì)抑制酵母菌如白假絲酵母和釀酒酵母的生長(zhǎng)。分離自KG中的植物乳桿菌和腸膜明串珠菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可抑制G+和G-菌，該細(xì)菌素分子量約為1 000 ku，具有熱穩(wěn)定性，對(duì)蛋白水解酶敏感。Santos等研究顯示[50]，分離自KG中的乳桿菌對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、福氏志賀菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌都表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這可能也與乳酸菌所產(chǎn)的細(xì)菌素有關(guān)。

過(guò)氧化氫是菌體代謝產(chǎn)生的另一種抗菌物質(zhì)。Yuksekdag等研究指出[51]，從土耳其開菲爾中分離出的21株乳酸菌可產(chǎn)生0.04～0.19 μg/mL的過(guò)氧化氫；此外，他們還報(bào)道有21株開菲爾來(lái)源的乳球菌也可產(chǎn)生過(guò)氧化氫，所有的乳球菌均可有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，但是對(duì)大腸桿菌NRLL B-704和銅綠假單胞菌的抑制效果較差[22]。

2.5 調(diào)節(jié)胃腸道功能

益生菌的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中有一個(gè)很重要的指標(biāo)，那就是對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受性，主要指對(duì)胃部極端pH環(huán)境、膽鹽和消化酶作用的抵抗力。益生菌只有具備較強(qiáng)的抗逆性能力，才能順利到達(dá)小腸，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，黏附并定殖于腸上皮細(xì)胞，產(chǎn)生特殊的抑制或易位效果來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。

開菲爾可緩沖消化過(guò)程中胃部的低pH值，為其中益生菌在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中提供保護(hù)作用。Santos等[50]從不同來(lái)源的KG中分離出副干酪乳桿菌，植物乳桿菌，德氏乳桿菌，嗜酸乳桿菌和馬乳酒樣乳桿菌等58株乳桿菌，發(fā)現(xiàn)所有菌株均能在pH2.5的MRS培養(yǎng)基中存活4 h，但并不能生長(zhǎng)繁殖；有85%的菌株對(duì)0.3%的膽鹽表現(xiàn)出耐受性，但是生長(zhǎng)緩慢。

通過(guò)對(duì)人體糞便樣品進(jìn)行分析，可以研究膳食對(duì)人體腸道微生物菌群的影響。Marquina等[52]采用開菲爾連續(xù)喂食小鼠7個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)小鼠的小腸和大腸中的乳酸菌數(shù)目明顯增加。鏈球菌數(shù)增加了1個(gè)數(shù)量級(jí)，而亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)則降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。

盡管有很多研究證實(shí)了開菲爾對(duì)宿主腸道微生物菌群的影響，但是很少有研究分析開菲爾對(duì)腸道酶系的影響。Elena Urdaneta等[53]將雌性小鼠分成兩組，一組采用標(biāo)準(zhǔn)膳食喂食，另一組則采用添加了開菲爾的膳食喂養(yǎng)，連續(xù)22 d，每日記錄食物的攝取量以及體重指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定血清中的葡萄糖，尿酸，膽固醇，甘油三酸酯以及堿性磷酸酶含量。腸道酶分析顯示，服食開菲爾膳食的小鼠小腸刷狀緣膜囊中的氨肽酶N活性顯著增強(qiáng)，且血糖過(guò)多癥狀也得到了改善，表明開菲爾可改善蛋白質(zhì)消化水平并有效降低體內(nèi)高血糖水平。

2.6 降膽固醇作用

已有大量文獻(xiàn)證明益生菌發(fā)酵乳可加速膽固醇代謝，并且這種益生作用較常規(guī)的臨床藥物更為溫和。關(guān)于益生菌降膽固醇的作用機(jī)理有幾種假設(shè)，如細(xì)胞同化或結(jié)合膽固醇、產(chǎn)生膽鹽水解酶釋放出游離膽酸并與膽固醇發(fā)生共沉淀等。

Vujicic等研究表明[54]，源自塞爾維亞、匈牙利和高加索區(qū)域的KG可同化牛乳中的膽固醇，在20℃下發(fā)酵24 h后可降低基質(zhì)中62%的膽固醇，在10℃下貯藏48 h后膽固醇降低率增至84%。他們認(rèn)為KG的降膽固醇能力可能來(lái)源于其特有的膽固醇降解酶系。此外，在一項(xiàng)以安慰劑為對(duì)照組設(shè)計(jì)的雙盲臨床試驗(yàn)中，13人每日服食開菲爾并持續(xù)4周（500 mL/天）后，血清甘油三酸酯含量相對(duì)于基線水平有所降低，而血清高密度脂蛋白（HDL）含量與基線相比有一定程度增加，低密度脂蛋白（LDL）/HDL比率下降[55]。

3 結(jié)論

開菲爾菌相分析顯示，開菲爾中含有比普通酸奶更為復(fù)雜的益生菌。KG中的細(xì)菌和酵母菌錯(cuò)綜交結(jié)，且由于共生關(guān)系的存在，導(dǎo)致單一菌株的分離鑒定難度增大，目前大部分開菲爾菌種是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)鑒定的。不同來(lái)源的KG所生產(chǎn)的開菲爾從菌相到功能性方面可能都不完全一致，這也為開菲爾的深入研究帶來(lái)一定困難。

開菲爾的制備取決于KG中微生物菌群的協(xié)同增效作用。在發(fā)酵過(guò)程中，KG中的乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等微生物會(huì)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)和多糖等功能性成分，賦予開菲爾特殊的風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)。在發(fā)酵后，開菲爾中含有較多的生物活性物質(zhì)，開菲爾多糖是其中的研究焦點(diǎn)。開菲爾中多數(shù)益生菌含有特異性蛋白酶，可水解酪蛋白或乳清蛋白從而釋放大量的生物活性肽，不僅可改善消化系統(tǒng)，還可促進(jìn)人體的代謝功能和免疫功能。

[1] DUITSCHAEVER C L,KEMP N,EMMONS D.Pure Culture Formulation and Procedure for the Production of Kefir[J].Milchwissenschaft,1987,42(2):80-82.

[2] BESHKOVA D M,SIMOVA E D,FRENGOVA G I,et al.Production of Volatile Aroma Compounds by Kefir Starter Cultures[J].International Dairy Journal,2003,13(7):529-535.

[3] MUIR D D,TAMIME A Y,WSZOLEK M.Comparison of the Sensory Pro?les of Kefir,Buttermilk and Yoghurt[J].International Journal of Dairy Technology,1999,52(4):129-134.

[4] ZACCONI C,PARISI M G,SARRA P G,et al.Competitive Exclusion of Salmonella kedougou in Kefir Fed Chicks[J].Microbiology Aliment-Nutrition,1995,12(4):387-390.

[5] FURUKAWA N,MATSUOKA A,YAMANAKA Y.Effects of Orally Administered Yogurt and Ke?r on Tumor Growth in Mice[J].Journal of Japanese Society of Nutrition and Food Science,1990,43:450-453.

[6] FURUKAWA N,MATSUOKA A,TAKAHASHI T,et al.Effects of Fermented Milk on the Delayed-type Hypersensitivity Response and Survival Day in Mice Bearing Meth-A[J].Animal Science and Technology,1991,62:579-585.

[7] TAMAI Y,YOSHIMITSU N,WATANABE Y,et al.Effects of Milk Fermented by Culturing with Various Lactic Acid Bacteria and a Yeast on Serum Cholesterol Level in Rats[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1996,81(2):181-182.

[8] GUZEL-SEYDIM Z B,SEYDIM A C,GRENEE A K,et al.Determination of Organic Acids and Volatile Flavor Substances in Ke?r during Fermentation[J].Journal Food Composition and Analysis,2000,13(1):35-43.

[9] OTLES S,CADINGI O.KEFIR:A Probiotic Dairy-composition,Nutritional and Therapeutic Aspects[J].Pakistan Journal of Nutrition,2003,2(2):54-59.

[10] BESHKOVA D M,SIMOVA E D,SIMOV Z I,et al.Pure Cultures for Making Kefir[J].Food Microbiology,2002,19(5):537-544.

[11] SIMOVA E,BESHKOVA D,ANGELOV A,et al.Lactic Acid Bacteria and Yeasts in Kefir Grains and Kefir Made From Them[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2002,28(1):1-6.

[12] GARROTE G L,ABRAHAM A G,DE ANTONI G L.Chemical and Microbiological Characterisation of Kefir Grains[J].Journal of Dairy Research,2001,68(4):639-652.

[13] VILJOEN B C.The Interaction Between Yeasts and Bacteria in Dairy Environments[J].International Journal of Food Microbiology,2001,69(1-2):37-44.

[14] GARROTE G L,DELFEDERICO L,BIBILONI R,et al.Lactobacilli Isolated from Kefir Grains:Evidence of the Presence of S-layer Proteins[J].Journal of Dairy Research,2004,71(2):222-230.

[15] WYDER M T,SPILLMANN H,MEILE L,et al.Investigation of the Yeast Flora in Dairy Products:a Case Study of Kefir[J].Food Technology and Biotechnology,1997,35(4):299-304.

[16] RUAS-MADIEDO P,HUGENHOLTZ J,ZOON P.An Overview of the Functionality of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria[J].International Dairy Journal,2002,12(2-3):163-171.

[17] MICHELI L,UCCELLETTI D,PALLESCHI C,et al.Isolation and Characterisation of a Ropy Lactobacillus Strain Producing the Exopolysaccharide Kefiran[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1999,53(1):69-74.

[18] MUKAI T,TOBA T,ITOH T,et al.Carboxylmethyl Kefiran:Preparation and Viscometric Properties[J].Journal of Food Science,1990,55(5):1483-1484.

[19] MITSUE T,TACHIBANA K,FUJIO Y.Efficient Kefiran Production by a Mixed Culture of Lactobacillus kefiranofaciens KF-75 and Yeast Strains[J].Seibutsu-kogaku,1999,77(3):99-103.

[20] THOMAS T D,PRITCHARD G G.Proteolytic Enzymes of Dairy Starter Cultures[J].FEMS Microbiology Reviews,1987,46(3):245-268.

[21] MATAR C,AMIOT J,SAVOIE L,et al.The Effect of Milk Fermentation by Lactobacillus helveticus on the Release of Peptides during in Vitro Digestion[J].Journal of Dairy Science,1996,79(6):971-979.

[22] YUKSEKGAG Z N,BEYATLI Y,ASLIM B.Determination of Some Characteristics Coccoid Forms of Lactic Acid Bacteria Isolated from Turkish Kefirs with Natural Probiotic[J].LWT-Food Science and Technology,2004,37(6):663-667.

[23] FARNWORTH E R.The Evidence to Support Health Claims for Probiotics[J].Journal of Nutrition,2008,138(6):1250-1254.

[24] LEBLANC J G,MATAR C,VALDEZ J C,et al.Immunomodulating Effects of Peptidic Fractions Issued from Milks Fermented with Lactobacillus helveticus[J].Journal of Dairy Science,2002,85(11):2733-2742.

[25] THOREUX K,SCHMUCKER D L.Kefir Milk Enhances Intestinal Immunity in Young but not Old Rats[J].Journal of Nutrition,2001,131(3):807-812.

[26] MUROFUSHI M,MIZUGUCHI J,AIBARA K,et al.Immunopotentiative Effect of Polysaccharide from Kefir Grain,KGF-C,Administered Orally in Mice[J].Immunopharmacology,1986,12(1):29-35.

[27] FURUKAWA N,IIYAMA R,TAKAHASHI T,et al.Effect of Oral Administration of Water Soluble Fraction from Kefir Grain on Antibody Production in Mice[J].Animal Science Technology,1992,63(4):428-436.

[28]VINDEROLA C G,DUARTE J,THANGAVEL D,et al.Immunomodulating Capacity of Kefir[J].Journal of Dairy Research,2005,72(2):195–202.

[29] VINDEROLA C G,DUARTE J,THANGAVEL D,et al.Distal Mucosal Site Stimulation by Kefir and Duration of the Immune Response[J].European Journal of Inflammation,2005,3:63–73.

[30] VINDEROLA G,PERDIGON G,DUARTE J,et al.Effects of Ke?r Fractions on Innate Immunity[J].Immunobiology,2006,211(3):149–156.

[31] LEE M Y,AHN K S,KWON O K,et al.Anti-in?ammatory and Anti-allergic Effects of Kefir in a Mouse Asthma Model[J].Immunobiology,2007,212(8):647–654.

[32] SHIOMI M,SASAKI K,MUROFUSHI M,et al.Antitumor Activity in Mice of Orally Administered Polysaccharide from Kefir Grain[J].Japanese Journal of Medical Science and Biology,1982,35(2):75-80.

[33] MUROFUSHI M,SHIOMI M,AIBARA K.Effect of Orally Administered Polysaccharide from Kefir Grain on Delayed-type Hypersensitivity and Tumor Growth in Mice[J].Japanese Journal of Medical Science and Biology,1983,36(1):49-53.

[34] FURUKAWA N,MATSUOKA A,TAKAHASHI T,et al.Antimetastatic Effect of Kefir Grain Components on Lewis lung Carcinoma and Highly Metastatic B16 Melanoma in Mice[J].Journal of A-griculture Science Tokyo Nogyo Daigaku,2000,45(1):62-70.

[35] KUBO M,ODANI T,NAKAMURA S,et al.Pharmacological Study on Kefir-a Fermented Milk Product in Caucasus on Antitumor Activity[J].Yakugaku Zasshi,1992,112:489-495.

[36] CEVIKBAS A,YEMNI E,EZZEDENN F W,et al.Antitumoural Antibacterial and Antifungal Activities of Kefir and Kefir Grain[J].Phytotherapy Research,1992,8(2):78-82.

[37] HOSONO A,TANABE T,OTANI H.Binding Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kefir Milk with Mutagenic Amino Acid Pyrolyzates[J].Milchwissenschaft,1990,45(10):647-651.

[38] MIYAMOTO T,MORITA H,NISHIOKA K,et al.Constituent Species of Lactic Acid Bacteria from Kefir and Their Desmutagenic Properties[J].Japanese Journal of Dairy and Food Science,1991,40:111-112.

[39] YOON Y H,CHO J K,BAEK Y J,et al.Antimutagenic Activity of Lactobacillus spp.Isolated from Kefir and Yoghurt and Non-starter Strains[J].Korean Journal of Animal Science,1999,41(1):39-44.

[40] LIU J R,CHEN M J,LIN C W.Antimutagenic and Antioxidant Properties of Milk-Kefir and Soymilk-Kefir[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(7):2467-2474.

[41] LIU J R,WANG S Y,LIN Y Y,et al.Antitumor Activity of Milk Kefir and Soy Milk Kefir inTumor-bearing Mice[J].Nutrition and Cancer,2002,44(2):182-187.

[42] GUVEN A,GUVEN A,GULMEZ M.The Effect of Kefir on the Activities of GSH-Px,GST,CAT,GSH and LPO levels in Carbon Tetrachloride-induced Mice Tissues[J].Journal of Veterinary Medicine B,2003,50(8):412-416.

[43] DE VRESE M,STEGELMANN A,RICHTER B,et al.Probioticscompensation for Lactase Insufficiency[J].American Journal of Clinical Nutrition,2001,73(2,Suppl.):421-429.

[44] LABAYEN I,FORGA L,GONZALEZ A,et al.Relationship between Lactose Digestion,Gastrointestinal Transit Time and Symptoms in Lactose Malabsorbers after Dairy Consumption[J].Alimentary Pharmacology and Therapeutics,2001,15(4):543-549.

[45] HERTZLER S R,CLANCY S M.Kefir Improves Lactose Digestion and Tolerance in Adults with Lactose Maldigestion[J].Journal of the American Dietetic Association,2003,103(5):582-587.

[46] DE VRESE M,KELLER B,BARTH C A.Enhancement of Intestinal Hydrolysis of Lactose by Microbial β-galactosidase(EC 3.2.1.23)of kefir[J].British Journal of Nutrition,1992,67(1):67-75.

[47] MESSENS W,DE VUYST L.Inhibitory Substances Produced by Lactobacilli Isolated from Sourdoughs-a Review[J].International Journal of Food Microbiology,2002,72(1-2):31-43.

[48] JAMUNA M,JEEVARATNAM K.Isolation and Characterization of Lactobacilli from some Traditional Fermented Foods and Evaluation of the Bacteriocin[J].Journal of General and Applied Microbiology,2004,50(2):79-90.

[49] GARROTE G L,ABRAHAM A G,D E ANTONI G L.Inhibitory Power of Kefir:the Role of Organic Acids[J].Journal of Food Protection,2000,63(3):364-369.

[50] SANTOS A,SAN MAURO M,SANCHEZ A,et al.The Antimicrobial Properties of Different Strains of Lactobacillus spp.Isolated from Ke?r[J].Systematic and Applied Microbiology,2003,26(3):434-437.

[51] YUKSEKDAG Z N,BEYATH Y,ASLIM B.Metabolic Activities of Lactobacillus spp.Strains Isolated from Kefir[J].Nahrung,2004,48(3):218-220.

[52] MARQUINA D,SANTOS A,CORPAS I,et al.Dietary In?uence of Kefir on Microbial Activities in the Mouse Bowel[J].Letters in Applied Microbiology,2002,35(2):136-140.

[53] ELENA URDANETA,JAIONEBARRENETXE,PATRICIA ARANGUREN,et al.Intestinal Beneficial Effects of Kefir-supplemented Diet in Rats[J].Nutrition Research,2007,27(10):653–658.

[54] VUJICIC I F,VULIC M,KONYVES T.Assimilation of Cholesterol in Milk by Kefir Cultures[J].Biotechnology Letters,1992,14(9):847-850.

[55] KIESSLING G,SCHNEIDER J,JAHREIS G.Long-term Consumption of Fermented Dairy Products Over 6 Months Increases HDL Cholesterol[J].European Journal of Clinical Nutrition,2002,56(9):843-849.

Study on probiotic effect originated from bioactive ingredients in kefir

MAO Jian1，WANG Hao2，SU Mi-Ya2，WANG，Yin-Yu2，CAI Tao2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;2.China State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Technology Center Bright Dairy&Food Co.,Ltd,Shanghai 200436,China)

Kefir is a dairy product fermented by live bacteria and yeasts contained in kefir grains,and is reported to have a unique taste and unique properties.During fermentation,peptides and exopolysaccharides are formed that have been shown to have bioactive properties.Moreover,in vitro and animal trials have shown kefir have anticarcinogenic,antimutagenic,antiviral and antimicrobial properties.The aim of this article is to evaluate a long list of significant probiotic function of kefir,which is on the basis of complex microorganisms and the variety of possible bioactive compounds formed during fermentation.

kefir,bioactive ingredients,probiotic effect

TS935,Q936

B

1001-2230（2010）12-0030-06

2010-08-09

毛?。?970-），男，副教授，從事食品發(fā)酵技術(shù)方面的研究。

王蔭榆