孫卓，呂加平，張佳程，孔凡丕，李紅娟

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山東青島266109）

乳酸菌自溶對(duì)切達(dá)干酪成熟中蛋白質(zhì)分解的影響

孫卓1，2，呂加平1，張佳程2，孔凡丕1，李紅娟1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山東青島266109）

選取自溶度不同的乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑混合商業(yè)發(fā)酵劑制作切達(dá)干酪，研究了乳酸菌自溶對(duì)干酪成熟的影響。測(cè)定成熟期間各干酪中乳酸菌活菌數(shù)、pH值、pH4.6可溶氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和12%TCA可溶氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并結(jié)合SDS-PAGE分析干酪蛋白質(zhì)的水解情況。結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組干酪的12%TCA可溶性氮含量隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在1個(gè)月后不同組別之間差異顯著（P＜0.05）。與對(duì)照組干酪相比，加入高自溶度菌株的實(shí)驗(yàn)組干酪蛋白分解程度較高，非蛋白氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.00%。同時(shí)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，各干酪的蛋白質(zhì)都有一定程度的分解，產(chǎn)物略有不同，乳酸菌自溶可以加速蛋白質(zhì)分解。

自溶；附屬發(fā)酵劑；蛋白質(zhì)分解

0 引言

細(xì)菌自溶是指菌體細(xì)胞在一定的條件，自身釋放可水解細(xì)胞壁肽聚糖網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的自溶酶，這些酶的表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)菌細(xì)胞壁質(zhì)的溶解和消失，形成一個(gè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)向周圍環(huán)境釋放的過程[1]。Law[2]研究表明在未成熟干酪中發(fā)酵劑自溶速率和自溶度與蛋白水解呈正相關(guān)，且對(duì)切達(dá)干酪的風(fēng)味形成有積極作用，蛋白分解產(chǎn)生的小肽及氨基酸混合物將直接影響干酪的味道和口感。

為了加速干酪成熟以及提高風(fēng)味，已有許多將乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑加入到切達(dá)干酪中的報(bào)道，如Hannon等人將快速自溶的瑞士乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑添加制作切達(dá)干酪，可以加速干酪成熟且切達(dá)干酪風(fēng)味強(qiáng)烈[3-6]。本研究將干酪乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑添加制作切達(dá)干酪，研究其對(duì)干酪成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

原料乳（新鮮無(wú)抗牛乳），直投式發(fā)酵R-704，供式菌株LB1，LB2，S1，5-2（本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備菌株，經(jīng)APIR標(biāo)準(zhǔn)微生物生化系統(tǒng)鑒定，均為副干酪乳桿菌），凝乳酶。

GE中低分子量蛋白marker，考馬斯亮藍(lán)G-250，甘油，Tris，SDS，β-巰基乙醇，TEMED，丙烯酰胺，雙叉丙烯酰胺均為分析純。EPS301電泳儀、Mini VE電泳槽、Alpha凝膠成像系統(tǒng)、FOSS2300自動(dòng)凱氏定氮儀、Delta 320 pH，干酪槽等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及發(fā)酵劑的制備

菌種活化：將3株菌LB1，LB2，S1,5-2按2%的接種于質(zhì)量濃度為100 g/L脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至凝乳?；罨瘍纱糜?℃冰箱冷藏備用。

干酪按照添加發(fā)酵劑不同編號(hào)為A(只含R704)；B(含R704+LB1，高自溶度）；C（含有R704+LB2，中自溶度）；D（含有R704+S1,5-2，低自溶度）；其中R704的添加量為1 U/10L，附屬發(fā)酵劑的添加量為1%。

1.2.2 切達(dá)干酪的生產(chǎn)工藝

原料乳→巴氏滅菌→冷卻至32℃，添加發(fā)酵劑添加氯化鈣→添加凝乳酶→切割、升溫?cái)嚢琛財(cái)嚢琛湃榍濉厌劇兴榧欲}→壓榨過夜→真空包裝

1.2.3 乳酸菌計(jì)數(shù)

在成熟期中的7，15，30，45，60，75，90 d取樣測(cè)定乳酸菌菌落總數(shù)[7]。

1.2.4 pH值的測(cè)定

樣品處理按照文獻(xiàn)[8]中方法進(jìn)行，用Delta 320 pH計(jì)測(cè)定。

1.2.5 蛋白質(zhì)水解程度的測(cè)定

在1，7，15，30，45，60，75，90 d分別取樣測(cè)定pH值為4.6可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（pH4.6 SN）測(cè)定[9]和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的TCA可溶性氮(Non Protein Nitrogen，NPN)測(cè)定[10]。

總氮測(cè)定采用凱氏定氮法（GB5009.5-2003）。

1.2.6 SDS-PAGE凝膠電泳

取0.1 g干酪樣品，加3.5 mL樣品溶解液，沸水浴3 min后迅速冷卻，磁力攪拌10 h后過夜，離心（2 000 g×20 min，4℃），去除上層脂肪，樣品冷凍備用。取5 μL上樣。分離膠濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%和6%。電壓250 V凝膠電泳先15 mA再20 mA恒流下進(jìn)行。電泳結(jié)束后在考馬斯亮藍(lán)R250溶液中染色2 h，然后用脫色液浸泡在搖床脫色過夜至背景清晰[11]。

樣品緩沖溶液為[12]：60 mmol Tris-HCl（pH值為6.8）；體積分?jǐn)?shù)為25%甘油；質(zhì)量濃度為20 g/L的SDS；濃度為14.4 mmol/L的β-巰基乙醇；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%溴酚藍(lán)。

2 結(jié)果分析

2.1 各干酪理化成分

將裝有滅菌乳的干酪罐進(jìn)行編號(hào)，按1.2.1加入發(fā)酵劑，在同一干酪槽內(nèi)統(tǒng)一制作完成。4種干酪的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)及pH值均在典型的半硬質(zhì)干酪指標(biāo)范圍內(nèi)[13]。如表1所示。

表1 各干酪的理化成分測(cè)定結(jié)果

2.2 成熟期間乳酸菌總數(shù)變化

隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸菌生長(zhǎng)趨勢(shì)如圖1所示。圖1中，在成熟初期2周內(nèi)各干酪中乳酸菌總數(shù)維持在一定范圍內(nèi)（108～109g-1），且乳酸菌數(shù)相近。在15 d到1個(gè)月期間各干酪乳酸菌數(shù)下降至107g-1左右，在30 d之后，A對(duì)照干酪的乳酸菌數(shù)逐漸下降至6.0×106g-1，而干酪B、C、D的乳酸菌數(shù)量先上升后下降至相近（1.0～3.0）×108g-1，其中干酪B乳酸菌數(shù)最高。切達(dá)干酪的含水量少，發(fā)酵劑未發(fā)酵完的乳糖大多非發(fā)酵劑乳酸菌（Non-Starter Lactic Acid Bacteria,NSLAB），NSLAB對(duì)于切達(dá)干酪的品質(zhì)有重要的作用[14，15]。添加附屬發(fā)酵劑的干酪能在成熟期內(nèi)維持較高的活菌數(shù)。

圖1 成熟期間各干酪中乳酸菌總數(shù)變化

2.3 成熟期間pH值的變化

整體變化趨勢(shì)是先下降后升高，然后趨于平緩。在干酪成熟一周內(nèi)，pH值迅速降低，結(jié)合圖1可知，在15天內(nèi)各干酪中乳酸菌總數(shù)維持在較高水平，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，使pH值有所下降，正如圖2所示在第7天pH值降低至pH5.0左右，隨后pH值逐漸升高，在90天時(shí)B和C具有較低pH值。而pH值是影響干酪中生化反應(yīng)的重要因素之一。

圖2 成熟期間pH值變化

2.4 成熟期內(nèi)蛋白質(zhì)水解程度的變化

圖3為切達(dá)干酪在成熟期內(nèi)非酪蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。由圖3可以看出，干酪C和D的非酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著成熟期延長(zhǎng)具有相似的變化趨勢(shì)，隨著成熟時(shí)間緩慢增加，而干酪B在15 d時(shí)具有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的非酪蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對(duì)照切達(dá)干酪A隨著時(shí)間其蛋白質(zhì)分解程度趨勢(shì)平緩。pH4.6SN主要是凝乳酶和胃蛋白酶的作用形成的肽類以及纖溶酶活性，對(duì)引起的一定的蛋白質(zhì)降解。由于添加的附屬發(fā)酵劑不同，發(fā)酵劑產(chǎn)酸程度不同，凝乳酶的作用效果也不同，所以初始的pH4.6SN質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，但沒有差異（P＜0.05）；在第75天，干酪A、B、C之間有顯著差異，而干酪C和D沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖3 成熟期內(nèi)非酪蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

圖4為切達(dá)干酪在成熟期內(nèi)非蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。由圖4可以看出，各實(shí)驗(yàn)組干酪的12%TCA可溶性氮（非蛋白氮）含量隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，與對(duì)照干酪相比，干酪B和干酪C具有較高的非蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在1個(gè)月后不同組別之間非蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），加入自溶度高菌株的干酪B的非蛋白氮的含量為8.00%，在對(duì)照干酪A中的含量為7.35%，變化表示著成熟干酪的次級(jí)蛋白質(zhì)降解，此時(shí)高、中分子量肽類被降解成低分子量肽類以及氨基酸等。

圖4 成熟期內(nèi)非蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

2.5 SDS-PAGE顯示蛋白質(zhì)水解的狀況

圖5為干酪B成熟過程中的SDS電泳結(jié)果；圖6為干酪A，B，C，D在75 d和90 d的SDS電泳結(jié)果。由圖5和圖6可以看出，有zone1，zone2，zone3凝膠帶，經(jīng)分析zone1為α-酪蛋白，zone2為β酪蛋白，后期條帶變窄，這是因?yàn)棣?酪蛋白分解成αs1、αs2，以及遷移至條帶下方而造成的；而zone 2和zone 3中肽類隨著時(shí)間逐漸增多，而zone3以下的有低分子量的肽隨著時(shí)間增多，該區(qū)帶主要是乳酸菌中的蛋白酶或肽酶作用所致。觀察20.1～30.0 ku中間的zone4電泳帶，通過干酪D可以看出，在此位置電泳帶90 d的要比75 d帶深一些，說明在此位置小分子物質(zhì)增加；干酪A在此位置出現(xiàn)一條帶，而干酪B，C，D在此位置均有兩條帶；具體原因還需進(jìn)一步研究。

圖5 干酪B的SDS電泳結(jié)果

圖6 在75d和90d的SDS電泳結(jié)果

3 結(jié)論與討論

（1）隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，并伴隨著pH值先降低后升高的變化趨勢(shì)，乳酸菌菌數(shù)也呈先下降后上升并保持穩(wěn)定的狀態(tài)。添加附屬發(fā)酵劑的干酪能在成熟期內(nèi)維持較高的活菌數(shù)。

（2）各實(shí)驗(yàn)組干酪的12%TCA可溶性氮含量隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在1個(gè)月后不同組別之間差異顯著（P＜0.05），含有高自溶度附屬發(fā)酵劑的干酪B非蛋白氮的含量最高，為8.00%，在對(duì)照干酪（未添加附屬發(fā)酵劑）中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.35%。本文中添加的快速自溶的乳酸菌能加快蛋白質(zhì)分解。

（3）通過電泳圖很直觀的看到隨著成熟期延長(zhǎng)，小分子物質(zhì)增加，在zone3以下泳帶顏色加深，低分子量的肽隨著時(shí)間增多，該區(qū)帶主要是乳酸菌中的蛋白酶或肽酶作用所致。

高自溶度附屬發(fā)酵劑對(duì)干酪蛋白分解有促進(jìn)作用，但效果不如直接添加促熟外源酶（如枯草芽孢桿菌蛋白酶）那樣明顯，且發(fā)酵劑所釋放酶的組成和類型尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。若能確定該酶類型并改變添加發(fā)酵劑的方式，也許能快速縮短干酪成熟時(shí)間。

[1] GASSON M J.Lytic Systems in Lactic Acid Bacteria and Their Bacteriophages[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1996,70,147-159.

[2] LAW B A.Controlled and Accelerated Cheese Ripening:the Research Base for New Technologies[J].International Dairy Journal,2001,11:383-398.

[3] KUNJI E S,MIERAU J,HAGTING A,et al.The Proteolytic Systems of Lactic Acid Bacteria[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1996,70:187-221.

[4] LYNCH C M,MCSWEENEY P L H,FOX P F,et al.Manufacture of Cheddar Cheese with and without Adjunct Lactobacilli under Controlled Microbiological Condition[J]s.International Dairy Journal,1996,6:851-867

[5] HANNON J A,WILKINSON M G,DELAHUNTY CM,et al.Use of Autolytic Starter Systems to Accelerate the Ripening of Cheddar Cheese[J].International Dairy Journal,2003,13:313-323.

[6] KENNY O,FITZGERALD R J,CUINN G.O,et al.Autolysis of Selected Lactobacillus Helveticus Adjunct Strains during Cheddar Cheese Ripening[J].International Dairy Journal,2006,16:797-804.

[7] ISHII S.Study on the Kumiss(Airag)of Mongolian Nomads after Severe Cold in the Winters of 2000 and 2001[J].Milk Science,2003,52:49-52.

[8]董瑩.不同體細(xì)胞原料乳對(duì)契達(dá)干酪品質(zhì)的影響[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[9] BYNUM D G,BARBANO D M.Whole Milk Reverse Osmosis Retentates or Cheddar Cheese Manufacture:Chemical Changes during Aging[J].Journal of Dairy Science,1985,68(1):1–10.

[10] CHRISTENSEN T,BECH A M,WERNER H.Methods for Crude Fractionation(Extraction and Precipitation)of Nitrogen Components in Cheese[J].International Dairy Federation Bulletin,1991,261:4-9.

[11] 鄭小平.尿素-SDS-PAGE顯示干酪成熟過程中酪蛋白降解生成的小分子肽[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2002,(99)2:7-8.

[12] 汪家政,范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2004.

[13] FOX P F.Influence of Cheese Composition on Quality[J].International Agriculture research,1975,14:33-42.

[14] MCSWEENEY P L H,FOX P F,COGAN TIMOTHY M.Fundamentals of Cheese Science[M].Gaithersburg Maryland:Aspen Publishers，2000.

[15] MCSWEENEY P L H,FOX P F,LUCEY J A,et al.Contribution of the Indigenous Microflora to the Maturation of Cheddar Cheese[J].International Dairy Journal,1993,3(7):613-634.

Effect of autolytic starter adjuncts on proteolysis of Cheddar cheese

SUN Zhuo1，2,LV Jia-ping1,ZHANG Jia-cheng2,KONG Fan-pi1,LI Hong-juan1
（1.Institute of Agro-food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.college of food science and engineering，Qingdao agricultural university，Qingdao 266109，China）

To investigate the hypothesis,Cheddar cheese were made with or without starter adjuncts that had different autolysis rate of lactic acid bacteria.Cheddar cheeses were sampled to analysis the populations of lactic acid bacteria,the changes of cheese pH value,the proteolysis by determining pH4.6 soluble nitrogen,12%TCA soluble nitrogen and performing SDS-PAGE electrophoresis at different ripening time.The results showed that 12%TCA soluble nitrogen increased with ripening time,and which were significant different between different rows after one month(P＜0.05).The 12%TCA soluble nitrogen in the cheddar cheese with starter adjuncts that had high autolysis rate was 8.00%,which was higher compare to the control cheese that without starter adjuncts.As the SDS-PAGE electrophoresis showed,the protein was proteolysis at a certain degree with slight difference;the autolysis of lactic acid bacteria accelerated the rate of proteolysis.

autolysis;starter adjuncts;proteolysis

Q936

A

1001-2230（2010）12-0012-03

2010-09-25

國(guó)家“十一五”奶業(yè)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題“乳品加工關(guān)鍵設(shè)備及材料研究與開發(fā)”（2006BAD04A07）。

孫卓（1987-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與技術(shù)。

呂加平