張智圓,沈志濱,季宇彬

制草烏為毛茛科植物北烏頭(Aconitum kusnezoffiiReichb).干燥塊根的炮制加工品[1],主要含有新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿等生物堿類成分[2].文獻多見對其中兩種生物堿及總生物堿進行測定[3-6],同時對3種生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定的文獻報道罕見.本文同時測定6個不同地區(qū)制草烏中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù),為制草烏生產(chǎn)規(guī)范化、飲片生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化提供質(zhì)量控制依據(jù).

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters 515,2487 UV檢測器,EmPower色譜工作站);對照品購于中國藥品生物制品檢定所,烏頭堿(批號:110720-200410),次烏頭堿(批號:0798-9403),新烏頭堿(批號:0799-9403).

制草烏飲片由廣東藥學(xué)院生藥教研室李書淵副教授鑒定為毛茛科植物北烏頭(Aconitum kusnezoffiiReichb).干燥塊根的炮制加工品.產(chǎn)地及編號見表1.

表1 制草烏產(chǎn)地

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇-水-氯仿-三乙胺(w/w 70∶30∶2∶0.1),流速為1.0mL/min,檢測波長為230 nm,柱溫為室溫[7].

2.2 溶液制備及色譜檢測

2.2.1 對照品溶液的制備及色譜檢測

分別精密稱取新烏頭堿、次烏頭堿及烏頭堿,二氯甲烷配制成1.00、1.00、0.39mg/mL對照品溶液.精密吸取1 mL,置于10 mL離心管中,精密加入0.01m L H2SO41mL,渦旋2 min,離心5 min(3 000 r/min),取水層20μL進樣.色譜圖見圖1.

圖1 對照品HPLC色譜圖

2.2.2 供試品溶液配制及色譜檢測

精密稱定制草烏粗粉10 g,氨試液4 mL潤濕,乙醚50mL浸泡14 h,過濾.乙醚洗滌藥渣15m L×3次,合并乙醚液,60℃以下蒸干,二氯甲烷溶解并定量轉(zhuǎn)移殘渣至5mL容量瓶,精密吸取1m L,置于10 mL離心管中,精密加入0.01 m L H2SO41m L,渦旋2 min,離心5 min(3 000 r/min),取水層20μL進樣[8].色譜圖見圖2.

圖2 供試品HPLC色譜圖

2.3 實驗結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.25、0.5、1、2、3 m L,至10 mL尖底具塞試管中,精密加入0.01 mol/LH2SO41m L,渦旋2min,3 000 r/min,離心5 min,取水層20μL進樣,按上述色譜條件測定峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),求得相應(yīng)回歸方程,見表2.

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

2.3.2 穩(wěn)定性實驗

取舟山A制草烏粗粉,按2.4.2.2方法制備供試品溶液,于0、2、4、6、8 h分別測定其相應(yīng)生物堿的峰面積.由標(biāo)準(zhǔn)曲線求其質(zhì)量比,新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的RSD分別為2.3%、2.1%和1.5%.

2.3.3 精密度實驗

精密量取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿混合對照品溶液1 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍項下進行分析,平行5份,新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿峰面積的RSD分別為1.8%、2.5%、2.8%.

2.3.4 重現(xiàn)性試驗

取舟山A制草烏粗粉5份[9],按2.4.1.2項下制備供試品溶液,分別測定質(zhì)量分?jǐn)?shù),測得新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿RSD分別為2.9%、3.7%和1.3%.

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取舟山A制草烏粗粉,加入一定量的對照品,依上述色譜條件測定峰面積,計算三者的加樣回收率分別為96.1%、95.8%和95.3%.其RSD分別為1.8%、1.3%和2.0%.

2.3.6 樣品質(zhì)量比測定

分別取不同供試品溶液20μL,按上述色譜條件進樣,測得供試品中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿相應(yīng)峰面積,計算質(zhì)量比,結(jié)果見表3.

表3 樣品中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿質(zhì)量比

3 結(jié) 語

本實驗采用HPLC法同時檢測6個不同地區(qū)中制草烏中三種烏頭堿的質(zhì)量比,得到結(jié)果:新烏頭堿10～120μg/m L,次烏頭堿3.9～46.8μg/m L,烏頭堿在10～120μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率分別為96.1%、95.8%和95.3%.其酯型生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不超過0.15%,符合中國藥典規(guī)定.

[1]《中國藥典》2005版[M]I部.VOL.26-27;163-164.

[2]李文蘭,王艷萍.中藥烏頭的實驗研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,22(4):13-17.

[3]李云霞,孫 照,郭艷玲.酸性染料比色法測定川烏、草烏中總烏頭生物堿的含量[J].中成藥,2000,22(9):662-663.

[4]王朝虹,何 毅,張繼宗,等.高效液相色譜法測這下草烏中烏頭堿含量[J].刑事技術(shù),2003(1):15-16.

[5]孫愛民,陳德華,畢培曦.高效毛細管電泳法測定中草藥川烏、草烏中烏頭堿的含量[J].色譜,1999,17(1):67-69.

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[9]楊書良,吳 亞,楊 波,等.HPLC法測定番瀉葉滴丸中番瀉苷B的含量[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,25(11):11-12.