沈青松, 黃文佳, 呂玉龍, 王翼飛

(上海大學(xué) 理學(xué)院,上海 200444)

一種糖尿病動(dòng)物模型基因芯片的聚類分析

沈青松, 黃文佳, 呂玉龍, 王翼飛

(上海大學(xué) 理學(xué)院,上海 200444)

建立一種基因表達(dá)譜的聚類分析模型,通過信噪比處理、聚類結(jié)果的分析比較、相應(yīng)標(biāo)記的尋找,為芯片數(shù)據(jù)的后續(xù)分析以及尋找差異基因提供一種有效的方法.對(duì)一種糖尿病動(dòng)物模型的小鼠基因表達(dá)譜進(jìn)行實(shí)際分析,獲取了有意義的結(jié)果,從而為糖尿病的快速和早期臨床醫(yī)學(xué)診斷提供有效的技術(shù)支撐.

基因表達(dá)譜;過程模型;聚類分析;差異基因

Abstract:Thispaper introduces a model of cluster analysis on the gene expression data.By processing signal-to-noise ratio,comparing the cluster analysis results and searching the corresponding markers,it offers an efficient method to post-analyze the gene exp ression data and discover different genes.Gene expression data of a diabetic mouse are analyzed,and significance of this analysis obtained,which facilitates technical support to rapid and early clinical diagnosisof diabetes.

Key words:gene exp ression profiles;p rocessmodel;cluster analysis;different gene

基因芯片,又稱 DNA芯片 (DNA chip)或 DNA微陣列 (DNA microarray),是隨著“人類基因組計(jì)劃”(human genome p roject,HGP)的實(shí)施而發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),可廣泛應(yīng)用于基因序列分析、基因突變檢測(cè)、多態(tài)性分析以及疾病的基因診斷等許多領(lǐng)域[1-2].

目前,在發(fā)達(dá)國家糖尿病已經(jīng)成為導(dǎo)致人口死亡的第四大疾病.資料顯示,全球糖尿病患者約 2億人,其中中國約有 5 000萬人受到糖尿病的困撓,患病率居世界第二位,并且以每天至少 3 000人的速度增加,每年增加人數(shù)超過 120萬[3],因此,糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一.由于高密度基因芯片實(shí)驗(yàn)一次就能同時(shí)檢測(cè)出成千上萬個(gè)基因的表達(dá),因此,該技術(shù)的出現(xiàn)為腫瘤及糖尿病等復(fù)雜性疾病的研究提供了一種新的實(shí)驗(yàn)手段和研究方法,并為這類疾病的診斷與醫(yī)學(xué)治療提供了有效的技術(shù)支撐,現(xiàn)在已經(jīng)引起了社會(huì)各界廣泛的重視.利用基因表達(dá)譜對(duì)腫瘤等復(fù)雜性疾病進(jìn)行分類檢測(cè)正逐步形成生物信息學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域.但由于基因表達(dá)數(shù)據(jù)存在維數(shù)高、噪音大、樣本數(shù)量小以及基因表達(dá)之間存在很大相關(guān)性等特點(diǎn),深入而準(zhǔn)確地挖掘DNA序列中蘊(yùn)含的信息具有極大困難[4].自從Golub等以急性白血病基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)為分類樣本,提出基于權(quán)重表決的基因選擇算法以來,許多機(jī)器學(xué)習(xí)方法被廣泛地應(yīng)用于腫瘤等高通量數(shù)據(jù)的兩分類問題的研究.這些方法所做的主要工作就是降維、去噪和剔除冗余基因,目的就是提取信息基因 (即具有顯著特性或影響其他基因變化的基因)或抽取綜合屬性信息,并采用合適的聚類方法,最大限度地把具有相同或類似作用的基因聚類到一塊[4].

聚類分析方法把一個(gè)沒有類別標(biāo)記的樣本集按照某種準(zhǔn)則劃分成若干個(gè)子集 (類),使相似的或者具有相近性質(zhì)的樣本盡可能歸為一類,而不相似的樣本盡可能分到不同的類中.然后,再對(duì)類中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與比較,看是否真的具有良好的聚類效果與生物學(xué)意義.

1 材料與方法

本研究以糖尿病動(dòng)物模型Mouse C57BL6的小鼠基因芯片數(shù)據(jù)作為研究對(duì)象,相關(guān)數(shù)據(jù)下載于美國斯坦福大學(xué) (http:∥smd.stanford.edu/cgi-bin/tools/display/listM icroArrayData.pl?tableName=publication).

本研究的目的是查明 CD4+T細(xì)胞在生長發(fā)育過程中非肥胖型糖尿病小鼠基因表達(dá)的變化情況.利用基因芯片基因表達(dá)分析中的胰腺淋巴細(xì)胞受體基因和正常小鼠在不同年齡的基因表達(dá)的比較,驗(yàn)證了α-干擾素對(duì)正常小鼠和病態(tài)小鼠的不同影響,從而為推遲或者降低小鼠糖尿病的發(fā)病、增強(qiáng)小鼠抵抗能力等,作出了相應(yīng)的分析與闡述.

本研究的聚類分析問題的關(guān)鍵是:①如何根據(jù)基因表達(dá)譜,從基因空間中選擇與糖尿病疾病有關(guān)的基因集合,或抽取有分類特征的綜合屬性;②如何根據(jù)信息基因或綜合屬性獲得好的聚類效果.

1.1 芯片數(shù)據(jù)聚類分析過程模型

由于基因芯片數(shù)據(jù)的聚類分析是模式分類識(shí)別方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)具體應(yīng)用,因此,芯片數(shù)據(jù)聚類分析過程模型與模式分類識(shí)別過程模型具有相似性,主要分為基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲取、基因表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)處理和歸一化、信息基因選擇或綜合屬性抽取、樣本聚類分析模型建立及測(cè)試與聚類結(jié)果評(píng)估.本研究得到的芯片數(shù)據(jù)聚類分析模型如圖1所示.

圖1 芯片數(shù)據(jù)聚類分析過程模型Fig.1 M odel of chip data cluster analysis processing

基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的獲取是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作過程,所得到的數(shù)據(jù)往往存在噪聲大、質(zhì)量較低等現(xiàn)象,某些數(shù)據(jù)還不在同一量綱范圍.另外基因表達(dá)數(shù)據(jù)存在重復(fù)、缺失等現(xiàn)象,因此,要對(duì)基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和歸一化,這是在分析基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)之前一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)[5].本研究所涉及的微陣列數(shù)據(jù)預(yù)處理工作主要有:

(1)采用樣本加權(quán)平均補(bǔ)齊基因表達(dá)數(shù)據(jù).

(2)計(jì)算理想的非配對(duì)值 (ideal mismatch,IM),然后從完全配對(duì) (perfectmismatch,PM)強(qiáng)度中減去 IM,對(duì)校正后的 PM進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換.

包含配對(duì) (mismatch,MM)探針的原因是提供一個(gè)估計(jì)非特異性雜交和其他影響 PM的偏離信號(hào)的值.計(jì)算理想的非配對(duì)值共分三種不同的情況,具體計(jì)算公式見文獻(xiàn)[2].

當(dāng)計(jì)算得到每個(gè)探針的 IM后,探針值為 Vi,j=PMi,j-IMi,j,對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的探針值 (p robe value,PV)為PVi,j=log2(Vi,j).

(3)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的值進(jìn)行穩(wěn)健性均數(shù)估計(jì),然后進(jìn)行反對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,對(duì)信號(hào)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化.

1.2 基因選擇或綜合屬性抽取

由于基因表達(dá)譜中基因數(shù)量非常大,少則幾千,多則上萬,并且其中多數(shù)基因的表達(dá)與腫瘤無關(guān),這為基因選擇和綜合屬性抽取帶來了很大困難,很難采用某一種簡單的方法完成這一任務(wù).因此,通常要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基因篩選,所選擇的基因數(shù)量由實(shí)驗(yàn)來確定,其數(shù)量選擇的合理性以及所選擇基因的聚類效果也由最終與腫瘤作用相關(guān)的基因來評(píng)估[6],主要方法如下:

(1)應(yīng)用 t-檢驗(yàn) (t-test)與設(shè)定閾值相結(jié)合的方法,對(duì)從幾萬個(gè)數(shù)據(jù)中篩選出的幾千個(gè)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析;

(2)應(yīng)用信噪比方法 (signal to noise),本研究中的記分函數(shù)表示為

采用這些方法所選擇的基因相互之間仍存在高度相關(guān)性,還必須采取某種策略精選出聚類能力更強(qiáng)的具有差異信息的基因,并進(jìn)一步剔除冗余基因.

1.3 樣本聚類分析模型建立

本研究對(duì)篩選出的基因號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行如下處理與假設(shè)規(guī)定.

(1)對(duì)原數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組取對(duì)數(shù)值后得到的各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的數(shù)據(jù)比值進(jìn)行取值.若基因顯示存在 (prensent),則當(dāng)比值 r≥1時(shí) ,r取 1;當(dāng) -1

(2)對(duì)基因號(hào)進(jìn)行對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)聚類分析處理:①對(duì)數(shù)據(jù) (基因)進(jìn)行大 (較粗糙)的聚類;②對(duì)步驟①得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行再次分類,使得顯著性變化的基因有更強(qiáng)的相似性;③利用計(jì)算機(jī)程序?qū)ふ业礁鲿r(shí)間點(diǎn)具有顯著變化的標(biāo)記 (marker,具有顯著性變化的基因);④對(duì)尋找到的標(biāo)記與信噪比散點(diǎn)圖進(jìn)行對(duì)比分類,結(jié)合步驟①和②進(jìn)行最終的聚類.

1.4 測(cè)試與聚類結(jié)果評(píng)估

聚類的相似程度與準(zhǔn)確程度是評(píng)判聚類效果與性能的一個(gè)非常重要的指標(biāo),但不是唯一的評(píng)價(jià)指標(biāo).評(píng)價(jià)整個(gè)聚類性能的優(yōu)劣還需要由聚類前的基因選擇或特征抽取過程是否具有生物學(xué)含義來判定[7-8].

本研究把整個(gè)聚類過程是否具有生物學(xué)含義作為評(píng)判聚類結(jié)果是否優(yōu)劣的另一個(gè)重要指標(biāo).一個(gè)聚類結(jié)果得到以后,是否影響腫瘤等復(fù)雜性疾病的作用時(shí)間點(diǎn),應(yīng)該給出可信度和聚類模型的過程,使實(shí)驗(yàn)人員或醫(yī)務(wù)人員能夠?qū)Y(jié)果理解和信服[9-10].

圖2 信噪比散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of signal to noise ratio

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與比較

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究使用芯片數(shù)據(jù)聚類分析模型方法對(duì)小鼠糖尿病細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析.從得到的上萬個(gè)數(shù)據(jù)中篩選出 6 916個(gè)基因,在利用信噪比方法處理以后,得到信噪比散點(diǎn)圖 (見圖2).

圖2說明基因的信噪比比值 90%以上都處于0～5之間,大于5的不到10%.本研究的芯片數(shù)據(jù)共分為 3個(gè)時(shí)間記錄點(diǎn),分別為第 2周、第 6周、第 12周.之所以選擇這 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為記錄點(diǎn),是因?yàn)樵谶@ 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯著性變化較為明顯.分別記錄下這 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的信噪比比值,對(duì)以上 6 916個(gè)基因進(jìn)行聚類分析,將其分為 8大類,得到的聚類結(jié)果分別為 146,1 458,2,718,820,485,2 816,471(各類中所含基因的數(shù)目).

本研究選取各組具有顯著性變化的基因表達(dá)譜的聚類結(jié)果進(jìn)行比較分析,結(jié)果如圖3所示.

圖3(a)類中的基因表達(dá)值在第 2周、第 6周、第 12周 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都維持在一個(gè)上升變化較高的水平,這種類型的基因占 2.11%;圖3(b)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周沒有太大的上升,而第 6～12周發(fā)生顯著性上升,這類基因占 21.08%;圖3(c)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周一直保持在一個(gè)顯著性上升的狀態(tài),而第 6～12周開始顯著性下降,這類基因占 0.03%;圖3(d)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周顯著性上升,而第 6～12周基因表達(dá)值未發(fā)生明顯變化,這類基因占 10.38%;圖3(e)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周由顯著性上升趨向于平穩(wěn),而第6～12周基因表達(dá)值未發(fā)生明顯變化,這類基因占11.86%;圖3(f)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周顯著性下降,而第 6～12周基因表達(dá)值未發(fā)生明顯變化,這類基因占 6.94%;圖3(g)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周未發(fā)生明顯變化,而第 6～12周基因表達(dá)值顯著性下降,這類基因占 40.72%;圖3(h)類中的基因表達(dá)值在第 2～6周顯著性下降,并趨向于平穩(wěn),而第 6～12周基因表達(dá)值未發(fā)生明顯變化,這類基因占6.81%.

圖3 聚類結(jié)果比較Fig.3 Compar ison of cluster results

對(duì)以上得到的聚類結(jié)果進(jìn)行再次分類,留下第2周、第 6周、第 12周 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)中至少有 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生顯著變化的基因,剔除僅有 1個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生顯著變化的基因.在 6 916個(gè)基因中,只留下 1 395個(gè)基因.這 1 395個(gè)基因在 8大類的基礎(chǔ)上又分成了17小類,每類的基因數(shù)分別為 146,342,2,66,50,198,33,19,51,365,41,2,9,9,21,18,23,這使得每一小類的基因在表達(dá)上具有更強(qiáng)的相似性.

本工作的研究對(duì)象 (基因)通過α-干擾素對(duì)小鼠的基因表達(dá)譜進(jìn)行誘導(dǎo),來識(shí)別第 2周、第 6周和第 12周的時(shí)間點(diǎn)上各基因表達(dá)譜的變化,最終確定是否由于這些基因表達(dá)譜的變化導(dǎo)致了小鼠糖尿病的發(fā)生與形成.通過以上聚類分析的方法,把發(fā)生類似顯著性變化的基因分在同一類中,為進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)與早期臨床實(shí)驗(yàn)提供可靠的依據(jù)與技術(shù)支撐.

通過對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析處理,尋找到了標(biāo)記 (見表 1).

表 1 聚類尋找到的標(biāo)記Table 1 M arker s of cluster ing results

對(duì)表格 1中的 25個(gè)基因與分類結(jié)果進(jìn)行比對(duì),得到結(jié)果如下:屬于第 7小類的基因有 XM_134383,NM_018764,NM_145435;屬于第 12小類的基因有NM_175479,NM_007967;屬于第 13小類的基因有NM_028990,NM_146260,NM_178774,NM_145603,XM_484178,AK129101,NM_152839,J00453,NM_080560;屬于第 14小類的基因有 NM_146261,NM_021276,XM_127023,NM_145155,XM_489160,NM_139140,NM_009119,NM_010059,XM_129721.

按照之前聚類后得到的 8類結(jié)果進(jìn)行分類,把基因號(hào)與注釋結(jié)果 (NCB I數(shù)據(jù)庫)相比對(duì),其中基因NM_175479,NM_018764,NM_139140,NM_009119,NM_028990,NM_146260,NM_145603與小鼠糖尿病的發(fā)生與病變有直接或間接的關(guān)系[11].找到這些基因可為后續(xù)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供了有用的科學(xué)依據(jù),為進(jìn)一步深入研究糖尿病疾病的形成機(jī)理,研發(fā)基因藥物提供重要的信息.

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

通過對(duì)以上差異基因的搜索查詢 (www.ncbi.nlm.nih.gov),由差異基因的功能注釋與分析,尋找到的差異基因的有效性達(dá)到了 88%,這比用一般的Gene Cluster軟件和 Treeview軟件的系統(tǒng)聚類(hierarchical clustering)方法和 K均值方法,無論是在精確度上,還是尋找到的差異基因的有效性上,都有明顯的提高.通過對(duì)照檢索比較,尋找到的基因都具有顯著的代表性與差異功能.

基因表達(dá)譜的聚類分析是基于實(shí)際問題的一種分析過程,因此對(duì)聚類結(jié)果的解釋也是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié),這就涉及到聚類趨勢(shì)和聚類有效性等問題的研究.聚類分析過程模型是一個(gè)大的分析系統(tǒng),只有系統(tǒng)中的各部分協(xié)調(diào)工作,才有可能獲得好的聚類分析結(jié)果[12].本研究所建立的芯片數(shù)據(jù)聚類分析模型對(duì)小鼠糖尿病發(fā)病的預(yù)測(cè)與控制就是一種有效的方法.

3 結(jié) 束 語

基于基因表達(dá)譜的腫瘤及糖尿病等復(fù)雜性疾病的聚類結(jié)果的檢測(cè),一個(gè)關(guān)鍵問題就是基因選擇或綜合屬性抽取,但由于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集的高維性和小樣本等特點(diǎn),使得這個(gè)問題最為棘手.信息基因選擇算法或者綜合屬性抽取算法的優(yōu)劣程度,除了根據(jù)其分類性能作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)外,還沒有其他統(tǒng)一的評(píng)估準(zhǔn)則來評(píng)判各種分類方法的優(yōu)劣,希望能盡快指定一個(gè)合理的聚類方法評(píng)估體系[12].通過聚類分析的研究方法,本研究最后所篩選出的基因也是由基因性能來判斷,而沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來衡量聚類效果的好壞,因此,評(píng)判聚類效果一直未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn).而基于基因表達(dá)譜建立的聚類分析模型是一個(gè)非常有應(yīng)用價(jià)值的工具,也是理論研究與實(shí)際應(yīng)用緊密結(jié)合的嘗試,很有希望應(yīng)用服務(wù)于醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐和醫(yī)學(xué)制藥等領(lǐng)域,使得預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)和個(gè)性化醫(yī)學(xué)成為可能[13].

進(jìn)一步的研究工作包括設(shè)計(jì)更有效的信息基因選擇算法以及研究聚類分析模型中參數(shù)的選擇等問題.同時(shí),盡可能多地發(fā)現(xiàn)與糖尿病密切相關(guān)的標(biāo)記基因,為糖尿病的快速和早期臨床精確診斷帶來幫助.

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(編輯:劉志強(qiáng))

Cluster Analysis on Gene Chips of a D iabetic An imal M odel

SHEN Qing-song, HUANGWen-jia, Lü Yu-long, WANG Yi-fei
(College of Sciences,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China)

O 235

A

1007-2861(2010)04-0409-06

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.04.016

2009-03-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (30871341);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目 (S30104);上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(J50101)

王翼飛 (1948～),男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)樯镄畔W(xué).E-mail:yifei_wang@staff.shu.edu.cn