姚瓔，杲光偉，李大偉

上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240

布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及活性測定

姚瓔，杲光偉，李大偉

上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏錐蟲蛋白合成過程中的一類重要酶，以其為靶點(diǎn)的抑制劑可能發(fā)展成為新一代的抗錐蟲藥物，但此前并沒有分離錐蟲苯丙氨酸-tRNA合成酶的報(bào)道。本研究用大腸桿菌成功克隆表達(dá)并純化了布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶并進(jìn)行了活性測定。首先通過PCR方法從布氏錐蟲細(xì)胞基因組中分別擴(kuò)增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亞基、β亞基的基因，依次克隆入pCOLADuet共表達(dá)載體，然后在大腸桿菌BL21(DE3)RIPL中進(jìn)行了成功表達(dá)，并采用Ni-Bind親和層析對其進(jìn)行了純化，最后用免疫印跡進(jìn)行了鑒定。此外還采用放射性同位素方法進(jìn)行了酶活性測定，這為下一步進(jìn)行布氏錐蟲苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的設(shè)計(jì)和體外篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。

布氏錐蟲，苯丙氨酰-tRNA合成酶，原核表達(dá)，純化，酶活測定

Abstract:Phenylalanyl-tRNA synthetase is a key enzyme for protein synthesis in Trypanosoma.Its validation as an inhibition target will enable the development of a new generation of anti-Trypanosoma drugs.However, little is known about the isolation of the Trypanosoma Phenylalanyl-tRNA synthetase.Here we report the cloning, expression, purification and activity assay of Phenylalanyl-tRNA synthetase from Trypanosoma brucei in Escherichia coli host.We co-cloned the α-subunit and β-subunit of Phenylalanyl-tRNA synthetase from Trypanosoma brucei genomic DNA into the co-expression vector pCOLADuet.We successfully expressed the Trypanosoma brucei Phenylalanyl-tRNA synthetase in E.coli host, purified the whole enzyme by Ni-Hind affinity column and verified it by Western blotting.In addition, we tested its enzymatic activity by isotope labeling.The whole work laid a solid foundation for in vitro the screening and optimization of Trypanosoma brucei phenylalanyl-tRNA synthetase inhibitors.

Keywords:Trypanosoma brucei, phenylalanyl-tRNA synthetase, prokaryotic expression, purification, enzyme activity assay

布氏錐蟲是一種在撒哈拉以南非洲地區(qū)所特有的寄生蟲，當(dāng)侵入寄主后會引起非洲錐蟲病或昏睡病，每年都會引起非常嚴(yán)重的死亡率和和令人震驚的社會和經(jīng)濟(jì)后果[1]。目前市場上存在的治療熱帶寄生蟲的藥物多數(shù)有藥物毒性、抗藥性等導(dǎo)致的療效有限問題；由于這些疾病主要影響世界貧困地區(qū)的貧困人口，長久以來很難成為醫(yī)藥企業(yè)關(guān)注的目標(biāo)市場。但如今的籌資情況發(fā)生了很大的變化，世界衛(wèi)生組織(WHO)瘧疾新藥研發(fā)(DNDi)等機(jī)構(gòu)以及一些慈善機(jī)構(gòu)已經(jīng)高度重視熱帶寄生蟲病，并且加大了在這方面的支持[2-3]。

近年來，生物化學(xué)的大力發(fā)展，以及錐蟲基因組序列的陸續(xù)破解，為尋找新的藥物作用靶點(diǎn)提供了很好的基礎(chǔ)。氨酰 tRNA合成酶(AaRS)作為蛋白質(zhì)生物合成過程中的一類關(guān)鍵酶，成為了抗錐蟲藥物的重要靶點(diǎn)[4]。然而在抗錐蟲藥物方面，以AaRS為靶點(diǎn)的藥物還鮮有報(bào)道，目前國內(nèi)外尚未看到任何有關(guān)以布氏錐蟲苯丙氨酰 tRNA合成酶(PheRS)為靶標(biāo)的篩選方法的建立。

苯丙氨酰 tRNA 合成酶(PheRS)是 AaRS家族中最為復(fù)雜的酶之一，由(αβ)2四聚體構(gòu)成[5]。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使得長期以來活性 PheRS的制備成為研究熱點(diǎn)。本研究首次將布氏錐蟲PheRS基因在大腸桿菌BL21(DE3)RIPL中進(jìn)行了成功克隆表達(dá)，并用Ni-Bind親和層析對蛋白進(jìn)行了純化，用免疫印跡進(jìn)行了驗(yàn)證，還進(jìn)行了酶活性測定的研究，這為進(jìn)一步以其為靶點(diǎn)進(jìn)行酶抑制劑設(shè)計(jì)和體外篩選獲得抗非洲錐蟲病新藥前體奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒和菌種：表達(dá)載體 pCOLADuet購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)RIPL由本實(shí)驗(yàn)室保存。

酶與主要試劑、儀器：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購自Fermentas公司；IPTG購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒均購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；Ni-Bind純化系統(tǒng)購自Novagen 公司；[14C]亮氨酸購自Perkin-Eilmer，啤酒酵母tRNA購自Roche，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；閃爍計(jì)數(shù)儀購自BechmanLS6500。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 9種不同物種的PheRS氨基酸序列比對

從NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫中調(diào)取布氏錐蟲和其他物種的PheRS氨基酸序列，用Clustal W軟件來分析同源序列比對。

2.2 PheRS α亞基、β亞基基因的獲得和重組質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ的構(gòu)建

根據(jù)已知的PheRS的α亞基、β亞基基因序列設(shè)計(jì)引物。α亞基的引物 F為 5'-GAGCGAATTCT ATGAGTACCATGGAG-3'，引物R為 5'-CGAAGCTT AAAACGCATTAGCTTTG-3'(下劃線分別表示EcoR I和 Hind III酶切位點(diǎn))。β亞基的引物 F為5'-ATCAGATCTATGCCAACCCTCGC-3'，引物R為5'-ATACTCGAGTCACTGGGCAAACTG -3'(下劃線分別表示Bgl II和Xho I酶切位點(diǎn))。采用上述引物以布氏錐蟲的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用DNA純化試劑盒回收，以EcoR I-Hind III酶切α亞基基因片段，克隆入同樣經(jīng)EcoR I-Hind III酶切消化的pCOLADuet載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分離獲得重組質(zhì)粒pCOLADuet- PheRSα，經(jīng)酶切鑒定和測序正確后，用于 β亞基的克隆。以Bgl II-Xho I酶切β亞基基因片段，克隆入同樣經(jīng)Bgl II-Xho I酶切消化的pCOLADuet-PheRSα載體，經(jīng)酶切及測序鑒定后構(gòu)建正確的共表達(dá)載體pCOLADuet-PheRSαβ用于蛋白表達(dá)。

2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

重組共表達(dá)質(zhì)粒 pCOLADuet-PheRSαβ轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)RIPL中，在含卡那青霉素(30 μg/mL)的LB培養(yǎng)液中37℃中過夜培養(yǎng)。次日以1:1000(V/V)的比例接種于新鮮培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A550為0.6～0.8時(shí)，設(shè)定IPTG誘導(dǎo)濃度0.01、0.025、0.05、1、1.25 mmol/L，采用 37℃誘導(dǎo) 4 h及25℃過夜誘導(dǎo)兩種方式來誘導(dǎo)重組菌的表達(dá)，以確定最佳蛋白誘導(dǎo)條件。

2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

4℃離心，收集菌體，超聲破碎，離心后收集上清液。上清液根據(jù)Novagen的His-Bind purification kit的操作手冊進(jìn)行親和色譜純化，依次在添加柱材料的交換柱中加入3倍柱床體積的去離子水，5倍柱床體積的交換緩沖液(50 mmol/L硫酸鎳)進(jìn)行鎳離子的交換，6倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，上清液過柱，10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液，6倍柱床體積的洗滌緩沖液(0.5 mol/L NaCl，60 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，6倍柱床體積洗脫緩沖液(1 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)，分管收集洗脫液。SDS-PAGE分析洗脫結(jié)果后，收集合并含酶部分，經(jīng)透析液(1×PBS，甘油 50%(V/V)，β-巰基乙醇 5 mmol/L，pH 6.8)過夜透析后，?20℃保存洗脫的蛋白用 8%的SDS-PAGE電泳進(jìn)行純化效果的鑒定。

2.5 免疫印跡鑒定

誘導(dǎo)前的菌液、IPTG誘導(dǎo)后的菌液、純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后，4℃、300 mA、2 h電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜上。將膜置于雜交袋中，封閉液室溫封閉1 h。棄溶液后，再加入用封閉液1:5000稀釋的特異性抗His標(biāo)簽的單抗，4℃過夜。以TBS-T洗膜3次后，加入HRP-山羊抗小鼠IgG抗體，用封閉液1:40 000稀釋，室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次后，將膜用 ECL-Plus處理后，于暗室曝光到 X-膠片上，顯影3 min，定影3 min。

2.6 PheRS的酶活性分析

采用放射性同位素法，以酶催化生成[14C]-Phe-tRNA復(fù)合物的量來測定酶活力。在酶反應(yīng)緩沖體系：50 mmol/L(pH 7.8)HEPES-KOH，5 mmol/L MgCl2，45 mmol/L KCl， 9 μmol/L [14C]-Phe(0.1 μCi/μL)，0.4 mg/mL啤酒酵母 tRNA，0.02%(W/V)BSA，1 mmol/L DTT，10%(V/V)DMSO，苯丙氨酰tRNA合成酶21 μL(純化后酶稀釋1000倍)。上述物質(zhì)混勻后，加入終濃度為2 mmol/L ATP時(shí)反應(yīng)起始，混合物終體積為70 μL。37℃恒溫反應(yīng)，在20 min內(nèi)每間隔5 min各取3等份20 μL反應(yīng)液分別滴加到定性濾紙上，并立即投入到5% TCA溶液100 mL中浸泡洗滌，重復(fù)3次；將取出的濾紙?jiān)偻度氲?5%酒精中浸泡洗滌，重復(fù) 3次。濾紙置于紅外燈下烘干，閃爍計(jì)數(shù)儀測定[6]。1 U酶定義在上述最適反應(yīng)條件下每分鐘生成1 nmol產(chǎn)物[14C]-Phe -tRNA時(shí)的酶量。根據(jù)李振權(quán)等[7]介紹的以下公式計(jì)算每毫升酶單位(U/mL)：

U/mL= K×(CPM2?CPM3)×稀釋倍數(shù)

公式中：CPM1為[14C]-Phe總放射量；CPM2為加入酶反應(yīng)后的CPM值；CPM3為背景放射，只加[14C]-Phe不加酶的CPM值。

3 結(jié) 果

3.1 不同物種的PheRS氨基酸序列比對

將布氏錐蟲和目前已成功表達(dá)的幾種物種的PheRS，主要是細(xì)胞質(zhì)的PheRS進(jìn)行了同源性分析，圖1是經(jīng)Clustal W分析后的進(jìn)化樹結(jié)果。比較幾種物種的α亞基和β亞基同源性，發(fā)現(xiàn)PheRS明顯分為真核生物類、原核生物類和古細(xì)菌類3種。無論從α亞基還是β亞基比較，布氏錐蟲的PheRS都與人源性及酵母類的PheRS同源性最高。由于人源性細(xì)胞質(zhì)PheRS已成功表達(dá)，這為同源性較高的布氏錐蟲的PheRS克隆表達(dá)提供了很好的基礎(chǔ)。

3.2 苯丙氨酰tRNA合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建

從 GenBank中分別查出布氏錐蟲 PheRSα和PheRSβ的基因分別為1491 bp和1875 bp。以布氏錐蟲的全基因組為模板，采取了 PCR擴(kuò)增的方式獲得PheRS的α亞基和β亞基的基因片段，從圖2可以看出擴(kuò)增得到的目的基因片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3中是構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ的圖譜，其中α亞基N-端融合有His標(biāo)簽，而β亞基N-和C-端均沒有標(biāo)簽蛋白。圖4是重組后的表達(dá)質(zhì)粒的酶切圖譜，從 A 圖中可以看出pCOLADuet-PheRSα用EcoR I和Hind III雙酶切，獲得載體片段(3.7 kb)與目的基因片段(1.5 kb)。B圖中共表達(dá)質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ用BamH I酶切，獲得片段2.6 kb和4.4 kb，酶切片段的大小與預(yù)期相符。

3.3 PheRS蛋白的表達(dá)及純化

圖1 已成功表達(dá)的PheRSα和PheRSβ的進(jìn)化樹圖譜Fig.1 Phylogenetic tree of PheRSα and PheRSβ that has been expressed successfully.The phylogenetic tree was constructed by the Neighbor-Joining method.Phenylalanyl-tRNA synthetase subunit alpha: Homo sapiens(NP_004452), Saccharomyces cerevisiae(NP_116631), Trypanosoma brucei(XP_829468),Thermococcus kodakarensis (YP_183334), Pyrococcus horikoshii(NP_142612), Methanocal-dococcus jannaschii(NP_247463), Escherichia coli(YP_001458493), Bacillus subtilissubsp (NP_390742), Thermus thermophilus(YP_145224), Phenylalanyl-tRNA synthetase beta chain, Homo sapiens(NP_005678), Saccharomyces cerevisiae(NP_013161),Trypanosoma brucei(XP_828320), Thermococcus kodakarensis(YP_183338), Pyrococcus horikoshii (NP_142611),Methanocal-dococcus jannaschii(NP_248101), Escherichia coli(YP_001458492), Bacillus subtilissubsp(NP_390741),Thermus thermophilus(YP_145225).

圖2 錐蟲PheRS基因的克隆Fig.2 Amplification of PheRS gene from T.brucei genomic DNA by PCR.M: DNA marker; 1: PheRSα gene fragment; 2:PheRSβ gene fragment.

圖3 重組質(zhì)粒pCOLADuet-PheRSαβ的示意圖Fig.3 Schematic map of the recombinant plasmid pCOLADuet-PheRSαβ.

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant expression plasmid by enzyme digestion.(A)Recombinant plasmid pCOLADuet-PheRSα.M: 5000 bp DNA marker; 1: pCOLADuet-PheRSα; 2:pCOLADuet-PheRSα double digested with EcoR I/Hind III.(B)Recombinant plasmid pCOLADuet-PheRSαβ.M: 1 kb DNA marker; 1: pCOLADuet-PheRSαβ; 2: pCOLADuet-PheRSαβ digested with BamH I.

重組表達(dá)質(zhì)粒 pCOLADuet-PheRSαβ轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)RIPlL中，誘導(dǎo)優(yōu)化的結(jié)果表明，重組菌 E.coli [pCOLADuet-PheRSαβ]在 0.01 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下誘導(dǎo)結(jié)果最明顯。因此表明重組菌在0.01 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下、25℃過夜誘導(dǎo)的條件最佳。在此最佳誘導(dǎo)條件下，進(jìn)行了蛋白的大量表達(dá)純化，圖5結(jié)果顯示α亞基(55 kDa)和β亞基(72 kDa)處均有誘導(dǎo)表達(dá)，與預(yù)期值相符。菌體裂解后的上清，采用His-Bind親和色譜柱進(jìn)行了純化，SDS-PAGE分析洗脫結(jié)果后，從圖5中可以看出，通過親和層析純化后，可以得到高純度的重組融合蛋白。經(jīng)凝膠掃描分析，純度可達(dá)90%。

3.4 免疫印跡分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證純化后的目的蛋白，用免疫印跡對純化的蛋白樣品進(jìn)行分析。因?yàn)槿诤系鞍字兄挥笑羴喕鵑端有His-Tag，因此用特異性抗His的一抗來進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定時(shí)，只能出現(xiàn) α亞基大小的條帶。圖6結(jié)果顯示Mr在大約55 kDa處未誘導(dǎo)的菌液中沒有條帶，在IPTG誘導(dǎo)后有條帶出現(xiàn)，純化的蛋白樣品中也有特異性反應(yīng)條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了目的蛋白的正確性。

3.5 酶活性分析

目前還未見任何關(guān)于以布氏錐蟲PheRS為靶點(diǎn)的藥物篩選方法的建立，表達(dá)純化得到的PheRS必需在保證其有活性的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行后續(xù)的藥物篩選工作。本實(shí)驗(yàn)主要用放射性同位素方法來測定酶活性，圖7是20 μL反應(yīng)體積中的酶活性曲線。

圖5 SDS-PAGE分析純化的融合蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified fusion protein.M:protein marker; 1: E.coli [pCOLADuet- PheRSαβ]uninduced;2: E.coli [pCOLADuet-PheRSαβ]induced; 3: supernatant of induced E.coli [pCOLADuet- PheRSαβ]; 4: inclusion body of induced E.coli [pCOLADuet- PheRSαβ]; 5: co-purified α and β subunit.

圖6 重組PheRS蛋白的免疫印跡分析Fig.6 Western blotting analysis for recombinant PheRS.1: E.coli[pCOLADuet-PheRSαβ]uninduced; 2: E.coli [pCOLADuet-PheRSαβ]induced; 3: PheRS after purification(Only α subunit is shown for the lack of His-tag in β subunit).

圖7 放射性同位素法測定PheRS的活性Fig.7 Activity of PheRS measured in radioisotope method.

本實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化后得到的酶可以根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)生成產(chǎn)物[14C]-Phe-tRNA的量來檢測其活性。70 μL總反應(yīng)體積中[14C]標(biāo)記的苯丙氨酸[14C]-Phe的 CPM1值為 559440，經(jīng)[14C]標(biāo)記的產(chǎn)物[14C]-Phe-tRNA產(chǎn)物的CPM2值為3580，背景放射CPM3為 80，初始底物[14C]-Phe 為 0.4662×10?6mmol，純化后的酶稀釋1000倍。根據(jù)公式計(jì)算出提純物每毫升酶單位(U/mL)為7。

根據(jù)以上結(jié)論說明通過本實(shí)驗(yàn)的方法表達(dá)純化出的酶具有活性，因此可以將其作為化合物作用的靶標(biāo)來篩選出抑制劑。

4 討 論

苯丙氨酰 tRNA合成酶是 AaRS中最復(fù)雜的一類酶。目前，已經(jīng)報(bào)道的PheRS的表達(dá)方法主要集中在以下幾種方法：例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PheRS的表達(dá)是通過將α亞基和 β亞基分別克隆入載體，再亞克隆入單啟動子操縱、雙核糖體結(jié)合位點(diǎn)的雙順反子表達(dá)載體后共表達(dá)[8]；人源性線粒體 PheRS直接克隆入表達(dá)載體后進(jìn)行表達(dá)[9-10]；人源性細(xì)胞質(zhì)PheRS的α亞基和β亞基分別克隆入有標(biāo)簽的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)化宿主菌進(jìn)行表達(dá)[11-12]。經(jīng)同源性分析表明，布氏錐蟲的PheRS在同源性上與人源性PheRS最高，因此本實(shí)驗(yàn)借鑒人源性細(xì)胞質(zhì)PheRS的質(zhì)粒構(gòu)建方法，在α亞基N端融合His標(biāo)簽，β亞基N端和C端均沒有融合標(biāo)簽；此外，采用了構(gòu)建重組共表達(dá)載體的方法代替了共轉(zhuǎn)化，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。

原核生物Thermus thermophilus PheRS與同源tRNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，這個(gè)異源四聚體事實(shí)上由兩個(gè)異源二聚體(αβ)組成，而一個(gè)四聚體結(jié)合兩個(gè)tRNA[13]。研究結(jié)果表明αβ異源二聚體由11個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中A1～A3屬于α亞基，B1～B8屬于 β亞基。α亞基的結(jié)構(gòu)域具有催化模塊，一個(gè)螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域直接參與 tRNAPhe結(jié)合的氨?；磻?yīng)；而由一系列結(jié)構(gòu)域組成的β亞基可能與其他蛋白一起發(fā)揮多重作用。整合入 β亞基的“類催化”模塊(B6、B7結(jié)構(gòu)域)、“類DNA結(jié)合”結(jié)構(gòu)域(B1和 B5)、“類 EMAPII”結(jié)構(gòu)域(B2，類似于 AspRS和LysRS的反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、“類SH-3”結(jié)構(gòu)域(B4，參與信號傳導(dǎo)過程)表明了PheRS酶的復(fù)雜的進(jìn)化途徑。細(xì)胞質(zhì)PheRS在進(jìn)化過程中，雖然在原核、真核生物中有差異，但也具有很高的保守性。在目前所有已知的物種中，細(xì)胞質(zhì)PheRS均以(αβ)2四聚體形式存在。這為在體外研究 T.Brucei PheRS的作用提供了依據(jù)。

PheRS由(αβ)2異源四聚體構(gòu)成，其活性位點(diǎn)主要位于α亞基，tRNA結(jié)合位點(diǎn)分布在α亞基和β亞基上，二者結(jié)構(gòu)完整時(shí)PheRS才能發(fā)揮其催化作用[14]。因此用同位素進(jìn)行酶活性測定時(shí)是α亞基和β亞基形成的復(fù)合物的活性。用免疫印跡驗(yàn)證純化出的蛋白時(shí)，選用抗α亞基N端His標(biāo)簽的抗體，因此只顯示一條帶。在蛋白表達(dá)純化時(shí)的結(jié)果顯示在55 kDa(α亞基)和72 kDa(β亞基)處均有目的蛋白出現(xiàn)，并且在酶活性測定時(shí)通過放射性同位素方法測出了提純物每毫升酶單位(U/mL)為7。本研究首次成功表達(dá)純化得到了布氏錐蟲亮氨酰-tRNA合成酶，并對其進(jìn)行了活性測定，這為以苯丙氨酰tRNA合成酶為靶點(diǎn)進(jìn)行抗寄生蟲藥物篩選，為下一步構(gòu)建苯丙氨酰-tRNA合成酶藥物篩選模型，進(jìn)而篩選對酶有抑制活性的化合物奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Cloning, expression, purification and activity assay of Trypanosoma brucei phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli

Ying Yao, Guangwei Gao, and Dawei Li
School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

Received:August 7, 2009;Accepted:November 2, 2009

Corresponding author:Dawei Li.Tel: +86-21-34204744; Fax: +86-21-34205436; E-mail: daweili@sjtu.edu.cn