王翠，李環(huán)，王欽琪，韋萍

南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009

pH 值對(duì)沼液培養(yǎng)的普通小球藻生長(zhǎng)及油含量積累的影響

王翠，李環(huán)，王欽琪，韋萍

南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009

以 50%的沼液為普通小球藻的全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)基的起始 pH值對(duì)小球藻生長(zhǎng)及油脂含量的影響，普通小球藻對(duì)不同初始pH的沼液中氮、磷的去除情況。設(shè)定了2組實(shí)驗(yàn)，一組只調(diào)節(jié)初始接種培養(yǎng)液的pH，分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；另一組將培養(yǎng)液pH分別固定在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，pH用稀HCl和NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)在pH 6.5和pH 7.0的偏酸環(huán)境有利于小球藻生長(zhǎng)，而pH在7.0～8.5的偏堿性條件下有利于小球藻油脂的積累，因此綜合小球藻生長(zhǎng)和油脂積累2個(gè)因素，得到最適合小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的pH為7.0。培養(yǎng)結(jié)束后沼液中氮磷的去除率分別達(dá)到了95%和97%，沼液中的總氮由原來(lái)的134.91 mg/L降至4.86 mg/L，總磷由10.19 mg/L降到0.32 mg/L。

普通小球藻，pH，沼液，油脂

Abstract:Using 50% biogas slurry as basic medium, we investigated the effect of pH on the growth and lipid accumulation ofChlorella vulgaris.Setting two-group experiments, one was only control the initial medium pH, the initial pH was set at 6.0, 6.5, 7.0,7.5, 8.0, and 8.5, respectively.One was control the medium pH constant, set constant pH at 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.5,respectively.Using HCl and NaOH regulated the pH.Results showed that algaeChlorella vulgarisgrows better at pH 6.5 and 7.0,accumulate the lipid at pH 7.0?8.5, so the optimal pH for the growth and the lipid accumulation ofChlorella vulgariswas 7.0.The average removal rate of nitrate from biogas slurry was 95%, phosphate was 97%.

Keywords:Chlorella vulgaris, pH, biogas slurry, lipid

隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人類對(duì)能源的需求量越來(lái)越大，而地球上化石能源儲(chǔ)量有限，且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，以儲(chǔ)量豐富且環(huán)境友好的生物質(zhì)能源代替化石能源已成為解決能源危機(jī)的主要途徑之一[1]。在各種形式的生物質(zhì)能源中，富油品系的自養(yǎng)型微藻由于可吸收大氣中 CO2、油脂含量較高且營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單而備受關(guān)注[2-4]。但目前看來(lái)，微藻生物質(zhì)能存在藻源受限的問(wèn)題，即微藻大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)尚處在摸索階段，如適應(yīng)于各種藻類的光生物反應(yīng)器需研制開(kāi)發(fā)或改進(jìn)，大規(guī)模培養(yǎng)微藻時(shí)存在易染雜菌雜藻、微藻光合作用效率低、培養(yǎng)基成本高等問(wèn)題，制約了微藻生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。發(fā)展微藻生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)，當(dāng)務(wù)之急是開(kāi)發(fā)優(yōu)良品系富油微藻及降低微藻培養(yǎng)成本。

利用廢棄生物質(zhì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣是另一種清潔型生物質(zhì)能源的形式，發(fā)酵副產(chǎn)物沼液和沼渣通常直接排放入水體或填埋。由于沼液中含有豐富的氮、磷等物質(zhì)，大量的沼液直接排放會(huì)引起河流的富營(yíng)養(yǎng)化，造成水體的污染，已被環(huán)保部門勒令停止，故沼液的后處理問(wèn)題已成為當(dāng)前沼氣生產(chǎn)廠家急需解決的問(wèn)題，甚至部分廠家為此而停產(chǎn)。

為解決沼氣發(fā)酵的廢液排放及微藻的培養(yǎng)基成本問(wèn)題，本文以富油小球藻為實(shí)驗(yàn)藻株，以國(guó)家生化工程中心沼氣發(fā)酵的廢液為培養(yǎng)基篩選并馴化適應(yīng)于該沼液的富油小球藻，創(chuàng)見(jiàn)性地將沼氣發(fā)酵和微藻培養(yǎng)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，結(jié)果經(jīng)過(guò)幾個(gè)星期的馴化并篩選后，該小球藻可適應(yīng)沼液的培養(yǎng)環(huán)境正常生長(zhǎng)并積累油脂，小球藻吸收利用后的沼液氮磷指標(biāo)也達(dá)到了直接排放的標(biāo)準(zhǔn)。本研究主要報(bào)道了沼液pH值對(duì)小球藻生長(zhǎng)產(chǎn)油及沼液氮磷去除率的綜合影響，為小球藻的規(guī)?；囵B(yǎng)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)用的小球藻為普通小球藻Chlorella vulgaris，由暨南大學(xué)張成武教授提供。

1.1.2 沼液培養(yǎng)基

沼液來(lái)自南京工業(yè)大學(xué)國(guó)家生化工程中心沼氣罐沼氣發(fā)酵后的廢液，初始pH值在9.0～9.5之間。沼液經(jīng)過(guò)靜置、沉淀后，紗布抽濾去除顆粒懸浮物，以自來(lái)水稀釋到 25%、50%、75%、100%濃度，并以HCl或NaOH調(diào)制成pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的沼液培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后備用。

1.1.3 培養(yǎng)裝置

實(shí)驗(yàn)中所采用的培養(yǎng)裝置為自行設(shè)計(jì)的柱狀光合生物反應(yīng)器，內(nèi)管徑為3 cm，管長(zhǎng)度為55 cm，厚度為0.3 cm，裝液量300 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微藻的培養(yǎng)

將新鮮活化后的藻種接種到不同 pH的沼液培養(yǎng)基，使起始OD680值為1.0左右。光照強(qiáng)度為4 800 lux，光照：光暗周期為18 h∶6 h，溫度25℃左右，通入空氣培養(yǎng)，每天定時(shí)測(cè)定pH值變化，并且用稀鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，每天取樣測(cè)定OD680值。

1.2.2 生物量的測(cè)定

濁度法：取小球藻藻液，測(cè)定其在680 nm下的光密度值(OD680)以此衡量小球藻相對(duì)生長(zhǎng)量。

干重法：收集穩(wěn)定期的藻液，10 000 r/min離心后取沉淀，洗滌去除表面吸附雜質(zhì)后60℃烘至恒重，稱重。

1.2.3 培養(yǎng)液中氮磷含量的測(cè)定

總氮的測(cè)定采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法，參照GB11894-89[5]。總磷的測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法，參照GB11893-89[6]。

1.2.4 油脂的提取方法[7]

稱取0.1 g干藻粉，加入含有10%二甲基亞砜的甲醇溶液在 40℃～70℃水浴提取 30 min，然后吸去上清，下層的藻泥中加入乙醚和正己烷(1∶1，V/V)提取 1 h。按照上述步驟反復(fù)提取直至藻粉完全變白，合并各步上清，使得上清液中甲醇∶乙醚∶正己烷∶水的體積比為1∶1∶1∶1，放入分液漏斗中靜置分層，吸取上層，氮?dú)獯蹈?，剩余為油脂?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 沼液濃度的選取

高濃度沼液所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，但沼液本身具有一定的濁度，濁度太高不利于光的透過(guò)，對(duì)小球藻的光合作用率有負(fù)面影響，而濃度太低所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也有限，不利于微藻的生長(zhǎng)，適合于微藻生長(zhǎng)的沼液濃度培養(yǎng)基由這兩方面因素綜合決定。

將不同濃度沼液培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至7.0，接種馴化培養(yǎng)基中保存的藻種，初始生物量OD680皆為1.2，裝液量皆為300 mL，以日光燈為光源16∶8光暗培養(yǎng)，每天取樣測(cè)定680 nm下的吸光值，考察小球藻在不同濃度的沼液培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 沼液濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different biogas slurry concentrations on the growth ofChlorella vulgaris.

可以看出，小球藻在不同濃度沼液中表現(xiàn)出的生長(zhǎng)規(guī)律不盡相同。在25%沼液濃度培養(yǎng)基中小球藻快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在50%以上的沼液培養(yǎng)基中需較長(zhǎng)的延滯期才可以適應(yīng)生長(zhǎng)。小球藻在不同濃度沼液中表現(xiàn)出的生長(zhǎng)差異與沼液本身的濁度及其所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。25%濃度沼液的濁度較低，光的透過(guò)率好，故最先進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但是25%沼液濃度中營(yíng)養(yǎng)成分含量較少，所以小球藻很快進(jìn)入穩(wěn)定期。75%和100%濃度的沼液濁度較高，光的透過(guò)率較低，小球藻的光合作用較弱，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)不利。綜合考慮生物量、生長(zhǎng)速率及生長(zhǎng)周期，選定50%濃度沼液為小球藻生長(zhǎng)的全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

2.2 不同pH值條件對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基的 pH值會(huì)影響光合作用中 CO2的可用性，在呼吸作用中影響微藻對(duì)有機(jī)碳源的利用效率，同時(shí)由于pH值直接影響細(xì)胞膜的滲透性，會(huì)影響微藻細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液中離子的吸收和利用，以及代謝產(chǎn)物的再利用性和毒性，故pH值是影響藻類生長(zhǎng)代謝的重要因子之一[8-11]。小球藻喜歡弱堿性(pH 7.2～8.2)，但是弱酸性(pH 5.8～6.8)的水中也能生活和繁殖[9]。以pH計(jì)測(cè)得50%沼液培養(yǎng)基的pH在 9.0左右。用10%的鹽酸將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在培養(yǎng)過(guò)程中設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)，一組pH只調(diào)一次為初始pH組，另一組在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)用稀鹽酸或稀堿調(diào)節(jié) pH，使pH值相對(duì)穩(wěn)定在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，稱為固定pH組?？疾?0%濃度沼液培養(yǎng)基的pH值對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響(圖2)。

圖2 不同pH條件對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different pH values on growth ofChlorella vulgaris.

圖2中空心圖標(biāo)為不同初始pH組小球藻的生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定生物量的同時(shí)測(cè)定了培養(yǎng)基pH值的變化，發(fā)現(xiàn)初始pH為6.0的培養(yǎng)液在第4天pH降到4.8，這解釋了pH 6.0的藻細(xì)胞生長(zhǎng)較差的原因。經(jīng)過(guò)6 d的適應(yīng)性馴化后少量藻細(xì)胞存活下來(lái)并開(kāi)始生長(zhǎng)，到第10天時(shí)pH回升為5.5，并最終穩(wěn)定在5.5。初始pH 6.5培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在6.0左右，其他不同初始pH的培養(yǎng)液最終pH降到7.0左右并保持穩(wěn)定。

可見(jiàn)在小球藻的生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液的pH變化較大，只要初始pH對(duì)藻不產(chǎn)生很大毒害，使其不能生長(zhǎng)，小球藻會(huì)在生長(zhǎng)過(guò)程中因?yàn)樽陨砩泶x活動(dòng)會(huì)降低生活環(huán)境的pH，改變后的pH有可能已偏離該藻的最佳生長(zhǎng)范圍，所以只調(diào)初始pH不能正確反映小球藻適宜生長(zhǎng)的pH范圍，有必要固定pH，使藻在生長(zhǎng)過(guò)程中一直處于設(shè)定的pH條件下。觀察固定pH對(duì)藻細(xì)胞的影響，結(jié)果如圖2中實(shí)心圖標(biāo)所示。

固定pH組在pH 6.0和pH 6.5的弱酸性條件下小球藻最快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，pH 6.0的藻細(xì)胞第 5天到達(dá)穩(wěn)定期，此后至培養(yǎng)結(jié)束一直處于穩(wěn)定期的狀態(tài)。這說(shuō)明在pH 6.0的條件下小球藻能夠存活，但是此pH不利于小球藻的進(jìn)一步分裂代謝。pH 8.0和 pH 8.5的堿性條件下藻細(xì)胞沒(méi)有增殖便大量死亡，少量存活的細(xì)胞經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)的一段期在第7天時(shí)開(kāi)始增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。pH 7.5的弱堿性環(huán)境小球藻經(jīng)過(guò)較短延滯期后在第 4天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。整體說(shuō)來(lái)，pH 6.5～7.0的微酸性或酸性環(huán)境較適宜小球藻的生長(zhǎng)代謝。

比較只調(diào)初始pH組和固定pH組，可以發(fā)現(xiàn)兩種pH條件下藻的生長(zhǎng)規(guī)律并不相同，固定pH條件下藻的生長(zhǎng)優(yōu)于只調(diào)初始pH條件。

2.3 不同 pH 條件對(duì)普通小球藻生物量和油脂含量的影響

不同pH對(duì)小球藻生物量的影響見(jiàn)表1，結(jié)果表明 pH為6.0時(shí)小球藻生物量最低，一直調(diào)節(jié)pH使其穩(wěn)定在6.0左右的培養(yǎng)組的生物量要高于初始pH為6.0的培養(yǎng)組，前者生物量為1.3116 g/L，后者為0.8312 g/L。從表1中可以看到除pH為6.5和7.0外，其他pH條件下，在培養(yǎng)過(guò)程中固定pH組的生物量均高于只調(diào)初始pH組。小球藻的生物量在pH為6.5時(shí)最高，達(dá)到2.6935 g/L。

表1 不同pH條件對(duì)小球藻生物量和油脂含量的影響比較Table 1 Comparison with different pH values for the biomass and lipid content of Chlorella vulgaris

從表1可以看到，培養(yǎng)過(guò)程中固定pH組的油脂含量均高于只調(diào)節(jié)初始pH組，并且偏堿性的環(huán)境有利于油脂的積累。固定pH組油脂含量最高的是pH 8.0和pH 8.5均達(dá)到了49%，pH為7.0和7.5培養(yǎng)的小球藻油脂含量均達(dá)到了47%，pH為6.0和6.5培養(yǎng)的小球藻油脂含量也在40%左右。而只調(diào)節(jié)初始pH組最高油脂含量在pH 8.0為39.9%。這說(shuō)明固定的pH對(duì)小球藻油脂含量的積累有益，綜合pH對(duì)小球藻生物量的影響來(lái)看，小球藻最適生長(zhǎng)和油脂積累的pH為7.0。

2.4 小球藻對(duì)沼液培養(yǎng)基中氮磷的去除

小球藻喜歡氮磷化合物比較豐富的水，F(xiàn)ritch等學(xué)者認(rèn)為綠球藻目(Chlorococales)的許多類群，包括小球藻等屬的種類都具有明顯的營(yíng)腐生生活的傾向，因此，小球藻在富含有機(jī)質(zhì)的污水中均能大量生長(zhǎng)[8-9]。沼液中含有豐富的有機(jī)質(zhì)、腐殖酸、氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分及氨基酸、維生素、酶、微量元素等生命活性物質(zhì)。其中富營(yíng)養(yǎng)化元素氮磷含量豐富，如果直接排放會(huì)造成水體二次污染[10-12]。小球藻藻生長(zhǎng)過(guò)程中可吸收利用沼液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而達(dá)到降低沼液中氮磷等主要污染指標(biāo)而達(dá)到處理廢水的目的。經(jīng)過(guò)測(cè)定 50%沼液培養(yǎng)基中總磷的初始含量為 10.19 mg/L，總氮的初始含量為134.91 mg/L。

實(shí)驗(yàn)沼液培養(yǎng)基中的磷含量較低，培養(yǎng) 2 h后培養(yǎng)液中磷的利用率達(dá)到了70%～80%，培養(yǎng)到72 h時(shí)，培養(yǎng)液中磷含量已經(jīng)降到0.642 mg/L，小球藻對(duì)磷的利用率已經(jīng)達(dá)到了95%，培養(yǎng)結(jié)束后沼液中磷含量降低至0.32 mg/L，小球藻對(duì)磷的利用率達(dá)到97%。

不同初始 pH條件下小球藻對(duì)沼液培養(yǎng)基中氮的吸收利用情況見(jiàn)圖3，培養(yǎng)1 d后培養(yǎng)液中氮的利用率達(dá)到56.4%～71.2%，培養(yǎng)結(jié)束后除初始pH為6.0的培養(yǎng)液中氮含量降為19.12 mg/L小球藻對(duì)氮的利用率為86%以外，其他培養(yǎng)液中小球藻對(duì)氮的利用率均達(dá)到 95%左右，培養(yǎng)液中的含氮量降為4.86 mg/L。這說(shuō)明小球藻可以很好地去除沼液中的氮和磷，使沼液的最終排放達(dá)到了污水排放標(biāo)準(zhǔn)水平[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同初始 pH對(duì)培養(yǎng)液中磷的吸收影響不大，這與沼液培養(yǎng)基中磷的含量低有一定關(guān)系。對(duì)氮的影響只有初始pH為6.0的培養(yǎng)液氮的利用率為86%，其他都達(dá)到95%左右，這也與不同初始pH條件下小球藻的生長(zhǎng)情況有關(guān)。

圖3 pH對(duì)普通小球藻氮源吸收的影響Fig.3 Effect of pH on the nitrate absorption ofChlorella vulgaris.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度沼液培養(yǎng)小球藻和不同pH值條件下利用沼液培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)狀況和油脂含量的積累情況，以及在不同pH條件下小球藻對(duì)沼液中氮磷的去除作用。研究結(jié)果表明，50%濃度的沼液最適合小球藻生長(zhǎng)，此外小球藻在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)引起培養(yǎng)液中的pH變化，使培養(yǎng)液的pH偏酸。為了進(jìn)一步了解pH對(duì)小球藻生物量和油脂的影響，進(jìn)行了不同固定pH培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：小球藻最適宜生物量積累的 pH為 6.5～7.0，油脂含量方面，固定pH組小球藻的油脂含量明顯高于只調(diào)初始培養(yǎng)液pH組培養(yǎng)的小球藻，固定pH組小球藻油脂均在40%以上，最高達(dá)49%，pH 7.0時(shí)小球藻油脂含量達(dá)47%。因此得出最適小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的pH為7.0。

不同初始 pH條件下培養(yǎng)的小球藻對(duì)沼液中氮磷均有很好的去除作用，培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液中總磷由10.19 mg/L降到0.32 mg/L，小球藻對(duì)磷的利用率達(dá)到 97%，培養(yǎng)液中總氮由初始含量 134.91 mg/L降至4.86 mg/L，小球藻對(duì)氮的利用率達(dá)到95%。經(jīng)過(guò)小球藻的利用后沼液中的富營(yíng)養(yǎng)化元素氮和磷含量大大降低，使得沼液的排放達(dá)到了污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)[13]，防治了環(huán)境污染。

因此，利用沼液培養(yǎng)小球藻不但降低了微藻生物柴油的生產(chǎn)成本，還凈化了沼液大大去除了沼液中的富營(yíng)養(yǎng)化元素氮和磷。但是沼液中的營(yíng)養(yǎng)成分畢竟有限，沼液培養(yǎng)的小球藻生物量較低，若要提高生物量還要對(duì)沼液成分進(jìn)行優(yōu)化，這些將在接下來(lái)的試驗(yàn)中進(jìn)行研究。

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Effect of pH on growth and lipid content of Chlorella vulgaris cultured in biogas slurry

Cui Wang, Huan Li, Qinqi Wang, and Ping Wei
College of Biotechnology and Pharmaceutical Engneering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China

Received:December 2, 2009;Accepted:April 13, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB724702), Nanjing University of Technology Discipline Funds(No.39708010).

Corresponding author:Huan Li.E-mail: lihuan45678@163.com國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2009CB724702)，南京工業(yè)大學(xué)學(xué)科基金(No.39708010)資助。