林金濤，沈宏偉，張澤會，胡翠敏，靳國杰，譚海東，趙宗保,2

1 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023 2 大連潔凈能源國家實驗室(籌)，大連 116023 3 中國科學院研究生院，北京 100049

圓紅冬孢酵母兩階段培養(yǎng)法生產(chǎn)微生物油脂

林金濤1,3，沈宏偉1，張澤會1,3，胡翠敏1,3，靳國杰1,3，譚海東1，趙宗保1,2

1 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023 2 大連潔凈能源國家實驗室(籌)，大連 116023 3 中國科學院研究生院，北京 100049

為縮短發(fā)酵時間，減少原料消耗，采用細胞增殖和油脂積累分離的兩階段模式，培養(yǎng)圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloidesAS 2.1389生產(chǎn)微生物油脂。結(jié)果表明，細胞增殖階段獲得的R.toruloidesAS 2.1389細胞，重懸接種在葡萄糖溶液中，可快速積累油脂，菌體油脂含量超過自身干重的55%。增殖階段細胞的菌齡越高，產(chǎn)油能力越強。油脂積累階段使用高濃度葡萄糖溶液或未滅菌的葡萄糖溶液，油脂合成可以有效進行。油脂中脂肪酸成分以含16和18個碳原子的長鏈脂肪酸為主，可作為制備生物柴油的新型原料。

產(chǎn)油酵母，兩階段培養(yǎng)，微生物油脂，生物柴油

Abstract:To shorten the cultivation time and reduce the consumption of raw materials for microbial lipid production, oleaginous yeastRhodosporidium toruloidesAS 2.1389 was cultivated using a two-stage culture mode, in which the cell propagation and lipid accumulation were separated.The yeast cells recovered from the propagation culture were re-suspended in glucose solution for lipid accumulation, through which lipid content over 55% of the dry cell weight was achieved, the longer the propagation stage was, the higher the lipid content.Analysis of the lipid indicated that the long-chain fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were major components, suggesting that the lipid can be an alternative feedstock for biodiesel production.

Keywords:oleaginous yeast, two-stage culture, microbial lipid, biodiesel

當前化石資源日益枯竭，社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展面臨能源和環(huán)境的雙重壓力，世界各國大力發(fā)展可再生燃料。生物柴油具有與普通柴油相近的性質(zhì)，受到高度關(guān)注，在國外已有一定規(guī)模的應(yīng)用。目前用于生物柴油生產(chǎn)的原料主要是動植物油脂。但以動植物油脂生產(chǎn)生物柴油面臨成本高、原料總量缺口大、供給季節(jié)性強等不利于規(guī)模化生產(chǎn)的突出問題[1-2]。

微生物油脂，又稱單細胞油脂，是由酵母、霉菌和細菌等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的油脂[3]。自然界中一些產(chǎn)油微生物在碳源充足而其他營養(yǎng)成分(通常為氮源)缺乏情況下，可以在胞內(nèi)大量積累油脂，甚至達到自身干重60%以上[4]。產(chǎn)油真菌積累油脂過程中可在胞內(nèi)形成一個或多個油脂顆粒[4-6]。與傳統(tǒng)油脂生產(chǎn)相比，微生物油脂生產(chǎn)有許多優(yōu)點：能連續(xù)規(guī)?；a(chǎn)；周期短；所需原料豐富、價格便宜、并可利用工農(nóng)業(yè)廢棄物；不受季節(jié)、氣候變化限制；可利用細胞誘變、融合及基因工程等技術(shù)改良菌種等[7]。

在以往的實驗中，產(chǎn)油微生物培養(yǎng)通常采用一步法，即細胞增殖和油脂積累在同一醪液中進行。在培養(yǎng)初期階段，細胞快速增殖；中期及后期細胞增殖減慢，油脂合成仍然活躍，導致胞內(nèi)油脂過量積累。Hall等[8]報道了一種兩階段培養(yǎng)方法，但第一階段得到的產(chǎn)油酵母Candida107菌液按37.5%(V/V)的比例直接泵入第二階段，大量殘余營養(yǎng)成分、無機鹽(尤其是 NH4+)及代謝產(chǎn)物帶入到第二階段。因此，細胞在第二階段經(jīng)歷的生長環(huán)境變化仍然類似于常見的一步法，即細胞增殖和油脂積累過程伴隨進行。

本文采用細胞增殖和油脂積累分離的兩階段模式，培養(yǎng)圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloidesAS 2.1389，生產(chǎn)微生物油脂。細胞增殖階段，使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，快速擴增菌體；油脂積累階段，使用無額外營養(yǎng)物的葡萄糖溶液，在胞內(nèi)積累油脂。

1 材料與方法

1.1 菌株

圓紅冬孢酵母菌Rhodosporidium toruloidesAS 2.1389購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，調(diào)pH 6.0；斜面培養(yǎng)基在YEPD基礎(chǔ)上加入瓊脂粉20 g/L；油脂合成培養(yǎng)基：不同濃度的葡萄糖溶液。

1.3 培養(yǎng)方法

采用兩階段發(fā)酵模式：第一階段于YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以菌體生長為主；第二階段于葡萄糖溶液中，進行油脂合成。

1)菌體生長階段：將新鮮斜面上的圓紅冬孢酵母菌接種于含50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。

2)菌體收集：取 0.5 mL菌液用血球記數(shù)板記數(shù)(包括芽體)。取含 5×109個細胞的菌液離心，棄上清。其中2份樣品離心洗滌2次。

3)油脂合成階段：將菌體用葡萄糖溶液重懸，接種于葡萄糖溶液中培養(yǎng)，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。

如無特別說明實驗在250 mL搖瓶中進行，第一階段培養(yǎng)36 h，第二階段在40 g/L葡萄糖溶液中培養(yǎng)48 h。所有數(shù)據(jù)均為2個平行樣的均值。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

發(fā)酵液離心去上清，收集沉淀，加入蒸餾水離心洗滌2次，于105℃烘至恒重，以g干菌體/L發(fā)酵液表示菌體生物量[9]。

1.4.2 油脂提取

采用酸熱法，以g油/L發(fā)酵液表示油脂量，油脂含量為油脂量占生物量的質(zhì)量百分數(shù)[2]。

1.4.3 殘?zhí)菧y定

采用山東省科學院生產(chǎn)的SBA-50B生物傳感分析儀進行葡萄糖測定[9]。

1.4.4 油脂脂肪酸組成分析

按文獻報道的方法對油脂脂肪酸進行甲酯化[9]。得到的樣品利用GC 7890型氣相色譜儀進行分析。色譜條件為：FFAP石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)；進樣器溫度 250℃；進樣量 0.2 μL；載氣N241 mL/min，檢測器(FID)溫度 280℃；H233 mL/min，空氣100 mL/min；柱溫190℃；分流進樣。脂肪酸通過對照標準樣品定性，采用面積歸一法確定相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩階段培養(yǎng)法生產(chǎn)油脂

R.toruloidesAS 2.1389在YEPD培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h后，離心收集細胞，其中2個樣品加入5 mL蒸餾水離心洗滌 2次，重懸后，于葡萄糖溶液中培養(yǎng)48 h。結(jié)果離心洗滌樣品的耗糖量、生物量和菌體油脂含量分別為21.0 g/L、9.1 g/L和58.6%；未離心洗滌的對照組耗糖量、生物量和菌體油脂含量分別為26.5 g/L、11.0 g/L和59.0%。離心洗滌組的耗糖量和生物量明顯低于對照組；但兩者油脂含量相差很小。因此，推測離心洗滌樣品的油脂合成能力與對照組相當，只是離心洗滌操作時由于反復離心、重懸過程中細胞有所損失，導致耗糖量和生物量偏低。

在營養(yǎng)缺乏的情況下，細胞通過自體吞噬將細胞內(nèi)的大分子降解為游離態(tài)的核苷酸、氨基酸和脂肪酸等。氮源匱乏而葡萄糖存在的條件下，酵母細胞發(fā)生強烈的自體吞噬，細胞質(zhì)及細胞器均可被降解成小分子，用于提供能量或/和維持必要的大分子合成[10]?？梢娭竞铣傻南薜獥l件也可能誘導細胞自體吞噬。并且圓紅冬孢酵母可以積累超過自身干重70%以上的油脂，并形成2個或多個油脂顆粒[11]；油脂顆粒幾乎可以占據(jù)整個細胞，而胞質(zhì)的其他部分則很少。顯然，油脂顆粒形成的過程中，需要大規(guī)模的細胞質(zhì)重構(gòu)。最近對脂肪細胞和肝細胞的研究表明，自體吞噬缺陷導致脂肪合成及脂肪顆粒形成均被強烈抑制[12]。當多次離心洗滌后，發(fā)酵液中所含有的營養(yǎng)物質(zhì)及其他復雜成分幾乎都被去除，所以細胞需要靠自體吞噬分解部分細胞質(zhì)成分，為油脂合成提供必要的中間分子，從而保證了油脂合成的進行；與此同時可以為油脂顆粒形成提供足夠的空間。

盡管產(chǎn)油酵母細胞均可合成油脂，但是其合成過程、調(diào)節(jié)機制、油脂顆粒的形成以及與其他細胞器相互關(guān)系所知甚少[13-14]。理想的研究油脂合成的模型是用不含有細胞的酶反應(yīng)系統(tǒng)。另一個較好的模型是用重懸的細胞體系[15]，即細胞經(jīng)過離心洗滌、重懸在葡萄糖溶液中進行油脂合成的兩階段培養(yǎng)法可成為研究油脂合成的模型。

2.2 菌齡對油脂積累的影響

細胞在YEPD培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、30、36 h。細胞收集后，于40 g/L葡萄糖溶液中培養(yǎng)48 h。結(jié)果顯示：生物量、油脂含量隨菌齡的增大而增加，殘?zhí)橇侩S菌齡的增大而降低(表 1)，表明菌齡越大細胞利用葡萄糖合成油脂的能力越強。但不同菌齡細胞油脂含量沒有明顯差別均超過 52%。研究發(fā)現(xiàn)隨著菌齡增加，釀酒酵母細胞的大小也隨之增大[16-17]。我們對油脂積累之前樣品的生物量測定也發(fā)現(xiàn)隨著菌齡的增大，細胞生物量(5×109個細胞)也隨之增加。因此不同菌齡的細胞可能具有不同的細胞大小，導致底物消耗量和油脂積累量不同。

表1 菌齡對R.toruloides AS 2.1389積累油脂的影響Table 1 Effects of cell age on lipid accumulation by R.toruloides AS 2.1389

2.3 葡萄糖溶液中R.toruloides AS 2.1389油脂積累的動力學

菌齡36 h的R.toruloidesAS 2.1389細胞于40 g/L葡萄糖溶液中培養(yǎng)。殘?zhí)橇侩S時間下降，生物量、油脂量、含油量隨時間增加。84 h后葡萄糖耗盡，生物量、油脂量和菌體油脂含量均達到最高值，分別為13.5 g/L、8.2 g/L和60.5%(圖1)?？梢?，底物平均消耗速率為0.476 g/(L·h)，油脂平均生產(chǎn)速率為0.097 g/(L·h)。葡萄糖消耗曲線和油脂積累曲線近似成直線，說明整個過程中細胞利用葡萄糖和積累油脂的能力并沒有發(fā)生明顯降低。

圖1 葡萄糖溶液中R.toruloides AS 2.1389積累油脂的動力學曲線Fig.1 Time courses of lipid accumulation byR.toruloidesAS 2.1389 in glucose solution.

2.4 初始糖濃度對油脂積累的影響

為了揭示初始糖濃度對油脂積累的影響，在初始葡萄糖濃度為 40、60、80、100、120、150及180 g/L的溶液中培養(yǎng)R.toruloidesAS 2.138。48 h后，實驗結(jié)果如圖2所示。生物量、油脂量、菌體油脂含量隨糖濃度的增加而緩慢減少。在40 g/L葡萄糖溶液中生物量、油脂量最高，分別達到11.6 g/L和6.1 g/L；在120 g/L葡萄糖溶液中生物量、油脂量分別為10.2 g/L，5.3 g/L；而在180 g/L葡萄糖溶液中生物量、油脂量最低，分別為8.3 g/L和4.2 g/L。結(jié)果表明在高糖溶液中仍然能夠快速積累油脂。但當糖濃度過高時抑制作用比較明顯，與以前的研究結(jié)果一致[9]。值得一提的是在深黃被孢霉、發(fā)酵性絲孢酵母的研究中也發(fā)現(xiàn)了高糖抑制油脂積累的現(xiàn)象[18-19]。其可能的原因是高濃度的糖導致高滲透壓和低水活度，從而抑制細胞油脂合成[19]。

圖2 糖濃度對R.toruloides AS 2.1389油脂積累的影響Fig.2 Effects of initial glucose concentration on lipid accumulation byR.toruloidesAS 2.1389.

2.5 在未滅菌的葡萄糖溶液中積累油脂

在未滅菌的葡萄糖溶液中培養(yǎng)48 h，細胞的生物量、油脂量和菌體油脂含量分別為 11.0 g/L、6.1 g/L和55.4%，與對照組相當(表2)。結(jié)果說明在重懸培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中所含微生物細胞對油脂合成的影響不明顯。

在發(fā)酵生產(chǎn)中染菌可能降低總體生產(chǎn)水平，嚴重時使發(fā)酵陷于癱瘓。同時染菌還對環(huán)境造成污染。防止雜菌污染是發(fā)酵過程中的一項重要工作內(nèi)容[20]。采用兩階段培養(yǎng)模式，由于菌體增殖階段得到的細胞經(jīng)過了離心分離，細胞接種到無額外營養(yǎng)物的葡萄糖溶液中，環(huán)境中營養(yǎng)成分貧乏，雜菌難以生長。在乙醇發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，當釀酒酵母接種量達到3×107個/mL時，不論是否感染雜菌，對發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響都不大。提高酵母菌接種量，可以有效抑制其他雜菌的生長和代謝[21]。在我們的實驗中R.toruloidesAS 2.1389細胞接種濃度高達1×108個/mL，故可以有效降低雜菌影響。因此可以降低染菌危害，節(jié)省滅菌所消耗的能量。

表2 在未滅菌的葡萄糖溶液中R.toruloides AS 2.1389積累油脂Table 2 Lipid accumulation by R.toruloides AS 2.1389 in non-sterile glucose solution

2.6 細胞密度對油脂積累的影響

于40 g/L葡萄糖溶液中接種R.toruloidesAS 2.1389，至細胞密度分別達到0.5×108個/mL、1×108個/mL、2×108個 /mL、 3×108個 /mL、4×108個/mL、5×108個/mL 和6×108個/mL，培養(yǎng)48 h。結(jié)果顯示(圖3)，含油量隨細胞密度的增加而減少，當密度為0.5×108個/mL時含油量最高達到61.3%，當密度達到6×108個/mL時含油量最低僅為14.3%，表明油脂合成能力隨細胞密度的升高而下降。

圖3 細胞密度對R.toruloides AS 2.1389油脂積累的影響Fig.3 Effects of cell density on lipid accumulation byR.toruloidesAS 2.1389.

高密度培養(yǎng)能夠提高產(chǎn)量，減少雜菌污染的風險。但同時也有多種缺點，如：底物抑制、代謝副產(chǎn)物抑制、氧氣供給不足和二氧化碳的高溶解率等[22]。油脂合成需要消耗氧氣，搖瓶發(fā)酵氧氣傳遞效率低，氧氣供應(yīng)不足。因此，提高發(fā)酵密度后，R.toruloidesAS 2.1389細胞可能處于低氧環(huán)境，限制了油脂合成速度。

2.7 油脂脂肪酸組成分析

采用氣相色譜對R.toruloidesAS 2.1389菌油的典型樣品進行脂肪酸組成分析。結(jié)果表明，樣品中含有棕櫚酸(35.9%)、棕櫚油酸(3.6%)、硬脂酸(5.5%)油酸(52.4%)、亞油酸(1.3%)及少量未知脂肪酸(1.4%)?？傮w上看，菌油脂肪酸組成與以前報道的結(jié)果相似，可用作生物柴油和油脂化工行業(yè)的原料[9,23]。

3 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)Rhodosporidium toruloidesAS 2.1389細胞可以在無額外營養(yǎng)物的葡萄糖溶液保持油脂積累活性，菌體油脂含量可超過細胞干重的55%。在此基礎(chǔ)上建立了細胞增殖和油脂積累分離的兩階段油脂生產(chǎn)模式。該培養(yǎng)模式下由于菌體生長與油脂合成分步進行，為進一步開展過程優(yōu)化，降低微生物油脂生產(chǎn)成本提供了新方向。在油脂積累階段，由于幾乎沒有菌體增殖行為，代謝活動可能主要與油脂合成相關(guān)，為研究產(chǎn)油微生物脂肪代謝提供很好的模型。

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科學出版社科學出版中心生命科學分社新書推介

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Journals.im.ac.cn

Microbial lipid production by Rhodosporidium toruloides in a two-stage culture mode

Jintao Lin1,3, Hongwei Shen1, Zehui Zhang1,3, Cuimin Hu1,3, Guojie Jin1,3, Haidong Tan1,and Zongbao K.Zhao1,2
1 Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China 2 Dalian National Laboratory for Clean Energy, Dalian 116023, China 3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Received:May 21, 2010;Accepted:June 18, 2010

Corresponding author:Zongbao K.Zhao.Tel/Fax: +86-411-84379211; E-mail: zhaozb@dicp.ac.cn