魏明，崔瑋，薛正蓮

安徽工程科技學(xué)院生物化學(xué)工程系 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)中心，蕪湖 241000

透性化嗜酸乳桿菌細胞轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的反應(yīng)動力學(xué)

魏明，崔瑋，薛正蓮

安徽工程科技學(xué)院生物化學(xué)工程系 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)中心，蕪湖 241000

本實驗旨在研究透性化嗜酸乳桿菌細胞生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的反應(yīng)動力學(xué)。探討了細胞濃度、底物濃度、反應(yīng)體系pH值和溫度等因素對生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸反應(yīng)速度的影響；建立了透性化嗜酸乳桿菌細胞生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的動力學(xué)模型。結(jié)果表明，透性化嗜酸乳桿菌細胞有利于共軛亞油酸的生物轉(zhuǎn)化，最適細胞濃度、pH值和反應(yīng)溫度分別為10×1010ufc/mL、4.5和45℃；生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸存在底物抑制現(xiàn)象，當(dāng)亞油酸的濃度為0.6 mg/mL時，反應(yīng)速度達到最大值17.8 μg/(mL·min)。在低亞油酸濃度下，反應(yīng)初始階段的反應(yīng)規(guī)律與經(jīng)典米氏方程相符，而在高亞油酸濃度下，存在底物抑制現(xiàn)象。在最適反應(yīng)條件下建立了動力學(xué)模型，模型基本反映了共軛亞油酸的生物轉(zhuǎn)化特性。

嗜酸乳桿菌，透性化，生物轉(zhuǎn)化，共軛亞油酸，動力學(xué)

Abstract:In this study, we analyzed the kinetics of bioconversion of conjugated linoleic acid(CLA)by permeabilizedLactobacillus acidophiluscells.The effects of cell mass, linoleic acid(LA)concentration, reaction pH and temperature on the bioconversion of CLA by permeabilized cells were investigated and the model system of bioconversion of CLA was established.The results showed that the production of CLA was increased by permeabilized cells.The optimal cell mass, pH and temperature of bioconversion of CLA were 10×1010ufc/mL, 4.5 and 45°C, respectively.A marked LA inhibition phenomenon existed, and the early reaction rate of producing CLA reached the maximum(17.8 μg/mL·min)when LA concentration was 0.6 mg/mL.Michaelis constant was obtained by double-reciprocal plot and Hanes-Woolf plot.The reaction rate equation followed the classic Michaelis-Mentent equation at the low LA concentration, while there was a marked LA inhibition phenomenon at the high LA concentration.With the evaluated model parameters, the model system appeared to provide a description for the bioconversion of CLA by permeabilizedLactobacillus acidophiluscells.

Keywords:Lactobacillus acidophilus, permeabilized cells, bioconversion, conjugated linoleic acid, kinetics

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸(Linoleic acid，LA)的共軛雙烯酸的多種位置和幾何異構(gòu)體的總稱[1]，其中順-9/反-11和反-10/順-12兩種異構(gòu)體被證實具有很強的生理活性[2]。共軛亞油酸具有降血壓、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制脂肪積累沉積、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗糖尿病、抗霉變、調(diào)節(jié)機體免疫力等功能[3-5]。目前主要用化學(xué)方法合成共軛亞油酸，但得到的是一系列位置和幾何異構(gòu)體的混合物，而用酶法合成能專一性地得到具有較高活性的共軛亞油酸的異構(gòu)體[2]。

乳酸菌含有亞油酸異構(gòu)酶[6]，能把亞油酸轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸[7]。亞油酸異構(gòu)酶屬于胞內(nèi)酶，通常采用超聲波破碎提取粗酶進行催化反應(yīng)。由于超聲波破碎不徹底或者破碎過程中造成酶的損失，導(dǎo)致酶法轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的產(chǎn)率較低[8]。完整的細胞是酶催化反應(yīng)的天然環(huán)境，能夠保持酶的較高活性；利用菌體轉(zhuǎn)化時，雖然能夠增加酶的耐受性，但細胞膜成為亞油酸和共軛亞油酸進出細胞的障礙，亞油酸異構(gòu)酶的表觀活力較低，共軛亞油酸的產(chǎn)率不高[9]。透性化處理可以提高細胞內(nèi)酶的表觀活力加速產(chǎn)物的合成，Gough等利用透性化技術(shù)提高了細胞內(nèi)葡萄糖酸氧化酶的活力[10]，Abraham和 Bhat用透性化酵母生產(chǎn)十二烷基肌氨酸取得了很好的效果[11]。目前，利用透性化嗜酸乳桿菌細胞轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的研究尚未見報道。通過研究透性化嗜酸乳桿菌細胞轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的動力學(xué)過程，為共軛亞油酸的生物轉(zhuǎn)化開辟了新途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

嗜酸乳桿菌產(chǎn)亞油酸異構(gòu)酶突變株：對嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus(購于中國科學(xué)院微生物研究所)進行激光誘變和篩選得到。具體方法如下：在添加5 μg/mL亞油酸的MRS固體培養(yǎng)基上接種嗜酸乳桿菌，激光照射10 min，功率20 mW，距離25 cm，得到一株亞油酸異構(gòu)酶高產(chǎn)菌株，突變菌株經(jīng)傳代實驗產(chǎn)酶穩(wěn)定。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以MRS為基本培養(yǎng)基，以1%(V/V)接種量接入到一定體積的 MRS培養(yǎng)基中，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)(5 μg/mL亞油酸誘導(dǎo))36 h，培養(yǎng)結(jié)束后離心(5000×g，10 min，4℃)收集菌體，并用 0.1 mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 6.5)洗滌2次。

1.3 細胞的透性化處理

把收集到的菌體加入到磷酸二氫鉀緩沖液中，添加滲透劑溴化十六烷三甲基銨(CTAB)至終濃度為1%，滲透時間為20 min，然后離心收集菌體用磷酸二氫鉀緩沖液洗滌備用。

1.4 共軛亞油酸的檢測方法

共軛亞油酸(CLA)在波長 233～234 nm之間有特殊吸收峰，而亞油酸(LA)卻沒有。在50 mL三角瓶中加入一定量的透性化細胞、LA和吐溫 80，在37℃下振蕩反應(yīng)一段時間，然后加入正己烷 20 mL萃取CLA；離心之后取正己烷層，在233 nm處用紫外分光光度計測其吸光值，對照CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得CLA的含量，CLA標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=10.2x?0.69，R2=0.998。

1.5 透性化細胞、非透性化細胞及粗酶液轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的比較實驗

分別取 10 mL細胞懸浮液(細胞濃度 10×1010ufc/mL)，分別進行透性化處理(添加CTAB于細胞懸浮液中至終濃度為1%，滲透20 min)、不處理和研磨超聲處理獲得粗酶液(首先用石英砂在冰浴中研磨，然后用超聲波處理，功率為300 W，超聲時間10 min，離心后獲得粗酶液)，然后分別加入等量的LA至終濃度0.5 mg/mL，反應(yīng)體系的pH值為4.0，于37℃、150 r/min條件下反應(yīng)3 h，提取脂肪酸測定CLA的含量。

1.6 對生物轉(zhuǎn)化速度的影響實驗

1.6.1 細胞濃度對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

將透性化細胞用磷酸二氫鉀緩沖液稀釋成不同濃度的細胞懸浮液(1×1010、3×1010、5×1010、7×1010、9×1010、10×1010、12×1010、15×1010ufc/mL)，取 10 mL菌懸液于50 mL三角瓶中，添加LA至終濃度為0.5 mg/mL，反應(yīng)體系pH值為4.0，于37℃、150 r/min條件下反應(yīng)，每隔一段時間提取CLA進行分析。

1.6.2 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

分別取10 mL透性化處理的細胞懸浮液(細胞濃度為10×1010ufc/mL)置于50 mL三角瓶中，添加不同濃度的 LA(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/mL)，反應(yīng)體系pH值為4.0，于37℃、150 r/min條件下反應(yīng)，每隔一段時間提取CLA進行分析。

1.6.3 反應(yīng)緩沖液的pH值對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

將透性化處理的細胞用不同 pH值(pH 3、pH 4、pH 4.5、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8)的磷酸鹽緩沖液懸浮，分別取 10 mL懸浮液(細胞濃度為10×1010ufc/mL)放入50 mL三角瓶中，添加LA至終濃度0.5 mg/mL，于37℃、150 r/min條件下反應(yīng)，每隔一段時間提取CLA進行分析。

1.6.4 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

分別取透性化處理的細胞懸浮液(細胞濃度為10×1010ufc/mL)10 mL于50 mL三角瓶中，添加LA至終濃度為0.5 mg/mL，反應(yīng)體系pH值為4.5，分別在不同溫度(20℃、30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70 ℃)150 r/min 下反應(yīng)，每隔一段時間提取CLA進行分析。

1.7 模型建立及動力學(xué)參數(shù)測定

取10 mL透性化細胞懸浮液加入不同濃度(0～4 mg/mL)的LA，在45℃、150 r/min下反應(yīng)，每隔一段時間提取 CLA進行分析，以雙倒數(shù)(Doublereciprocal plot)和Hanes-Woolf法作圖，得到反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)并建立不同底物濃度范圍的速度方程，對擬合的速度方程進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 透性化細胞、非透性化細胞及粗酶液轉(zhuǎn)化CLA的比較

從表 1可以看出，透性化處理的嗜酸乳桿菌細胞CLA轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速度都最大。經(jīng)過透性化處理的嗜酸乳桿菌細胞，底物 LA可以順利進入細胞被酶催化生成CLA，因而大大縮短反應(yīng)時間，加快了反應(yīng)速度；未經(jīng)透性化處理的細胞，由于細胞膜阻礙了底物與酶的有效結(jié)合，細胞內(nèi)亞油酸異構(gòu)酶的表觀活力較低，因而CLA的轉(zhuǎn)化率也較低[9,12]；而經(jīng)過研磨及超聲等步驟提取粗酶液會引起酶的損失或降低酶活，因而在同等條件下催化能力降低[7]。

2.2 細胞濃度對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

酶催化反應(yīng)的速度與酶濃度有關(guān)，在透性化嗜酸乳桿菌細胞催化反應(yīng)中，可以通過改變細胞濃度來調(diào)節(jié)參與反應(yīng)的酶量，進而影響催化反應(yīng)的速度。從圖1中可以看出，當(dāng)細胞濃度較低時，反應(yīng)速度增加緩慢，當(dāng)細胞濃度在4×101～10×1010ufc/mL時，隨著細胞濃度的增加，反應(yīng)速度快速增加；當(dāng)細胞濃度達到10×1010ufc/mL以后，反應(yīng)速度趨于平穩(wěn)，所以細胞濃度為10×1010ufc/mL時為飽和濃度。這種現(xiàn)象是由于在低細胞濃度下存在底物抑制，因此反應(yīng)速度上升較慢，隨著細胞濃度的增加，相對底物的抑制作用減弱，反應(yīng)速度呈線性增加，當(dāng)細胞濃度達到一定值時，反應(yīng)速度最大[9]。

2.3 亞油酸濃度對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

由圖2可知，底物濃度對初始反應(yīng)速度影響很大，初始反應(yīng)速度隨LA濃度的增加而增加，當(dāng)LA的濃度為 0.6 mg/mL時，反應(yīng)速度達到最大值為17.8 μg/(mL·min)；當(dāng)LA濃度大于0.6 mg/mL時，反應(yīng)速度隨著 LA濃度的增加而下降。由此可知，在LA濃度大于0.6 mg/mL時，反應(yīng)存在明顯的底物抑制現(xiàn)象，結(jié)果與Peng等[13]從梭狀芽孢桿菌中分離到的亞油酸異構(gòu)酶的酶反應(yīng)動力學(xué)相似。

表1 透性化細胞、非透性化細胞及粗酶液轉(zhuǎn)化CLA的比較Table 1 Comparison of bioconversion of LA to CLA by permeabilized cells, control cells and crude enzyme

圖1 細胞濃度對反應(yīng)初速度的影響Fig.1 Effect of cell concentration on the early reaction rate.

2.4 反應(yīng)體系的pH值對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

酶促反應(yīng)的速度受反應(yīng)介質(zhì)的 pH值影響，pH值影響酶的活性，由圖3可知，嗜酸乳桿菌透性化細胞生物轉(zhuǎn)化CLA的最適pH值在4.5左右。

2.5 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化速度的影響

溫度越高酶促反應(yīng)的速度越快，同時溫度又影響細胞內(nèi)酶的活性，由圖4可知，酶催化初始反應(yīng)速度隨著溫度的升高而加快，當(dāng)溫度為 45℃～50℃時，反應(yīng)速度較大，繼續(xù)升高溫度反應(yīng)速度反而下降。高溫使酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致酶的活性降低，因此透性化嗜酸乳桿菌細胞生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的最適溫度為45℃左右。

圖2 亞油酸濃度對反應(yīng)初速度的影響Fig.2 Effect of LA concentration on the early reaction rate.

圖3 反應(yīng)pH值對反應(yīng)初速度的影響Fig.3 Effect of pH value on the early reaction rate.

圖4 反應(yīng)溫度對反應(yīng)初速度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the early reaction rate.

2.6 生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的動力學(xué)模型建立

由于透性化嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化CLA存在明顯的底物抑制現(xiàn)象，因此對速度方程分兩段考察: 底物非抑制濃度范圍和底物抑制濃度范圍內(nèi)的速度方程。當(dāng)LA濃度在(0～0.6 mg/mL)時，透性化細胞反應(yīng)規(guī)律遵循經(jīng)典米氏方程：

(Vmax為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù))。

對式(1)進行變形為：

采用雙倒數(shù)作圖法對1/V與1/S作圖，擬合出一條線性方程y＝0.0115x+0.042。將直線延長與坐標(biāo)軸相交，在橫軸上截距為?1/Km，在縱軸上截距為1/Vmax，從而求得米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度分別為:Km＝0.27 mg/mL，Vmax＝23.81 μg/(mL?min)。所以，在低底物濃度范圍內(nèi)，透性化嗜酸乳桿菌細胞反應(yīng)規(guī)律可用米氏方程來描述:

當(dāng)亞油酸濃度大于0.6 mg/mL時，由2.3可知，底物抑制明顯，可用經(jīng)典的底物抑制速率方程來描述：

(Ki是底物抑制的解離常數(shù))對式(4)進行變形得下式:

采用Hanes-Woolf作圖法對S/V與S作圖，擬合出一條非線性回歸方程：y＝0.0811x2+0.0887x?0.048對照式(5)可以求得 Km＝0.54 mg/mL；Vmax＝11.27 μg/(mL?min)；Ki＝1.09 mg/mL。因此，在高底物濃度范圍內(nèi)，透性化嗜酸乳桿菌細胞反應(yīng)速度方程為：

2.7 模型的驗證

對非底物抑制范圍內(nèi)的速度方程式(3)進行驗證，結(jié)果如圖5A所示，亞油酸濃度在0～0.6 mg/mL之間時，實驗值與模擬值相對偏差低于 5%，反應(yīng)速度方程與經(jīng)典的米氏方程相吻合，方程擬合較好。

圖5 實驗值與模型值的對比Fig.5 Comparison of experimental result with model result.(A)At low LA concentration.(B)At high LA concentration.

對底物抑制范圍內(nèi)的速度方程式(6)進行驗證，結(jié)果如圖5B所示，亞油酸濃度在0.6～3 mg/mL之間實驗值與模擬值相對偏差低于 5%，這與底物抑制方程相吻合。

3 結(jié)論

經(jīng)過透性化處理的嗜酸乳桿菌細胞，細胞膜的通透性增加，底物亞油酸可以順利進入細胞被酶催化，大大縮短了反應(yīng)時間，同時透性化細胞內(nèi)酶比提取液中酶的熱穩(wěn)定性有所提高[6]，加快了反應(yīng)速度。透性化嗜酸乳桿菌生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的最佳底物濃度為0.6 mg/mL，最佳細胞濃度為10×1010ufc/mL，最佳pH值為4.5，最佳溫度為45℃。通過透性化嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的動力學(xué)研究，建立了不同底物濃度范圍的速度方程，建立的模型較好地反映了透性化嗜酸乳桿菌生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的特性，為利用透性化嗜酸乳桿菌大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸提供了依據(jù)。

REFERENCES

[1]Adolf R, Lammt T.Fractionation of cis-oleic and tran-oleic, linoleic, and conjugated linoleic fatty acid methyl esters by silver ion high-performance liquid chromatography.J Chromatogr A, 1998, 799(1/2):329?332.

[2]Pariza MW, Park Y, Cook ME.The biologically active isomers of conjugated linoleic acid.Prog Lipid Res, 2001,40(4): 283?298.

[3]Park Y, Albright KJ, Storkson JM,et al.Effect of conjugated linoleic acid on body composition in mice.Lipids, 1997, 32(8): 853?858.

[4]Hur SJ, Park GB, Joo ST.Biological activities of conjugated linoleic acid(CLA)and effects of CLA on animal products.Livestock Sci, 2007, 110(3): 221?229.

[5]Hubbard NE, Lim D, Erickson KL.Effect of separate conjugated linoleic acid isomers on murine mammary tumorigenesis.Cancer Lett, 2003, 190(1): 13?19.

[6]Cao J, Wei M, Zeng S,et al.Purification and characterization of linoleate isomerase fromLactobacillus acidophilus.Food Ferm Ind, 2004, 30(2): 48?52.曹健, 魏明, 曾實, 等.一株嗜酸乳桿菌突變株亞油酸異構(gòu)酶的純化及性質(zhì).食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(2):48?52.

[7]Lin TY, Lin CW, Wang YJ.Production of conjugated linoleic acid by enzyme extract ofLactobacillus acidophilusCCRC14079.Food Chem, 2003, 83(1): 27?31.

[8]Lin TY.Conjugated linoleic acid production by cells and enzyme extract ofLactobacillus delbrueckiissp.bulgaricuswith additions of different fatty acids.Food Chem, 2006, 94(3): 437?441.

[9]Lee SO, Kim CS, Cho SK,et al.Bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid during fermentation and by washed cells ofLactobacillus reuteri.Biotechnol Lett,2003, 25(12): 935?938.

[10]Gough S, Deshpande M, Scher M,et al.Permeabilization ofPichia pastorisfor glycolate oxidase activity.Biotechnol Lett, 2001, 23(18): 1535?1537.

[11]Abraham J, Bhat SG.Permeabilization of baker’s yeast with N-lauroyl sarcosine.J Ind Microbiol Biotechnol,2008, 35(8): 799?804.

[12]Wang LM, Lv JP, Chu ZQ,et al.Production of conjugated linoleic acid byPropionibacterium freudenreichii.Food Chem, 2007, 103(2): 313?318.

[13]Peng SS, Deng MD, Gund AD,et al.Purification and characterization of a membrane-bound linoleic acid isomerase fromClostridium sporogenes.Enzyme Microb Technol, 2007, 40(4): 831?839.

Kinetics of bioconversion of linoleic acid to conjugated linoleic acid by permeabilized Lactobacillus acidophilus cells

Ming Wei, Wei Cui, and Zhenglian Xue
Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation, Department of Biology and Chemistry, Anhui University of Technology and Science, Wuhu 241000, China

Received:November 9, 2009;Accepted:March 10, 2010

Supported by:Natural Science Research Program of the Educational Office of Anhui Province(No.KJ2008B205), Talent Recruitment Program of Anhui University of Technology and Science(No.2007YQQ008).

Corresponding author:Ming Wei.E-mail: wmrainbow@yahoo.com.cn安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目(No.KJ2008B205)，安徽工程科技學(xué)院人才引進基金(No.2007YQQ008)資助。