殷瑛，徐俊杰，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

乙型肝炎病毒核心蛋白作為表位疫苗載體的應(yīng)用

殷瑛，徐俊杰，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)可以形成二十面體對(duì)稱的顆粒樣結(jié)構(gòu)，由于其N端、C端和主要免疫顯性區(qū)域(Major immunodominant region，MIR)允許一定程度的缺失和外源插入，并且能夠?qū)⑼庠葱蛄兄貜?fù)且高密度地暴露在顆粒的表面，誘發(fā)強(qiáng)烈的外源序列特異的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從上世紀(jì)80年代中期就開始被運(yùn)用于表位疫苗的研究。以下主要從影響HBc作為表位疫苗載體的因素，包括HBc長(zhǎng)度、外源插入位點(diǎn)和表位序列的性質(zhì)等來(lái)介紹HBc作為表位疫苗載體的應(yīng)用。

乙肝核心蛋白，表位疫苗，疫苗載體，基因重組

Abstract:Hepatitis B virus core(HBc)proteins have been used as carrier for foreign epitopes since the 1980s.They could self-assemble into icosahedral particles.Foreign epitopes could be inserted into HBc protein in various protein regions, including the N- or C-terminal and the major immunodominant region(MIR).The factors relevant in the design of HBc particles for vaccine purpose are summarized in this review.

Keywords:hepatitis B virus core protein, epitope vaccine, vaccine carrier, gene recombination

重組的乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)自上世紀(jì)80年代中期開始就被用于表位疫苗載體的研究，它能夠形成二十面體對(duì)稱病毒樣粒子(Virus-like particle，VLP)的結(jié)構(gòu)，可以被用來(lái)展示外源序列。到目前為止，經(jīng)其展示過(guò)的表位涉及病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物蛋白表位(瘧原蟲、鉤端螺旋體)等[1]。HBc顆粒得以作為表位載體的實(shí)際運(yùn)用主要在于它可以在自身表面重復(fù)且高密度地展示外源性序列，從而誘發(fā)強(qiáng)有力的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)；Pumpens和 Grens[2]以及 Riedl等[3]曾報(bào)道，重組的HBc-VLP還能在免疫反應(yīng)中發(fā)揮佐劑作用，并且可以經(jīng)口腔途徑免疫[4]，這些都為現(xiàn)代的疫苗設(shè)計(jì)提供了新的思路。此外，作為病毒樣粒子，HBc還具有包裹核酸或其他小分子的能力，可以作為基因或藥物的運(yùn)載工具[5]。另一方面，HBc作為表位載體的能力也受一些因素的限制。以下就有關(guān)這些方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)述。

1 HBc的結(jié)構(gòu)生物學(xué)特點(diǎn)

HBc由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBv)C基因的第2個(gè)起始密碼子起始翻譯而成，是乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)的結(jié)構(gòu)成分。單體的 HBc主要由 α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成(圖1)[6]，2個(gè)單體分子組裝二聚體結(jié)構(gòu)，形成由 2個(gè) α螺旋發(fā)夾構(gòu)成的四螺旋束(圖2)，也就是冷凍電鏡下所觀察到的衣殼表面的刺突(Spike)[7]。刺突的頂端對(duì)應(yīng)于HBc分子的78～82位氨基酸，是所形成的HBc-VLP表面主要的B細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，也是主要的免疫顯性區(qū)域(Major immunodominant region，MIR)[2](圖1、2)。此外，2005 年，Roseman 等[8]報(bào)道，HBc單體的螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)有2種構(gòu)象，每一個(gè)二聚體均由2個(gè)不同構(gòu)象的單體構(gòu)成。

圖1 HBV衣殼蛋白單體的結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 Structure of the HBV capsid monomer.The structure data is obtained from Protein Data Bank(www.rcsb.org), the PDB ID is 1qgt.The MIR is shown in red, the α-helical hairpin is shown in purple, Cys is shown in jacinth.The α5 helical hairpin and C terminal arm which involved in capsid assembly are shown in yellow and green.

圖2 HBV衣殼蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)模式圖Fig.2 Structure of the HBV capsid dimer.The structure data is obtained from Protein Data Bank(www.rcsb.org), the PDB ID is 1qgt.The MIR is shown in red, the two HBc monomers which constitute a dimer are shown in dark blue and light blue.Cys is shown in jacinth, and Cys-61 in each molecular forms a disulfide bridge between the two monomers.

HBc-VLPs的結(jié)構(gòu)中主要存在3種相互作用[6]，首先是疏水作用，主要用來(lái)維持單體的折疊和二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；其次是共價(jià)鍵，主要是形成二聚體(圖2)的2個(gè)單體內(nèi)，相應(yīng)的Cys-48或Cys-61之間形成的分子間二硫鍵，但是這種作用對(duì)于二聚體或衣殼的形成影響不大，另外根據(jù)2個(gè)Cys-48之間二硫鍵形成的難易程度，也排除了天然HBc顆粒中有二硫鍵存在的可能；最后一種相互作用是 HBc分子α5螺旋的氨基酸和C端的臂之間的作用，這種作用與這兩個(gè)區(qū)域的氨基酸殘基組成及其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)，主要影響著顆粒的裝配與穩(wěn)定性。

HBc所形成的衣殼在真核、原核、昆蟲及植物表達(dá)系統(tǒng)中均能得到正確的表達(dá)[1]。大腸桿菌所表達(dá)的HBc蛋白主要可以形成2種類型的顆粒[9]，分別是由180個(gè)單體形成的T=3型顆粒和由240個(gè)單體形成的T=4型顆粒。這兩種顆粒的表面分別有90或 120個(gè)刺突，并且有一些孔洞結(jié)構(gòu)存在，這些孔洞可能是病毒基因組復(fù)制時(shí)核酸流通的路徑，也有可能是形成顆粒的HBc分子，其C端結(jié)構(gòu)與顆粒外環(huán)境接觸的通道[6]。

2 HBc作為疫苗載體的應(yīng)用

外源序列主要是通過(guò)兩種方式與 HBc建立關(guān)聯(lián)：基因重組和化學(xué)偶聯(lián)[10]。

2.1 基因重組

基因重組主要是將某T細(xì)胞表位和(或)B細(xì)胞表位的編碼序列直接插入 HBc編碼基因的特定位置，通過(guò)各種表達(dá)系統(tǒng)來(lái)得到插入該肽段的重組HBc-VLPs。在這個(gè)過(guò)程中可以通過(guò)對(duì)HBc的長(zhǎng)度、外源序列的插入位點(diǎn)、外源序列的組合形式(例如：同種表位多拷貝串聯(lián)、異種表位串聯(lián)、目的表位與輔助表位串聯(lián)等)以及決定HBcAg自身免疫原性的若干氨基酸的缺失等重要參數(shù)進(jìn)行修飾來(lái)確保外源序列高水平的B細(xì)胞和/或T細(xì)胞的免疫原性。

2.1.1 HBc的長(zhǎng)度

HBc的長(zhǎng)度影響著顆粒的裝配能力、顆粒的二態(tài)性、與核酸的結(jié)合能力和激發(fā)免疫的類型。

1)顆粒的裝配與二態(tài)性

天然的 HBcAg包含有 183或 185個(gè)氨基酸，Borisova等和Gallina等發(fā)現(xiàn)HBc蛋白C端精氨酸富集的區(qū)域150～183位氨基酸對(duì)顆粒的形成[11]和衣殼的大小與形態(tài)的維持[12]是非必需的，此外，Zlotnick等[9]通過(guò)使用由細(xì)菌表達(dá)的一系列不同長(zhǎng)度的衣殼蛋白(1～149aa，1～147aa，1～142aa，1～140aa，1～138aa，3～144aa)在體外研究了衣殼的裝配過(guò)程。結(jié)果表明，大于或等于 140個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)才可以裝配成衣殼，而且會(huì)形成T=3或T=4型顆粒的混合物。這兩種顆?？梢酝ㄟ^(guò)蔗糖梯度分開，并且即使是在長(zhǎng)期貯存的條件下也不會(huì)相互轉(zhuǎn)化。蔗糖梯度分級(jí)分離、分析超速離心和冷凍電鏡的結(jié)果證明T=3型顆粒的比例會(huì)隨著C端氨基酸缺失數(shù)目的增加而增加。此外，通過(guò)對(duì)T=4型(1～149aa)顆粒晶體結(jié)構(gòu)的電子密度圖的分析發(fā)現(xiàn)，所表達(dá)的149位氨基酸的多肽中，C端的6個(gè)氨基酸(144～149aa)基本上沒(méi)有觀察到電子密度，這提示或許可以將形成顆粒所需要多肽的最小長(zhǎng)度精確到 143[6]/144[13]個(gè)氨基酸。然而，也有文獻(xiàn)報(bào)道[2,14]，切除了 C端的HBc蛋白，雖然在表達(dá)量上有很大的提高，在形態(tài)上也與天然的顆粒差異不大，但是，去除了C端結(jié)構(gòu)的HBc蛋白不夠穩(wěn)定，因此有研究者在后期的操作中，為了使重組的結(jié)構(gòu)能保持穩(wěn)定，在C端添加一個(gè)半胱氨酸[15-16]。

2)核酸的結(jié)合位點(diǎn)及佐劑效應(yīng)

HBc蛋白的 150～157aa和 157～177aa分別具有RNA和DNA結(jié)合活性[2]。一方面HBc可以作為潛在的B細(xì)胞激活劑來(lái)充分調(diào)動(dòng)B細(xì)胞使之成為高效的促使抗原呈遞的細(xì)胞；另一方面這種C端核酸結(jié)合序列能非特異地結(jié)合少量真核或原核RNA，通過(guò)MyD88依賴性和非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活NF-κB和MAPK，引發(fā)某些細(xì)胞因子的釋放及部分共刺激分子的上調(diào)，并最終激活特異性免疫系統(tǒng)，而且包裹在HBcAg顆粒中的RNA佐劑效應(yīng)是游離RNA的1000倍[17]。本實(shí)驗(yàn)室的研究也發(fā)現(xiàn)，炭疽桿菌保護(hù)性抗原(PA)與HBc的融合蛋白在免疫小鼠時(shí)，不加佐劑和使用氫氧化鋁佐劑組均能激發(fā)高效價(jià)的抗PA抗體，而且這兩組在激發(fā)抗PA抗體的能力上沒(méi)有顯著性差異。

3)HBcAg載體的長(zhǎng)度影響著激發(fā)免疫的類型Th1/Th2

Zlotnick等[9]發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)的HBc優(yōu)先激發(fā)HBcAg Th1型反應(yīng)，而突變體HBc-149或144顆粒優(yōu)先激發(fā)Th2型反應(yīng)。Th1型反應(yīng)是與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，涉及細(xì)胞免疫反應(yīng)及遲發(fā)型超敏性炎癥的發(fā)生，在機(jī)體抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮著重要的作用；Th2型反應(yīng)主要涉及B細(xì)胞的增殖以及抗體的產(chǎn)生，與體液免疫相關(guān)。這提示可以針對(duì)病原體的不同類型(是否胞內(nèi)病原體)采用不同的HBc蛋白長(zhǎng)度。

2.1.2 外源表位的插入位點(diǎn)

對(duì)于外源插入位點(diǎn)的研究，主要集中在HBc的N端和 C端，以及刺突頂端的主要免疫顯性區(qū)域(MIR)，因?yàn)樗鼈儾粎⑴c關(guān)鍵的分子內(nèi)和分子間的相互作用。

1)N端和C端

N端插入是最先使用的插入方式(表 1)。最初使用N端作為插入靶點(diǎn)開展的研究很多，但目前N端插入已經(jīng)不是首選的插入方法。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，N端插入對(duì)外源序列的長(zhǎng)度有一定的限制，大于50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度可能會(huì)影響顆粒的組裝，過(guò)長(zhǎng)的N端序列還可能會(huì)在空間上影響免疫效應(yīng)細(xì)胞與正常的免疫顯性HBc刺突的接觸，從而影響免疫輔助作用的發(fā)揮[15]。目前進(jìn)展最好的是基于HBc N端插入的流感候選疫苗。

C端插入也是較常用的插入方法(表1)。但是C端一般被包裹在衣殼的內(nèi)部，所以融合在這個(gè)區(qū)域的序列有可能不能被暴露在衣殼表面。HBc顆粒的表面有孔洞存在，有些融合在C端的蛋白可以通過(guò)這些孔洞實(shí)現(xiàn)與免疫細(xì)胞表面受體的接觸，然而它們特異的B細(xì)胞免疫原性通常較低[1]。

表1 N端、C端和MIR插入能力簡(jiǎn)表[1-2]Table 1 Capacity of the HBc carrier[1-2]

2)MIR區(qū)域

MIR區(qū)是目前研究得最多，也是應(yīng)用最廣泛的插入?yún)^(qū)域(表1)。這主要是因?yàn)镠Bc分子78～82位氨基酸所對(duì)應(yīng)的區(qū)域(MIR)，位于衣殼表面刺突的頂端，是主要的免疫顯性區(qū)域，插入到這個(gè)區(qū)域的外源序列不僅能被暴露在衣殼的表面，而且還能確保高水平的特異性的B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫原性[2]。例如，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)[18]，將炭疽桿菌保護(hù)性抗原(PA)結(jié)構(gòu)域 2 的 2β2?2β3loop(24aa)插入到 HBc的MIR的78～79位氨基酸之間，不僅可以形成電鏡下可見的顆粒狀結(jié)構(gòu)，這些顆粒在小鼠和豚鼠模型上還可以誘導(dǎo)高效價(jià)的抗PA抗體和中和性抗體，并能保護(hù)部分豚鼠對(duì)抗炭疽毒力芽胞的攻擊。此外，雖然這個(gè)區(qū)域位于HBc分子的內(nèi)部，但相對(duì)于N端和C端而言，它具有更大的插入容量，例如，綠色熒光蛋白的 238個(gè)氨基酸通過(guò)插入這個(gè)區(qū)域被天然地展示在了全長(zhǎng)的HBc所形成的顆粒表面，嵌合體不僅顯示了熒光的能力，同樣也引發(fā)了針對(duì)天然 GFP的有力的體液反應(yīng)[19]。Nassal等[20]將博氏疏螺旋體的整個(gè)外表面脂蛋白 A(OspA)的外功能區(qū)的 255個(gè)氨基酸和 OspC(OspC(a)，OspC(b))的二聚體的189個(gè)氨基酸長(zhǎng)的突變體分別插入到 HBc的 MIR區(qū)，以研究HBc被開發(fā)成用于展示整鏈蛋白抗原的疫苗載體能力，雖然核心蛋白與兩個(gè) OspC突變體的融合均可以有效地形成常規(guī)的VLPs，與OspA的融合只有部分能裝配成常規(guī)的VLPs，但是這些融合蛋白都可以激發(fā)有效的抗體反應(yīng)，包括Ig同種型和針對(duì)保護(hù)性表位“LA-2”的特異性抗體，并主動(dòng)和被動(dòng)地保護(hù)小鼠對(duì)抗博氏疏螺旋體的攻擊。

另外，MIR區(qū)除了容量大以外，外源序列的插入，對(duì)該區(qū)域若干氨基酸進(jìn)行缺失[1-2]或者加入一些輔助表位等，對(duì)于消除 HBc自身的抗原性/免疫原性，以及增強(qiáng)外源序列特異的免疫反應(yīng)也是非常重要的。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，炭疽桿菌 PA結(jié)構(gòu)域 2的2β2?2β3loop(24aa)在 HBc78～79 位氨基酸之間插入，或?qū)?9～81位氨基酸替換均可以顯著地降低抗HBc抗體的產(chǎn)生，插入組和替換組激發(fā)的抗HBc抗體效價(jià)比不插入組低10倍。Zhang等[21]在將口蹄疫病毒(FMDV)表位融合至 HBc顆粒的研究中分別構(gòu)建了在 HBc MIR區(qū)缺失 3段不同長(zhǎng)度氨基酸序列：75～78aa(3個(gè)氨基酸)，75～80aa(5個(gè)氨基酸)和75～82aa(7 個(gè)氨基酸)的展示載體(pHBc1，pHBc2，pHBc3)，并在這3個(gè)缺失部位分別插入了FMDV的多表位的不同組合，BT[VP1(141～160)?VP4(21～40)]和BTB[VP1(141～160)?VP49(21～40)?VP1(141～160)]，形成了6種不同的重組質(zhì)粒。結(jié)果表明，pHBc3-BTB表達(dá)了可溶性的蛋白，并形成了電鏡下可見的完整的 VLP粒子。重組的 VLP可以被細(xì)胞吞噬并且在體內(nèi)和體外均能被觀察到。更重要的是，經(jīng)修飾的顆粒比其他5個(gè)重組蛋白和GST-BTB能更顯著地激發(fā)高效價(jià)的肽段特異性和病毒特異性抗體，提高IFN-γ和 IL-4的分泌水平，尤其是強(qiáng)化了淋巴細(xì)胞的增殖能力。

2.1.3 對(duì)于插入序列自身的要求

影響衣殼裝配的因素除了不同的插入位點(diǎn)會(huì)有插入長(zhǎng)度的限制外，對(duì)于插入序列的組成也是有要求的。嵌合的HBcAg自我裝配的能力可能依賴于插入序列的氨基酸殘基的物理和化學(xué)性質(zhì)。Karpenko等[22]發(fā)現(xiàn)在 MIR區(qū)進(jìn)行插入的表位序列如果出現(xiàn)以下 3種情況會(huì)影響顆粒的裝配：表位高度的疏水性(High epitope hydrophobicity)、過(guò)長(zhǎng)的表位序列(Large epitope volume)和高 β 鏈指數(shù)(High β-strand index)。這 3個(gè)參數(shù)的比值越高，HBcAg的融合蛋白形成顆粒的可能性就越小。有研究報(bào)道[22]高疏水性引起的裝配問(wèn)題可以通過(guò)在一個(gè)宿主菌中共同表達(dá)天然的 HBcAg的基因和融合有外源序列的HBcAg的基因從而形成嵌合顆粒得到解決，而由高β鏈指數(shù)帶來(lái)的裝配問(wèn)題可以通過(guò)去除HBcAg的β折疊結(jié)構(gòu)或者在插入序列的C端與HBcAg載體相連的地方引入間隔序列(Spacer)來(lái)解決。值得注意的是，肽段在N端的插入沒(méi)有這種顯著的相關(guān)性，可能對(duì)于形成天然的蛋白結(jié)構(gòu)而言，在N端和C端的插入沒(méi)有那么苛刻的結(jié)構(gòu)上的要求。

此外，Billaud等[14]在對(duì)土撥鼠肝炎病毒核心抗原(Woodchuck hepatitis virus core antigen，WHcAg)的研究中發(fā)現(xiàn)，插入序列的荷電情況也影響嵌合顆粒裝配：帶正電荷的插入序列(高 pI)可能不利于二聚體的形成和/或顆粒的裝配等；甘氨酸的添加或置換或用天冬氨酸包圍插入的表位兩側(cè)，可以使原本不能裝配的嵌合顆粒變?yōu)榭梢匝b配。只有酸性氨基酸可以改善攜帶有正電荷插入序列的，原本不能裝配的嵌合顆粒的裝配能力。其次，在同樣長(zhǎng)度的載體中插入同樣的異源表位時(shí)，表位的插入位置只能影響顆粒的免疫原性而不能改變顆粒整體的免疫原性，位置效應(yīng)最有可能反映的是表位在顆粒表面的暴露程度和/或其與MIR區(qū)域的位置關(guān)系。此外，將同一表位插入到不同C端長(zhǎng)度的WHcAg的同一位置的結(jié)果表明，C端區(qū)域的結(jié)構(gòu)可能通過(guò)影響顆粒的穩(wěn)定性來(lái)影響顆粒的免疫原性。

2.2 化學(xué)偶聯(lián)

通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑將外源肽段直接結(jié)合到HBc表面是將外源序列暴露在HBc表面的另一種方式。鑒于經(jīng)由基因融合所構(gòu)建的蛋白在結(jié)構(gòu)上可能存在位阻效應(yīng)，插入 VLPs的外源肽段的大小限制著衣殼的裝配，或者是融合至N端或C端的序列不能被很好地暴露，影響免疫原性，或者某些嵌合的 VLPs在體內(nèi)不穩(wěn)定，Jegerlehner等[10]建立了直接將外源性肽交聯(lián)到HBcAg顆粒表面的疫苗形式，主要是通過(guò)基因工程的方法使肽段或蛋白含有一個(gè)自由的Cys，使HBcAg在MIR區(qū)含有一個(gè)Lys，讓分別含有 2個(gè)氨基酸的多肽或蛋白通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)起來(lái)。這種方法可以消除衣殼裝配時(shí)的空間位阻，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的B細(xì)胞反應(yīng)。但是由于這種方法較重組技術(shù)而言：不可重復(fù)、生產(chǎn)困難、成本高、而且免疫原性相對(duì)較弱[14]，所以不是主流的設(shè)計(jì)方法。在基于 M2e的流感疫苗一項(xiàng)臨床前研究中，免疫原HBc/K77-M2e[15]就是通過(guò)這種方法構(gòu)建的。

2.3 臨床實(shí)驗(yàn)

目前較為成功的基于HBc所制備的重組疫苗主要是流感疫苗 ACAM-FLU-A?和瘧疾疫苗ICC-1132。

2.3.1 ACAM-FLU-ATM

ACAM-FLU-A?是由英國(guó) Acambis[23]公司研制的針對(duì)流感病毒所有A型株的疫苗，它以HBc氨基端 163個(gè)氨基酸為載體[24-25]，來(lái)遞送流感病毒離子通道蛋白M2的胞外結(jié)構(gòu)域M2e。2008年1月Acambis公司宣布已經(jīng)完成了Ⅰ期臨床研究，在79名志愿者身上所進(jìn)行的對(duì)疫苗的安全性和產(chǎn)生免疫反應(yīng)能力的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，ACAM-FLU-A?有很好的耐受性和免疫原性，所有的接種組中都能激發(fā)免疫反應(yīng)，ACAM-FLU-A?+ QS-21組的免疫反應(yīng)是最強(qiáng)烈的，這一組90%的受試對(duì)象都發(fā)生了血清型轉(zhuǎn)換。

2.3.2 ICC-1132

ICC-1132是由美國(guó)研制的針對(duì)瘧疾的疫苗，它主要是在HBc的MIR區(qū)的78位和79位氨基酸之間插入惡性瘧原蟲免疫顯性B細(xì)胞表位[(NANP)3]和一個(gè)HLA限制性CD4表位(NANPNVDPNANP)，并在HBc的149位氨基酸后融合一個(gè)通用的T細(xì)胞表位(T*)(326～345aa，NF54 isolate)[26]，ICC-1132于2008年完成了其在美國(guó)的Ⅰ期臨床的研究，在這之前，ICC-1132疫苗已經(jīng)在一些歐洲國(guó)家完成了相應(yīng)的臨床研究[27-29]。在51名18～45歲的健康的志愿者身上所開展的對(duì)ICC-1132+Al(OH)3的安全性，免疫原性和抗原性的臨床研究結(jié)果表明，這種候選的瘧疾疫苗ICC-1132在設(shè)計(jì)的所有劑量水平上都是安全的，而且有很好的耐受性，但是使用鋁佐劑時(shí)疫苗的免疫原性較弱，有待于與更有效的佐劑聯(lián)合以提高其免疫原性[26]。

3 其他

HBc VLPs近年來(lái)也被用于癌癥的研究，Zhang等[30]利用HBc VLPs展示了肝癌細(xì)胞(HCC)的單個(gè)或多個(gè)表位，4個(gè)HCC的表位MAGE-1(278～286aa)、MAGE-3(271～279aa)、AFP1(158～166aa)、AFP2(542～550aa)分別被融合或偶聯(lián)至截短的HBV核心基因的N端，雖然不是所有的重組質(zhì)粒都能表達(dá)融合蛋白，但是那些能夠表達(dá)的蛋白，即使是包涵體的形式，也能形成完整的“成熟”的VLPs。由E.coli表達(dá)的截短的HBc(1～144aa)融合蛋白也可以自我裝配成VLPs，在形態(tài)學(xué)和物理學(xué)性質(zhì)上都與野生型相似，而且這些VLPs即使是在6 mol/L尿素的條件下進(jìn)行變性純化，所得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)復(fù)性后也依然保持著生物學(xué)活性。Song等[31]發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞吞噬包裹有CpG的HBc VLPs可以增強(qiáng)CD8+誘導(dǎo)的胞毒T細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤效應(yīng)，可以有效地促進(jìn)基于 T細(xì)胞疫苗的發(fā)展。除了上述這些，截短的HBc還被用來(lái)構(gòu)建基于細(xì)胞因子肽 IL-4的治療性疫苗[32]，這種IL-4疫苗抑制了小鼠呼吸道的炎癥反應(yīng)，并為傳統(tǒng)的使用單克隆抗體或可溶性受體來(lái)阻斷過(guò)度產(chǎn)生的內(nèi)源性細(xì)胞因子的方法提供了新的思路。此外，Huleatt等[33]發(fā)現(xiàn)，TLR5的配體鞭毛蛋白與流感M2e蛋白的 4拷貝串聯(lián)結(jié)構(gòu)融合所得到的蛋白在不加佐劑和其他成分的情況下免疫小鼠，可以有效地激發(fā)M2e特異的抗體反應(yīng)，并且這種抗體反應(yīng)在數(shù)量和質(zhì)量上都優(yōu)于鋁佐劑參與的反應(yīng)，在0.3 mg/只小鼠的劑量時(shí)可以保護(hù)小鼠對(duì)抗流感A型病毒的致死性攻毒。這提示，將特異性TLR的配體或其一部分整合至HBc可能會(huì)提高HBc作為免疫載體在沒(méi)有佐劑或其他輔助刺激免疫反應(yīng)組分的存在下，激發(fā)抗原特異性反應(yīng)的能力。

4 結(jié)語(yǔ)

對(duì)HBc作為表位疫苗載體的應(yīng)用研究已經(jīng)開展了近30年，研究者在各個(gè)層次都進(jìn)行了探索，但是現(xiàn)有的以HBc為基礎(chǔ)的技術(shù)平臺(tái)還是有很多的理論和實(shí)踐的限制，其中最主要的就是“裝配(Assembly)”和“預(yù)存免疫(Preexisting immunity)”問(wèn)題[22,34]。研究者普遍承認(rèn)，在以HBc為疫苗平臺(tái)的研究中，只有不到50%的所選外源序列可以被成功地插入到 HBc，這種高失敗率被認(rèn)為是由于外源序列的插入所導(dǎo)致的裝配顆粒失去穩(wěn)定性所致[22]。對(duì)于預(yù)存免疫的問(wèn)題，因?yàn)镠Bc是來(lái)自于人的病原體，大多數(shù)感染過(guò)HBV的個(gè)體，在體液中都會(huì)存在相當(dāng)高效價(jià)的抗HBc抗體，這可能會(huì)降低疫苗的免疫原性[34]；基于 HBc的疫苗所激發(fā)的抗 HBc抗體可能會(huì)減弱以檢測(cè)抗 HBc抗體為主要指標(biāo)的診斷HBV感染的診斷方法的準(zhǔn)確性；最重要的是，在HBV慢性感染的個(gè)體中存在著 T細(xì)胞的免疫耐受[22]。然而令人興奮的是De Filette等[34]在小鼠實(shí)驗(yàn)中證明，預(yù)存的 HBc特異性抗體既不會(huì)影響 M2e-HBc顆粒免疫后誘導(dǎo)M2e特異性抗體的產(chǎn)生，也不會(huì)影響所激發(fā)的免疫反應(yīng)所帶來(lái)的保護(hù)效力，這提示，即使是在抗HBc陽(yáng)性的個(gè)體中，基于HBc的融合顆?？赡芤材軌蛘T導(dǎo)外源序列特異的保護(hù)性抗體，以及相應(yīng)的保護(hù)作用，當(dāng)然，相關(guān)的推測(cè)還有待臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。雖然需要解決的問(wèn)題還很多，但已經(jīng)有兩個(gè)基于 HBc的疫苗完成了Ⅰ期臨床的研究，這無(wú)疑給其他的研究者帶來(lái)很大鼓舞。

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Hepatitis B virus core protein as an epitope vaccine carrier:a review

Ying Yin, Junjie Xu, and Wei Chen
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China