李慧，張巍，申明霞，李偉國，劉艷麗，劉素芳，祁超

1 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079 2 華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

D1蛋白酶的克隆表達(dá)、純化、生物活性測定及多克隆抗體的制備

李慧1*，張巍1*，申明霞1，李偉國2，劉艷麗1，劉素芳2，祁超1

1 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079 2 華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

為了開發(fā)以D1蛋白酶作為靶標(biāo)的新型除草劑，需要對(duì)先導(dǎo)化合物的生物活性進(jìn)行檢測和篩選。從菠菜中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR擴(kuò)增了CtpA的基因，連接至表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行高效表達(dá)，通過降低IPTG和誘導(dǎo)溫度獲得了可溶性表達(dá)的重組蛋白酶。采用Ni-NTA親和層析和凝膠過濾柱層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果證實(shí)目的蛋白為含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前體蛋白羧基端24肽作為模擬底物，采用高效液相色譜法測定了其水解活性，結(jié)果表明活性可達(dá)1.10 nmol/(mg·min)，為文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)的15倍。純化后的CtpA蛋白免疫日本的長耳大白兔制備多克隆抗體，ELISA法測定其血清抗體的效價(jià)高達(dá)1：100 000。該結(jié)果為抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選和酶蛋白與化合物的作用機(jī)理研究提供了必要的基礎(chǔ)。

D1蛋白酶，表達(dá)，純化，生物活性，多克隆抗體

Abstract:Carboxyl-terminal processing protease of D1 protein(CtpA)catalyzes carboxyl terminal processing of the D1 protein of photosystem II, which is essential for the assembly of a manganese cluster and consequent light-mediated water oxidation.It is a target for the discovery of wide-spectrum herbicide.We amplified the CtpA gene from spinach cDNA with standard PCR methodand constructed it into pET-28a vector to generate a recombinant expression plasmid.Recombinant CtpA fusion protein with His-tag was expressed as soluble protein inEscherichia coliBL21(DE3)after induction with 0.1 mmol/L IPTG at 8°C for 72 h.We purified the CtpA protein with the Ni-NTA affinity chromatography and Superdex 75 gel filtration chromatography respectively, and verified the protein by SDS-PAGE and Western blotting with anti-his antibody.Hydrolysis activity of CtpA was assayed by HPLC method with a synthetic 24-mer oligopeptide corresponding to carboxyl terminal of precursor D1 protein, and gave a total activity of 1.10 nmol/(mg·min).We used the purified CtpA protein as antigen to immune rabbit for the production of polyclonal antibody, and prepared antibody with high specificity and sensitivity.The results obtained in this paper provided the feasibility of high-throughput screening of lead compounds for the protease as inhibitors and mechanism analysis of CtpA enzyme.

Keywords:carboxyl-terminal processing protease(CtpA), expression, purification, activity, polyclonal antibody

農(nóng)藥對(duì)于保證農(nóng)業(yè)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)增收具有重要意義，自20世紀(jì)40年代發(fā)展選擇性植物激素類除草劑以來，經(jīng)典的盆栽技術(shù)與噴灑篩選方法已經(jīng)獲得了270個(gè)品種、17種作用模式的除草劑。但是近年來，隨著植物對(duì)農(nóng)藥抗性的增加，以及社會(huì)和環(huán)境對(duì)農(nóng)藥品種安全性的要求，許多農(nóng)藥品種已經(jīng)被列入禁用名單，實(shí)際上在市場上使用的農(nóng)藥品種在相對(duì)地減少。因此，開發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好的新型農(nóng)藥顯得尤為迫切[1]。

D1蛋白是植物光合系統(tǒng)II中的一個(gè)組成亞基，起著連接電子供體和放氧復(fù)合體的作用，它是由質(zhì)體psbA基因編碼的大小約40 kDa的膜蛋白，在植物類囊體中以前體蛋白(pD1)的形式表達(dá)，需要在D1蛋白酶(Carboxyl-terminal processing protease，CtpA)的作用下剪切掉其羧基端延伸的肽段之后成為成熟的 D1蛋白(mD1)。D1蛋白酶是由葉綠體核ctpA基因編碼的含有389個(gè)氨基酸殘基的單亞基蛋白，大小約為45 kDa，主要酶切D1前體蛋白中C端延伸的肽段，使之轉(zhuǎn)變?yōu)閙D1[2-3]，進(jìn)一步用于光合系統(tǒng)II中錳簇合物的組裝，具有維持光合系統(tǒng)II損傷-修復(fù)循環(huán)過程的重要作用[4]，該酶切過程是植物進(jìn)行光合作用必不可少的步驟。集胞藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp和斜生柵藻Scenedesmus obliquus在ctpA基因敲除后均呈現(xiàn)出非光合自養(yǎng)的表型[5-7]，證實(shí) D1蛋白酶也是植物光合作用鏈中的重要組成部分，因此D1蛋白酶被認(rèn)為是一個(gè)新型優(yōu)異的廣譜除草劑作用靶標(biāo)[8]。由于D1蛋白酶在植物中的含量只有 D1蛋白的 1%左右，與當(dāng)前廣泛使用的以抑制D1蛋白為靶標(biāo)的除草劑(如西瑪津、阿拉特津、敵草隆等)相比，開發(fā)以D1蛋白酶作為靶標(biāo)的除草劑將會(huì)使得農(nóng)藥的施用量大幅度減少，對(duì)環(huán)境和人類的毒副作用也將會(huì)大為降低，可望成為新一代的農(nóng)藥品種。

本研究根據(jù)開發(fā)新型農(nóng)藥品種的實(shí)際需要，利用基因工程方法將 CtpA基因定向克隆至原核表達(dá)載體 pET-28a中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)了D1蛋白酶的可溶性融合表達(dá)，采用 Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組蛋白酶進(jìn)行了純化并測定了其生物活性，同時(shí)用純化的蛋白制備多克隆抗體，為D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選和蛋白酶與化合物的作用機(jī)理研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒 pET-28a和大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD 18-T Vector、DNA限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、M-MLV TRase cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit、DNA Marker和低分子量蛋白Marker均購自大連TaKaRa生物工程有限公司。酵母提取物(Yeast extract)和胰化蛋白胨(Tryptone)購自O(shè)xoid公司。氨芐青霉素(Amp)、卡那青霉素(Kana)、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、二硫蘇糖醇(DTT)、三氟乙酸(TFA)、弗氏完全及不完全佐劑均購自Sigma公司。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)購自Amresco公司。乙腈(色譜純)購自 Tedia公司。Ni-NTA親和柱、HiLoad 16/60 Superdex 75、?KTA purifier 100蛋白純化系統(tǒng)為GEHealthcare公司產(chǎn)品。Anti-His antibody購自天根生化科技有限公司。BCA Protein Assay Kit為美國Pierce公司產(chǎn)品。PCR引物及重組質(zhì)粒測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。Hypersil BDS C8(5 μm，0.46 cm × 15 cm)反相柱購自大連依利特分析儀器有限公司。9肽(AIEAPSTNG)和 24肽(VMHERNAHNFPLDLA↓AIE APSTNG，其中↓為酶切位點(diǎn))均由上海吉爾生化有限公司采用固相合成法合成，并經(jīng)過高效液相色譜和質(zhì)譜測定確認(rèn)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)動(dòng)物日本長耳兔2只，體重1.5～2.0 kg，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心下屬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 菠菜總RNA的提取和cDNA的合成

參照植物RNA的提取方法，采用TRIzol法從菠菜中提取總RNA，得到白色的RNA沉淀，用DEPC水溶解。取5 μL提取的總RNA經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。按照TaKaRa公司提供的cDNA合成試劑盒說明，先合成 cDNA第一鏈，再合成cDNA第二鏈，最后對(duì)合成的cDNA進(jìn)行精制，取5 μL合成的 cDNA經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后?20℃保存。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)、合成與PCR擴(kuò)增

根據(jù) GenBank中獲得的 CtpA 基因序列(Accession No.D50585)，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，序列如下：CtpA-1：5′-GAGAGCTAGC CTTTCTGAGGAGA ATCGA-3′，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶 Nhe I的識(shí)別序列；CtpA-2：5′-GTGTCTCGAGTCTTGAGA AAAGAGTTGTAC-3′，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Xho I的識(shí)別序列。以合成的cDNA為模板，CtpA-1、CtpA-2為引物，擴(kuò)增CtpA目的基因。擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，采用膠回收試劑盒回收目的基因。

1.2.3 克隆載體pMD18-T-CtpA的構(gòu)建及序列測定

按照pMD18-T Vector試劑盒說明書要求，取2 μL回收后的CtpA基因與1 μL pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α中，通過藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用限制性內(nèi)切酶 Nhe I和 Xho I酶切重組質(zhì)粒 pMD18-T-CtpA，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將鑒定結(jié)果正確的陽性菌和質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 表達(dá)載體pET-28a-CtpA的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I將CtpA基因從重組質(zhì)粒 pMD18-T-CtpA上切下，再用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pET-28a，將CtpA片段和pET-28a酶切產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，分別取4 μL CtpA基因與2 μL載體 pET-28a，用約1 μL T4 DNA連接酶(350 U/μL)于16℃連接過夜，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，接種于含50 mg/mL卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)，次日挑取單克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I酶切重組質(zhì)粒pET-28a-CtpA，同時(shí)以該質(zhì)粒為模板，合成的CtpA-1和CtpA-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶切和PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.5 CtpA的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

從卡那平板上挑取經(jīng)酶切和PCR鑒定正確的單菌落，接種于10 mL含有50 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至A600為0.8左右，吸取2 mL培養(yǎng)物作為未誘導(dǎo)的樣品，在剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，離心收集菌體，超聲波破碎后采用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況。

為了大量表達(dá)和純化蛋白酶，挑取單菌落接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照1∶100的比例接種于400 mL新配的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至A600為0.8左右，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，然后在8℃、250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72 h。誘導(dǎo)后的菌液在4℃、8000 r/min 離心20 min，收集菌體。按照每克濕菌體加入10 mL柱平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl)的量充分懸浮菌體，在冰浴條件下超聲破碎菌體(300 W，工作5 s，間歇3 s，共99次)，然后4℃、12 000 r/min 離心40 min，分離上清液和沉淀。將上清液加至預(yù)先用平衡緩沖液充分平衡好的Ni-NTA親和層析柱(1 mL)，并用平衡緩沖液淋洗10個(gè)柱體積，然后換用含不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫 CtpA蛋白，收集各組分，并將各組分進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析。采用超濾法(Millipore，截留分子量 3000)對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行濃縮，濃縮后的樣品采用Superdex 75凝膠過濾層析柱(HiLoad 16/60，GE)進(jìn)一步純化，采用緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl)洗脫，流速為1.0 mL/min，通過280 nm處的光吸收進(jìn)行檢測，收集各組分，12% SDS-PAGE電泳分析。蛋白濃度采用BCA法測定。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析

蛋白Western 印跡分析參照GE Healthcare Life Sciences全濕電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)TE22操作手冊進(jìn)行。將濃縮的蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，400 mA電流強(qiáng)度水浴10℃將CtpA融合蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，以含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液4℃封閉過夜，1×PBS、0.1%吐溫 20洗滌 3次，然后與anti-His抗體37℃反應(yīng)1 h，用1×PBS、0.1%吐溫20洗滌2次，每次1 h，再與1:20 000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體在 37℃溫育 1 h，1×PBS、0.1%吐溫20洗滌2次，每次1 h。最后以沉淀型單組分TMB底物溶液顯色。

1.2.7 D1蛋白酶的活性測定

純化后的D1蛋白酶活性測定以合成的D1蛋白前體羧基端24 肽作為模擬底物，采用 1100高效液相色譜檢測系統(tǒng)(Aglient)和Hypersil BDS C8(5 μm，0.46 cm×15 cm)反相柱對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測[9]。取 21 μL D1 蛋白酶(0.657 mg/mL)和3 μL底物P-24(5 mmol/L)加入至1.5 mL EP管中，并用緩沖液(50 mmol/L HEPES，pH 7.7，100 mmol/L NaCl，100 ml/L甘油，0.5 g/L曲拉通X-100)補(bǔ)足至 73 μL，25℃恒溫反應(yīng) 6 h后加入 27 μL TFA(0.1 mol/L)中止反應(yīng)。10 000 r/min離心10 min，取20 μL上清液進(jìn)行高效液相色譜測定。色譜分離條件：以水(含 0.1%TFA)為洗脫水相，乙腈(含0.065%TFA)為洗脫有機(jī)相，0～1.00 min用10%有機(jī)相平衡反相柱，1.01～16.00 min采用有機(jī)相進(jìn)行體線性梯度(10%～40%)洗脫，檢測波長為220 nm。

1.2.8 重組CtpA血清多克隆抗體的制備和鑒定

免疫前，從耳緣靜脈少量取血，用作陰性對(duì)照。取1.3 mg重組CtpA蛋白與2 mL弗氏完全佐劑混合成油包水的乳劑，免疫日本長耳大白兔。14 d后取1 mg 重組蛋白與2 mL弗氏不完全佐劑混合成油包水的乳劑加強(qiáng)免疫，每兩周1 次。第3 次加強(qiáng)免疫后，從耳緣靜脈少量取血，ELISA檢測血清效價(jià)。效價(jià)合格后，頸動(dòng)脈放血，4℃放置過夜，收集血清，分裝凍存。

2 結(jié)果

2.1 菠菜總RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取得到菠菜的總RNA后，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1A所示。在電泳圖中顯示出明顯的28S rRNA和18S rRNA條帶，無拖尾，且28S rRNA與18S rRNA亮度比接近2∶1的比例，說明總 RNA的完整性良好，可用于cDNA的合成。以總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結(jié)果如圖1B所示。電泳圖中顯示cDNA亮度良好，約為Marker的3倍，可用于目的基因的PCR擴(kuò)增。

2.2 PCR擴(kuò)增CtpA目的基因

以合成的cDNA為模板，設(shè)計(jì)的短鏈DNA為引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物大小約為1200 bp，與CtpA基因的理論編碼序列大小相符合。

圖1 菠菜總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳(A)和cDNA的瓊脂糖凝膠電泳(B)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of spinach total RNA(A)and spinach cDNA(B).(A)1?3: RNA.(B)1, 2: cDNA;3: 10 000 bp ladder DNA marker.

圖2 CtpA目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification ofCtpAgene encoding region.1:PCR product; 2: 100 bp ladder DNA marker.

2.3 重組質(zhì)粒pET-28a-CtpA的構(gòu)建和鑒定

為了便于構(gòu)建重組質(zhì)粒，將回收后的PCR產(chǎn)物先與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選得到含有目的基因的陽性菌。采用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I酶切克隆載體pMD18-T-CtpA，得到目的基因片段，然后與同樣經(jīng)過Nhe I和Xho I酶切后的表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單菌落提取質(zhì)粒，采用Nhe I和Xho I進(jìn)行雙酶切進(jìn)行鑒定，同時(shí)以此質(zhì)粒為模板，采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果如圖3所示。由1%瓊脂糖凝膠電泳圖中可以看出，以重組后的質(zhì)粒為模板可以擴(kuò)增出約1200 bp的產(chǎn)物，酶切后的質(zhì)粒在相同位置也出現(xiàn)大小一致的片段，說明目的基因片段與表達(dá)載體連接正確，表達(dá)載體 pET-28a-CtpA的構(gòu)建是成功的。DNA序列測定結(jié)果證實(shí)：擴(kuò)增序列與菠菜的D1蛋白酶DNA序列一致。

圖3 表達(dá)載體pET-28a-CtpA的PCR和雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pET-28a-CtpA by PCR and enzyme digestion.M: 100 bp ladder DNA marker; 1: PCR product of pET-28a-CtpA; 2: pET-28a-CtpA digested withNheI andXhoI.

2.4 重組CtpA蛋白的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒 pET-28a-CtpA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，在37℃條件下經(jīng)0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，與對(duì)照菌相比，在45 kDa位置出現(xiàn)了一條明顯的顯色帶，結(jié)果如4A所示。由圖中可以看出，誘導(dǎo)表達(dá)的重組質(zhì)粒主要以包涵體的形式表達(dá)，以可溶性形式表達(dá)的重組蛋白較少。而未誘導(dǎo)的質(zhì)粒在相同位置也有表達(dá)，但目的蛋白的表達(dá)量，特別是包涵體的表達(dá)量要明顯少于誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒。誘導(dǎo)表達(dá)獲得了高表達(dá)量的目的蛋白，但為了獲得可溶性表達(dá)的目的蛋白，比較了IPTG濃度以及誘導(dǎo)溫度對(duì)CtpA蛋白高效可溶性表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)降低誘導(dǎo)劑IPTG的用量以及降低誘導(dǎo)溫度后，包涵體形式的目的蛋白明顯減少，而親和層析結(jié)果表明可溶性形式的目的蛋白逐漸增多，尤其是降低誘導(dǎo)溫度后，對(duì)改善蛋白酶的可溶性表達(dá)效果更為明顯(圖4B)，經(jīng)過優(yōu)化后確定的IPTG用量為0.1 mmol/L，最佳的誘導(dǎo)溫度為8℃。

為了純化可溶性表達(dá)的重組蛋白，將陽性單菌落接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，8℃、250 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h。獲得的菌體超聲破碎，上清液通過 Ni-NTA親和層析柱純化，并用含不同濃度咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白，所得結(jié)果如圖5所示。從電泳圖中可以看出經(jīng)過8℃誘導(dǎo)表達(dá)72 h后的菌液，上清中的目的蛋白明顯增多，表達(dá)后的蛋白與親和柱的結(jié)合較牢固，在咪唑濃度為150 mmol/L后才得以被洗脫，合并洗脫后的目的蛋白，再經(jīng)過Superdex 75 凝膠過濾柱層析進(jìn)一步純化，用BandScan5.0軟件分析，計(jì)算得到的重組蛋白酶純度達(dá)到94.9%(泳道7)。BCA法測定結(jié)果表明重組蛋白的表達(dá)量約為5～6 mg/L。采用anti-His 抗體進(jìn)行Western blotting印跡分析證實(shí)純化后的蛋白為帶有His-tag的融合蛋白(泳道10)。

2.5 重組CtpA的生物活性測定

圖4 重組質(zhì)粒的表達(dá)(37℃)(A)和不同溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響(B)Fig.4 Expression of recombinant CtpA at 37°C(A)and effect of induction temperature on the expression of CtpA(B).(A)1:protein marker; 2: induced supernatant; 3: induced precipitate; 4: controlled supernatant; 5: controlled precipitate.(B)1: protein marker; 2: induced supernatant at 16°C; 3: induced precipitate at 16°C; 4: induced supernatant at 37°C; 5: induced precipitate at 37°C;6: induced supernatant at 8°C; 7: induced precipitate at 8°C.

圖5 采用 Ni-NTA親和層析柱純化重組 CtpA蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.5 12% SDS-PAGE analysis of the recombinant CtpA purified by Ni-NTA affinity chromatography column.M: protein marker; 1: induced supernatant; 2: flow-through sample; 3: elution with binding buffer; 4: elution with 50 mmol/L imidazole; 5:elution with 100 mmol/L imidazole; 6: elution with 150 mmol/L imidazole; 7: elution with 200 mmol/L imidazole; 8: elution with 500 mmol/L imidazole; 9: elution with 1 mol/L imidazole; 10:Western blotting image.

以合成的D1前體蛋白羧基端延伸的24肽作為模擬底物，測定了蛋白酶的生物活性。由于蛋白酶能夠?qū)?24肽水解生成 9肽和 15肽，因此采用 C8反相柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離和分析，圖6是水解產(chǎn)物在HPLC系統(tǒng)上的色譜分離圖。由圖中可以看到，24肽的吸收峰在水解反應(yīng)后明顯降低，同時(shí)在5.6 min處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的吸收峰，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照確認(rèn)為9肽，此外在11.5 min位置也出現(xiàn)了一個(gè)小的吸收峰，可能為生成的15肽。根據(jù)化合物的吸收峰面積和對(duì)應(yīng)的24肽濃度可測得重組D1蛋白酶的活性為 1.10 nmol/(mg·min)。

圖6 HPLC對(duì)重組蛋白酶水解產(chǎn)物的分離和檢測Fig.6 HPLC separation and determination of CtpA hydrolysis products.

2.6 重組CtpA多克隆抗體效價(jià)的檢測

ELISA法檢測重組 CtpA蛋白血清效價(jià)多克隆抗體，空白對(duì)照為 PBS，陰性對(duì)照為未免疫的長耳兔血清，樣品為免疫后的長耳兔血清。由于未免疫的長耳兔血清沒有產(chǎn)生顏色反應(yīng)，而免疫的長耳兔血清有顏色反應(yīng)，說明免疫后的長耳兔產(chǎn)生了針對(duì)本實(shí)驗(yàn)抗原的抗體。ELISA結(jié)果表明從 l∶10到1∶100 000的各個(gè)稀釋度的抗體與重組的 CtpA蛋白有反應(yīng)，抗體效價(jià)達(dá)1∶100 000(表1)。

表1 ELISA測定重組CtpA蛋白血清抗體效價(jià)Table 1 Potency of serum antibody against recombinant CtpA analyzed by ELISA

3 討論

由于 D1蛋白酶在植物體中剪切 D1前體蛋白(pD1)中C端延伸的多肽(8～16個(gè)氨基酸殘基)，使之成為成熟的D1蛋白，進(jìn)一步用于光合系統(tǒng)II中錳簇合物的組裝，具有維持光合系統(tǒng)II的損傷-修復(fù)循環(huán)過程的重要作用，因此近年來引起了人們的廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是一個(gè)新型優(yōu)異的廣譜除草劑作用靶標(biāo)，國內(nèi)外部分學(xué)者已經(jīng)開始進(jìn)行針對(duì)該蛋白酶的藥物分子設(shè)計(jì)和合成工作[10-12]。為了對(duì)合成的抑制劑先導(dǎo)化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)和篩選，需要進(jìn)行必要的酶活性分析。雖然文獻(xiàn)先后報(bào)道了從斜生柵藻以及菠菜葉綠體中提取D1蛋白酶的方法，包括類囊體的提取、超聲破碎、羥基磷灰石吸附層析、陰離子交換層析、分子篩層析等方法[7-8,13]，但是由于D1蛋白酶在天然蛋白中的含量較低(如菠菜中的 D1蛋白酶僅占可溶蛋白的0.06%)，從生物組織中提取天然蛋白酶不僅操作繁瑣、純化周期長，而且所能提取得到的酶蛋白總量也有限，遠(yuǎn)不能滿足化合物的高通量篩選要求，而采用基因工程方法獲得可溶性表達(dá)的重組蛋白則可以解決這些難題。Inagaki等[14]和 Fabbri等[8]先后采用 pET 15b(+)和 Pet-30a載體克隆表達(dá)了菠菜的 CtpA蛋白，Liao等則表達(dá)了斜生柵藻的 CtpA蛋白[15]，但均只獲得了包涵體形式的蛋白，需要進(jìn)行變復(fù)性處理方能獲得具有部分活性的酶蛋白。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)開發(fā)以D1蛋白酶為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥的實(shí)際需要，從菠菜中提取總RNA和合成cDNA，并用PCR擴(kuò)增CtpA的全長序列基因，將其分別與 pMD18-T載體和 pET-28a載體進(jìn)行連接，構(gòu)建了CtpA蛋白的重組融合表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)。雖然融合蛋白也主要以包涵體形式表達(dá)，但是通過降低誘導(dǎo)劑的使用量和降低表達(dá)溫度等條件獲得了可溶性的重組蛋白酶，并采用親和層析和凝膠過濾層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，Western印跡結(jié)果證實(shí)純化后的蛋白為帶有His-tag的重組蛋白。

D1蛋白由質(zhì)體psbA基因編碼，在植物類囊體中以前體蛋白(pD1)的形式表達(dá)。對(duì)43種psbA基因的序列比對(duì)分析表明，D1蛋白雖然在C端的延伸序列長度不一，但是它未剪切的序列卻高度保守[16]。D1蛋白酶主要酶切Ala-Ala或Ala-Ser之間的肽鍵，例如菠菜 D1蛋白酶的剪切作用位點(diǎn)是 pD1中Ala-344和 Ala-345之間的肽鍵[13]。Taguchi等合成了不同長度含有 pD1剪切位點(diǎn)附近保守區(qū)氨基酸序列的多肽化合物，系統(tǒng)比較了剪切位點(diǎn)附近各保守氨基酸殘基對(duì)酶分子與底物識(shí)別影響的一般規(guī)律[9,17]，發(fā)現(xiàn)作為模擬底物，合成小肽的長度至少需要11個(gè)殘基以上才能檢測到蛋白酶的水解活性，當(dāng)多肽長度在 19個(gè)殘基以上時(shí)對(duì)蛋白酶的酶學(xué)常數(shù)(Km和 Vmax)沒有明顯影響。以 Gly、Val、Pro殘基取代 Ala殘基后，蛋白酶的活性分別下降至50%、30%、0%，而以 Cys、Phe和 Ser殘基取代Ala后，對(duì)蛋白酶的水解活性沒有明顯影響，表明蛋白酶對(duì)水解底物具有一定的選擇性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用合成的pD1羧基端24肽作為模擬底物，測定了重組D1蛋白酶的生物活性，發(fā)現(xiàn)蛋白酶可以將24肽水解生成9肽和15肽，其活性可達(dá)1.10 nmol/(mg·min)，是文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)的 15倍[8]。Fabbri等采用鹽酸胍對(duì)表達(dá)后的包涵體蛋白進(jìn)行變性處理，再通過柱層析方法對(duì)蛋白酶進(jìn)行復(fù)性，所得蛋白酶的活性僅為0.07 nmol/(mg·min)[8]。由于得到的為可溶性形式表達(dá)的蛋白酶，無需變復(fù)性處理，因此其活性要高于Fabbri等的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)還成功制備了 CtpA蛋白高效價(jià)的特異性多克隆抗體，對(duì)進(jìn)一步研究 CtpA蛋白的表達(dá)模式和植物CtpA突變體的研究都有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化表達(dá)，獲得了具有較高生物活性的重組蛋白酶并成功地制備了高效價(jià)的多克隆抗體，為下一步的抑制劑先導(dǎo)化合物篩選以及化合物與酶蛋白的作用機(jī)理研究提供了必要的基礎(chǔ)，目前相關(guān)的研究工作正在進(jìn)行中。

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Cloning, expression, purification of spinach carboxyl-terminal processing protease of D1 protein with hydrolysis activity and preparation of polyclonal antibody

Hui Li1*, Wei Zhang1*, Mingxia Sheng1, Weiguo Li2, Yanli Liu1, Sufang Liu2, and Chao Qi1
1 Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation & Integrative Biology, College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China 2 Key Laboratory of Pesticide & Chemical Biology, Ministry of Education, College of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079, China

Received:November 8, 2009;Accepted:February 2, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.20702017, 30670429), Key Project of Chinese Ministry of Education(No.107082),Natural Science Foundation of Hubei Province of China(No.2007ABA141).*These authors contributed equally to this study.

Corresponding author:Weiguo Li.E-mail: weiguoli@mail.ccnu.edu.cn Chao Qi.Tel: +86-27-67862703; E-mail: qichao@mail.ccnu.edu.cn國家自然科學(xué)基金(Nos.20702017, 30670429), 教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.107082)，湖北省自然科學(xué)基金(No.2007ABA141)資助。